Содержание к диссертации
Введение 6
Обзор литературы 9
Микротрубочки 9
Строение микротрубочек 9
Тубулин способен полимеризоваться in vitro 10
Полярность микротрубочек 11
Динамическая нестабильность 11
Трэдмиллинг 12
Описание динамики отдельной микротрубочки и сети цитоплазматических
микротрубочек в целом 13
Стабильные микротрубочки 15
Белки, ассоциированные с микротрубочками 15
MAP белки 15
Моторные белки 16
Минус-концевые белки 17
Плюс-концевые белки 19
Актин 21
Актин спонтанно полимеризуется in vitro 22
При образовании актинового филамента происходит гидролиз АТФ 22
Актиновый филамент обладает полярностью 23
Белки, взаимодействующие с мономерным актином 24
Белки, взаимодействующие с актиновыми филаментами 24
Миозины 25
Образование новых филаментов 26
Полимеризация актина приводит к движению клеточной мембраны 28
Актин-связывающие белки in vivo 28
Актиновые структуры в клетке 29
Шю-белки 30
Общие свойства микротрубочек и актина 31
Взаимодействия микротрубочек и актина 32
Регуляторные взаимодействия 32
Структурные взаимодействия 33
Микротрубочки и актиновые филаменты в районе контактов 34
Внутриклеточный транспорт 35
Эндотелий 37
Тромбин 37
Гетеротримерные G-белки 38
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина 39
Цель и задачи работы 41
Материалы и методы 42
Культура клеток 42
Трансфекция 42
Экспериментальные воздействия 42
Иммунофлюоресцентное окрашивание 43
Получение и обработка цифровых изображений 44
Количественная оценка системы актиновых филаментов и микротрубочек 45
Анализ системы микротрубочек в клетках Vero 46
Измерение длин микротрубочек в цитоплазме клеток Vero 46
Анализ интенсивности флуоресценции тубулина в ламелле клеток Vero 47
Моделирование системы микротрубочек 49
Статистическая обработка данных и построение графиков 50
Результаты 51
Актин и микротрубочки в нативных клетках эндотелия человека 51
Актин 51
Микротрубочки 53
Ацетилированные микротрубочки 53
Тирозилированные микротрубочки 54
Действие наномолярных доз нокодазола на цитоскелет клеток эндотелия 54
Действие нокодазола в концентрации 100 нМ 55
Действие нокодазола в концентрации 200 нМ 57
Действие тромбина на цитоскелет клеток легочного эндотелия человека 59
Актиновые филаменты при действии тромбина 59
Площадь клеток при действии тромбина 62
Микротрубочки при действии тромбина 62
Сравнение действия нокодазола и тромбина на цитоскелет клеток эндотелия 63
Гиперэкспрессия а-субъединиц белков G12/13, Gi и Gq приводит к
деполимеризации микротрубочек 64
Ингибирование Gi белка приводит к снижению эффекта тромбина на стресс-
фибриллы и микротрубочки 68
Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в
присутствии активатора аденилатциклаз 70
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии форсколина 70
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в
присутствии форсколина 72
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в
присутствии форсколина 73
Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в
присутствии ингибитора Rho-киназ 74
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии ингибитора Rho-
киназы Y-27632 74
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в 75
присутствии Y-27632
Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в 78
присутствии Y-27632
Анализ системы микротрубочек в цитоплазме клетки по интенсивности 80
флуоресценции тубулина
Моделирование системы микротрубочек 80
Экспериментальная проверка модели 83
Оценка состояния системы микротрубочек в норме и при действии
тромбина с помощью измерения интенсивности флуоресценции в клетках
эндотелия 88
Обсуждение результатов 90
Взаимодействия микротрубочек и актина в клетках эндотелия 90
Участие микротрубочек в передачи сигнала от тромбина к актиновому
цитоскелету 95
Новые подходы к изучению системы микротрубочек в культивируемых
клетках 101
Выводы 108
Список литературы 109
Введение к работе
Взаимодействия микротрубочек и актина лежат в основе многих фундаментальных клеточных процессов, таких как клеточная подвижность (Vasiliev et al., 1970; Wittmann, Warerman-Storer, 2001; Small et al., 2002; Salmon et al., 2002), деление клетки (Caman et al., 2000; Glotzer, 2001; Kuriyama et al., 2002), движение кортикального тока клетки (Canman, Bement, 1997; Mandato et al., 2000).
