Введение к работе
Актуальность проблемы. Патологические митозы, связанные с нарушением в организации митотического аппарата, описаны как в нормальных тканях при дифференцировке различных клеток, так и при патологических процессах, таких как воспаление, вирусная инфекция, опухолевый рост, а также при апоптозе. Кроме того, при культивировании клеток in vitro нередко наблюдается спонтанное появление патологических митозов, что представляет определенные проблемы из-за широкого использования различных клеточных и тканевых культур в качестве моделей для фундаментальных исследований и в биотехнологическом производстве.
Известные на сегодняшний день факты, позволяют утверждать, что появление патологического митоза, связанного с формированием аномального веретена деления – важное звено в цепи событий, ведущих к переключению клеточной программы с нормальной пролиферации на опухолевую трансформацию или апоптоз (Brinkley, 2001; Castedo et al., 2004). На настоящий момент, особенности функционирования митотического аппарата в ходе патологического митоза изучены недостаточно, и сравнительное исследование структурной и функциональной организации системы микротрубочек (МТ) и центросомы при биполярном и многополюсном митозах имеет научный и практический интерес.
Одной из причин различий в функционировании системы МТ в биполярном или многополюсном митозах могут являться посттрансляционные модификации тубулина (ПТМ). Известно, что МТ с различным набором ПТМ их тубулиновых субъединиц, различаются по скорости и степени обновления (Rosenbaum, 2000). Но механизм действия модификаций тубулина на функции МТ пока неизвестен. Однако установлено, что ПТМ могут влиять на динамику МТ через связывание МТ с многочисленными белками, ассоциированными с МТ (Rosenbaum, 2000).
В то же время, ПТМ тубулина в составе МТ центриолей (Piperno et al., 1987; Bre et al., 1987; Bobinnec et al., 1998b) могут влиять на взаимодействие центриолей в составе центросомы с белками перицентриолярного матрикса. Молекулярные механизмы, составляющие суть такого взаимодействия также изучены недостаточно. Однако имеются данные, касающиеся особенностей организации центросомы в ходе многополюсного митоза по сравнению со стандартным биполярным делением, которые позволяют предполагать, что такое взаимодействие может лежать в основе регуляции митоза (Онищенко, 1993).
Таким образом, выявление особенностей функционирования МТ при патологическом митозе, в частности, путем анализа ПТМ тубулина в составе митотического веретена и центриолей, является актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей распределения посттрансляционно-модифицированого тубулина в составе центриолярных и цитоплазматических микротрубочек в ходе стандартного и многополюсного митоза в нормальных и трансформированных клетках, а также в клетках при индукции апоптоза.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать особенности распределения ацетилированного и тирозинированного -тубулина в цитоплазматических и центриолярных микротрубочках в интерфазе и в ходе двухполюсного и многополюсного митоза диплоидных клеток 3Т3 и туморогенных гетероплоидных клеток SV40-3Т3 методом иммунохимического окрашивания.
-
Изучить динамику митотического цикла и организацию многополюсного митотического аппарата при индукции апоптоза этопозидом в культуре клеток СHO-K1 методами иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии.
-
Сравнить особенности распределения ацетилированного и тирозинированного -тубулина в цитоплазматических и центриолярных микротрубочках в ходе двухполюсного и многополюсного митоза клеток СHO-K1 до и после обработки этопозидом методом иммунохимического окрашивания.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы были отработаны методические приемы, позволяющие на электронно-микроскопическом уровне охарактеризовать распределение ПТМ тубулина в МТ центриолярного цилиндра. Для электронно-микроскопического исследования был использован пероксидазный метод иммуноокрашивания, позволяющий исключить проблемы, связанные с проникновением антител, меченных коллоидным золотом, в центросому клеток in situ. Данный метод дал возможность провести полуколичественную оценку уровня связывания антител с МТ, ориентируясь на различия в интенсивности окрашивания. Данная работа впервые выявила различия в организации двухполюсного митотического веретена в диплоидной и туморогенной гетероплоидной клеточных линиях. Показано, что характер ацетилирования и тирозинирования -тубулина в составе МТ центриолей и веретена подвергается закономерным и стабильным изменениям в ходе митоза в клетках 3Т3, в отличие от трансформированных клеток SV40-3Т3. Впервые установлено, что различия в характере ацетилирования и тирозинирования МТ веретена и центриолей наблюдаются между клетками с двухполюсным и многополюсным аппаратом деления, формирующимся в предапоптотический период в культуре СНО-К1, обработанной противоопухолевым препаратом этопозидом. При формировании многополюсных митотических веретен наблюдается гетерогенность иммуноокрашивания микротрубочек полюсов одного и того же веретена антителами к тирозинированному -тубулину, что также сопровождается вариабельностью в структурной организации полюсов. Полученные данные указывают на то, что формирование митотического веретена регулируется по-разному при реализации различных клеточных программ, таких как дифференцировка, опухолевая трансформация, апоптоз, и непосредственное участие в этой регуляции, вероятно, принимает ПТМ -тубулина в составе МТ центриолярного цилиндра и митотического веретена.
Таким образом, полученные результаты расширяют современные представления о цепи событий, ведущих к переключению клеточной программы с нормальной пролиферации на опухолевую трансформацию или апоптоз.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 6-м Международном конгрессе по клеточной биологии и 36-й Ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Сан-Франциско, декабрь, 1996); на 40-й Ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Сан-Франциско, декабрь, 2000); межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы три статьи, два тезисных сообщения, две статьи находятся в печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 125 страницах и включает 18 рисунков, 1 таблицу и список литературы, содержащий 267 источников.