В литературе выделяют несколько типов взаимодействий между микротрубочками и актином. Так, системы микротрубочек и актиновых филаментов контролируют одна другую непрямым образом, действуя через сигнальные каскады. Примером тому является белок RhoA, функционирование которого приводит к формированию стресс фибрилл, а также к избирательной стабилизации микротрубочек (Cook et al., 1998). Кроме регуляторных взаимодействий между двумя системами существуют структурные взаимодействия, то есть микротрубочки и актиновые филаменты связаны при помощи кросс-линкерных белков (Svitkina et al., 1996; Fuchs, Karakesisoglou, 2001; Rodriguez et al., 2003). В литературе существуют данные, что структурные взаимосвязи между микротрубочками и актиновыми филаментами также могут являться и регуляторными (Fukata et al., 2002).
В общем, принцип взаимодействия систем микротрубочек и актиновых филаментов можно назвать функциональной кооперацией. Разрушение одной системы филаментов оказывает сильный эффект на организацию другой системы (Danowski, 1989; Bershadsky et al., 1996; Enomoto, 1996; Cook et al., 1998). Выявлены структурные связи между микротрубочками и актиновыми филаментами. Факторы, выявленные как белки, ассоциированные с микротрубочками, могут связывать актиновые филаменты и микротрубочки in vitro и in vivo. Таким образом, системы микротрубочек и актиновых филаментов связаны как структурно, так и функционально, и эти взаимодействия используются эндотелиальными клетками для поддержания ими свойства эндотелиального барьера (Lee, Gotleib, 2003).
Недавно было показано, что поддержание барьерной функции клетками эндотелия зависит от координированной работы двух компонентов цитоскелета этих клеток - микротрубочек и актиновых филаментов (Verin et al., 2001; Petrache et al., 2003; Birukova et al., 2004). За последнее время было накоплено значительное количество данных о том, что действие воспалительных медиаторов (в том числе тромбина) приводит к реорганизации актинового цитоскелета в клетках эндотелия.
Тромбин, действуя на клетки через специфический рецептор, запускает каскады внутриклеточных реакций, что приводит к увеличению проницаемости эндотелиального барьера, сопровождаемому более интенсивным фосфорилированием легких цепей миозина и формированием дополнительных стресс-фибрилл в эндотелиальных клетках (Garcia et al 1995, 1996; Verin et al., 2000). С другой стороны, усиление проницаемости легочного эндотелия и увеличение уровня фосфорилирования легких цепей миозина происходят в ответ на деполимеризацию микротрубочек нокодазолом (Verin et al., 2001). Связав воедино эти факты, можно предполагать, что воздействие тромбина может вызывать реакцию микротрубочек, аналогичную той, что вызывает экспериментальное воздействие нокодазола. Проверяя это предположение, в данной работе мы пытались понять, каким образом связаны эти два процесса - действие тромбина и разборка микротрубочек - в клетках эндотелия, сохранивших после выделения в культуру свое функциональное свойство.
Появление новых данных во многом было связано с прогрессом в биологических методах исследования, однако, несмотря на появление новых методических подходов, многие вопросы взаимосвязи микротрубочек и актиновых филаментов в настоящее время остаются открытыми. Поэтому в нашей работе и исследовалась взаимосвязь актина и микротрубочек, а в качестве модели использовались культивируемые эндотелиальные клетки.
В работе было показано, тромбин индуцирует дисфункцию эндотелия, вызывая в первую очередь уменьшение количества микротрубочек на периферии клетки, и затем образование стресс-фибрилл. Действие
нокодазола в концентрации 200 нМ, разрушая микротрубочки более существенно, также приводит к образованию стресс-фибрилл. Гиперэкспрессия конститутивно активных а-субъединиц регуляторных белков G12, G13, Gi2 и Gq ведет к существенному увеличению плотности расположения и толщины стресс-фибрилл, разрушению системы микротрубочек и уменьшению площади клетки. Воздействие тромбина на фоне ингибирования Rho-киназы увеличивает площадь, занятую стресс-фибриллами, но не до исходного значения, тогда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне зависимости от присутствия ингибитора Rho-киназ. Действие тромбина не только элиминирует периферические микротрубочки, но и меняет их распределение в центре клетки.
Наши результаты позволяют предположить, что тромбин регулирует актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток через Rho-Rho-киназный путь, где в качестве промежуточного звена выступает деполимеризация микротрубочек на краю клетки.
Похожие диссертации на Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия
