Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы 8
2.1. Передача сигнала от рецептора egf 8
2.1.1. Факторы роста и их рецепторы 8
2.1.2. Эпидермальный фактор роста (egf), другие факторы egf-семейства и рецепторы семейства ERBB
2.1.3. Пути передачи сигнала от рецепторов факторов роста 13
2.1.3.1. Ras и мар-киназа erk 14
2.1.3.2. Стрессорные мар-киназы 14
2.1.3.3. Фосфатидилинозитол-з-киназа(рі-з-киназа) 15
2.1.3.4. Фосфолииаза с у 16
2.1.3.5. Малые регуляторные гтфазы семейства rho 17
2.1.3.6. Нерецепторные тирозинкиназы 17
2.1.3.7. Транскрипционные факторы семейства nfkb/rel 18
2.1.3.8. Активные формы кислорода 18
2.1.3.9. Негативная регуляция передачи сигнала от факторов роста 19
2.1.4. Активация сигнальных путей рецептором egf. 19
2.1.5. Механизмы регуляции пролиферации клеток при действии факторов роста 22
2.1.5.1. Клеточный цикл 22
2.1.5.2. Методы исследования клеточного цикла 26
2.1.5.3. Сигнальные пути регуляции клеточного цикла факторами роста 27
2.1.6. Механизмы регуляции апоптоза при действии факторов роста 29
2.1.6.1. Лпотоз 29
2.1.6.2. Методы исследования апоптоза 33
2.1.6.3. Сигнальные пути регуляции апоптоза факторами роста 34
2.1.7. Рецепторы семейства erbb в онкогенезе 35
2.2. Транскрипционные факторы семейства stat 39
2.2.1. Строение и активация транскрипционных факторов семейства stat 39
2.2.2. Действие транскрипционных факторов семейства stat на клетку и транскрипционные мишени stat-белков 41
2.2.3. Дополнительные механизмы регуляции активности stat-белков 43
2.2.3.1. Активация фосфорилированием по тирозину 44
2.2.3.2. Регуляторное фосфорилирование по серину 45
2.2.3.3. Димеризация, взаимодействие с днк, активация транскрипции 45
2.2.3.4.1 Негативная регуляция stat-нути 47
2.2.3.5. Другие механизмы регуляции 48
2.2.4. Механизмы активации транскрипционных факторов семейства stat рецептором egf. 50
2.2.5. Регуляция пролиферации и апоптоза транскрипционными факторами семейства sta т 53
2.3. Клетки эпидермоидной карциномы а431 57
2.3.1. Характеристика клеток А431 57
2.3.2. Действие EGF на клетки А431 59
2.3.3. Клепальные варианты клеток А431, устойчивые к действию EGF 65
2.3.4. Другие EGF-чувствительные клеточные линии 66
2.4. Исследование функций белков методом рнк-интерференции 68
ГЛАВА 3. Материалы и методы 72
3.1. Культивирование клеток 72
3.2.Плазмиды 72
3.3.. Трансфекции 73
3.4. Электрофорез и иммуноблоттинг 74
3.5. Антитела 74
3.6. Оценка жизнеспособности клеток (МТТ) 75
3.7. Подсчет числа клеток 75
3.8. Микроскопия 76
3.9. Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК 77
3.10. Проточная цитометрия 77
Глава 4. Результаты 79
4.1. Egf индуцирует остановку клеток а431 в фазах клеточі юго цикла g2 и g1 и последующую апоптотическую гибель (бурова и др., 2001; грудинки;! И др., 2003; grudinkin ет al., 2007) 79
4.2. Исследование клональных вариантов клеток а431, устойчивых к действию egf 84
4.2.1. В клетках клональных вариантов 1а, 8а и па снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора stat1 (грудинкин и др., 2003) 84
4.2.2. Трансфекция stat1 возвращает клеткам клопалъного варианта 8а чувствительность к действию egf (grudinkin etal., 2007) 85
4.3. Ингибирование тирозинкиназы рецептора egf и тирозинкиназ семейства src защищает клетки а431 от действия egf, а ингибирование мар-киназы р38 блокирует egf-индуцируемый апоптоз при сохранении блоков клеточного цикла (василенко и др., 200іб; grudinkin ет al., 2007) 86
4.4. Исследование роли транскрипционных факторов stat1 и stat3 в egf-индуцируемом апоптозе
Клеток а431 методом рнк-интерференции 88
4.4.1. Направленное снижение количества sta ті, но не sta тз, значительно уменьшает чувствительность клеток а431 к проапоптотическому действию egf (grudinkin et al, 2007) 89
4.4.2. В egf-зависимое накопление ингибитора циклин-зависимых киназ р2ґа/' и ингибитора апоптоза bcl-xl в клетках а431 вовлечен транскрипционный фактор stat3, по nestatl 91
Глава 5. Обсуждение 92
5.1. Индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в клетках а431 при действии egf 92
5.2. Устойчивые к действию egf клональные варианты клеток а431 95
5.3. Действие ингибиторов киназ на клетки а431 97
5.4. Уменьшение экспрессии транскрипционных факторов семейства stat в клетках а431 методом рнк-интерференции 99
5.5. Предполагаемые механизмы индукции апоптоза при действии egf на клетки а431 101
Глава 6. Заключение 104
Выводы 105
Благодарности 106
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Эпидермальный фактор роста (egf), другие факторы egf-семейства и рецепторы семейства ERBB
- Механизмы регуляции пролиферации клеток при действии факторов роста
- Трансфекции
- В клетках клональных вариантов 1а, 8а и па снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора stat1 (грудинкин и др., 2003)
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы
Одной из важнейших задач молекулярной биологии и медицины является изучение механизмов опухолевой трансформации клеток. Понимание процессов, лежащих в основе превращения нормальной клетки в трансформированную, является базисом для поиска новых методов противораковой терапии. Особое значение имеют случаи, когда опухолевая клетка при трансформации приобретает особенности, позволяющие селективно индуцировать ее гибель. Примером является линия эпидермоидной карциномы человека А431, чувствительная к действию эпидермального фактора роста (epidermal growth factor, EGF).
Клеточная линия А431 - наиболее популярный объект исследования ученых, занимающихся передачей сигнала от EGF. Причиной этого служит повышенная экспрессия рецептора EGF (несколько миллионов молекул на клетку) вследствие амплификации кодирующего его гена (Haigler et al., 1978). Показано, что именно повышенное количество рецептора в сочетании с аутокринной секрецией одного из его лигандов, TGFa, является причиной бесконтрольной пролиферации клеток А431 (van de Vijver et al., 1991). В то же время, повышенная экспрессия рецептора EGF приводит к нетипичному ответу на EGF в высоких (наномолярных) концентрациях - ингибированию клеточного роста и гибели клеток. Подобное действие EGF известно для ряда линий трансформированных клеток, экспрессирующих повышенное количество рецептора EGF, и редко встречается среди других клеток. Исследование механизмов ответа клеток А431 на EGF позволит лучше понять механизмы опухолевой трансформации, пути возникновения "слабых мест" сигнальных систем опухолевых клеток, которые с необходимостью возникают в процессе трансформации и могут помочь в уничтожении опухоли, а также механизмы приобретения опухолевыми клетками вторичной устойчивости при селекции на противоопухолевом агенте.
Причины ингибирующего эффекта EGF не вполне ясны - литературе ука- . зывается на значение остановки клеточного цикла (MacLeod et al., 1986; Fan et al., 1995; Jakus, Yeudall, 1996; Ohtsubo et al., 1998) или апоптотической гибели 6 клеток (Gulli et al., 1996; Chin et al., 1997; Smida Rezgui et al., 2000; Anto et al., 2003; Morazzani et al., 2004) в этом процессе. He до конца выяснены и сигнальные пути, приводящие к реализации EGF-зависимого ингибирования прироста популяции клеток А431. Известно, что EGF передает сигнал за счет стимуляции тирозинкиназнои активности рецептора EGF и последующей активации ряда сигнальных путей, включая ГТФазы семейств Ras и Rho, МАР-киназы, фосфо-липазу Су и различные изоформы протеинкиназы С, РІ-3-киназу и PKB/Akt, ти-розинкиназы семейств Src, JAK и FAK, транскрипционные факторы STAT1, STAT3, STAT5 и NF-кВ (Schlessinger, 2000). Различные элементы передачи сигнала могут оказывать разное, подчас противоположное действие на пролиферацию или выживание клеток, и совокупный ответ определяется степенью активации сигнальных путей и их сочетанием. Имеются различные и достаточно противоречивые данные о роли этих компонентов верхних сигнальных пу- / тей в эффектах, оказываемых высокими концентрациями EGF на клетки А431. Так, есть сведения о значении киназы РКС б (Toyoda et al., 1998) и NF-кВ (Ohtsubo et al., 2000), однако наибольшее внимание исследователей привлекает транскрипционный фактор STAT1.
STAT-белки активируются фосфорилированием по тирозину и дополнительным фосфорилированием по серину, после чего димеризуются, транспортируются в ядро и активируют транскрипцию генов-мишеней (Bromberg, 2001). STAT1 чаще всего передает проапоптотический и антипролиферативный сигнал (Battle, Frank, 2002). Эксперименты с использованием доминантно-негативных конструкций (Bromberg et al., 1998а) и олигонуклеотидов-ловушек (Ohtsubo et al., 2000), а также корреляция между ингибирующим клеточный рост эффектом EGF и активацией STAT1 (Chin et al., 1996, 1997; Bromberg et al., 1998a) показали участие STAT1 в этом процессе. Тем не менее, использованные методы не позволили четко доказать роль STAT1, отделить его от других представителей семейства STAT и установить мишени действия STAT-белков, приводящие к реализации клеточного ответа в данной системе. Дифференциальный подход к изучению транскрипционных факторов семейства STAT важен еще и потому, что для другого представителя семейства, STAT3, доказана центральная роль в зависимой от рецептора EGF супрессии апоптоза, являющейся необходимым компонентом трансформированного фенотипа разнообразных опухолей, экспрессирующих повышенные количества рецептора EGF (Kami et al., 1999; Garcia et al., 2001; Rubin Grandis et al., 1998). Проверка универсальности данной модели и ее применимости к клеткам А431 также является неисследованной и актуальной задачей.
1.2. Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в изучении регуляции апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 эпидермальным фактором роста.
В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. установить биологические эффекты, вызываемые эпидермальным фактором роста на клетки эпидермоидной карциномы А431;
2. идентифицировать сигнальные пути, необходимые для проявления про-апоп-тотического эффекта эпидермального фактора роста;
3. определить механизмы формирования устойчивости клеток к проапоп-тотиче-скому действию эпидермального фактора роста;
4. методом РНК-интерференции установить роль транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в ответе клеток А431 на действие эпидермального фактора роста;
5. исследовать участие STAT1 и STAT3 в накоплении регуляторов клеточного цикла и апоптоза при действии эпидермального фактора роста на клетки А431.
Эпидермальный фактор роста (egf), другие факторы egf-семейства и рецепторы семейства ERBB
Важнейшую роль в функционировании многоклеточного организма играют молекулы, передающие сигналы между клетками. Их присутствие необходимо для координированной регуляции различных аспектов жизнедеятельности клеток - пролиферации, выживания, дифференцировки, образования контактов с другими клетками и с внеклеточным матриксом, миграции, секреции и многих других. Особое значение имеют молекулы, контролирующие численность клеток за счет позитивной или негативной регуляции деления клеток или клеточной гибели. Необходимость внешних «разрешающих» факторов для пролиферации и выживания клеток является важным механизмом поддержания гомео-стаза, морфогенеза и предотвращения неконтролируемого деления клеток, имеющего губительные последствия для организма в целом (Alberts et al., 2002; Gomperts et al., 2002).
Наиболее известные позитивные регуляторы пролиферации и выживания клеток относятся к суперсемейству факторов роста (Fantl et al., 1993; Schlessinger, 2000). Первым из полипептидов этого суперсемейства был открыт фактор роста нервов (NGF), стимулирующий выживание нейронов (Cohen et al., 1954). Позднее были изучены эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста, выделяемый кровяными пластинками (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF) и другие (Fantl et al., 1993). В настоящее время обычно выделяют около 20 семейств ростовых факторов и столько же соответствующих семейств их рецепторов (рис. 1) (Fantl et al., 1993; Hubbard, Miller, 2007). Представители основных семейств факторов роста, их клетки-мишени и биологическая роль указаны в табл. 1. Наиболее типичными ответами клеток на действие факторов роста являются стимуляция продвижения по клеточному циклу и последующего митотического деления (стимуляция пролиферации), а также супрессия апоптотической гибели клеток, то есть стимуляция выживания. Существуют и другие варианты действия факторов роста - стимуляция разборки межклеточных контактов и миграции клеток (особенно характерно для фактора роста ге %
Информация по Fantl et al., 1993; Schlessinger, 2000; Hubbard, Miller, 2007. патоцитов - HGF), образования ламеллоподий, дифференцировки. Особую функцию, стимуляцию синтеза гликогена в гепатоцитах, имеет инсулин, также относящийся к факторам роста как по гомологии, так и по путям передачи сигнала (Katso et al., 2001). Наконец, EGF способен вызывать апоптотическую гибель или остановку пролиферации в некоторых опухолевых клетках (Danielsen, Maihle, 2002) - феномен, подробно исследованный в настоящей работе.
Все факторы роста передают сигнал, связываясь со специфическими трансмембранными рецепторами - рецепторами факторов роста. Рецепторы факторов роста пронизывают плазматическую мембрану один раз и содержат в подмембранной области тирозинкиназный домен, обеспечивающий фосфори-лирование субстратов по остаткам тирозина (Schlessinger, 2000). Гомология в надмембранной области обычно высока между представителями одного семейства рецепторов, связывающими факторы роста, относящиеся к одному из семейств (рис. 1). Связывание фактора роста с надмембранной областью клетки стимулирует димеризацию. Таким образом решается проблема передачи сигнала через мембрану: конформационная стабильность альфа-спиральной структуры трансмембранного домена препятствует непосредственной передаче кон-формационных изменений от надмембранной части рецептора к подмембранной при связывании лиганда, потому новая подмембранная конформация образуется лиганд-зависимо за счет сближения двух подмембранных участков (Heldin, 1995; Klemm et al., 1998). Механизмы димеризации могут быть различны. Так, PDGF является димером из двух субъединиц, соединенных дисуль-фидной связью - в этом случае лиганд просто стягивает субъединицы рецептора. Многие ростовые факторы, например, EGF, изменяют конформацию над-мембранного домена, вызывая увеличение сродства между рецепторами. Наконец, рецептор инсулина изначально является димером, соединенным дисуль-фидными связями - по-видимому, здесь лиганд только переориентирует молекулы рецептора (Heldin, 1995; Hubbard, Miller, 2007).
В любом случае, результатом связывания лиганда оказывается сближение подмембранных участков рецептора. При этом в непосредственной близости оказываются тирозинкиназный домен одной из субъединиц рецептора и С 10 концевой участок другой субъединицы. Эффективность фосфорилирования по тирозину сильно возрастает при пространственном сближении тирозинкиназы и субстрата, так что фактически димеризация рецепторов инициирует их авто-фосфорилирование по тирозину по механизму транс-фосфорилирования (одна молекула фосфорилирует другую) (рис. 2). Для большинства рецепторов (но не для рецептора EGF) транс-автофосфорилирование остатка тирозина в тирозин-киназном домене приводит к усилению тирозинкиназной активности (Schlessinger, 2000; Hubbard, Miller, 2007).
Фосфорилирование остатков тирозина в С-концевом домене рецептора инициирует связывание с рецептором белков, содержащих SH2- или РТВ-домены. Оба типа доменов эффективно узнают пептидные последовательности, в составе которых обязательно должен присутствовать фосфорилированный остаток тирозина. Специфичность связывания определяется последовательностью нескольких аминокислот, непосредственно примыкающих к фосфотирозину -для Sffi-доменов это, в первую очередь, 4 аминокислоты, прилегающие к фосфотирозину в С-конце (Pawson, 2004). Дальнейшая активация сигнальных молекул после связывания их SH2- или РТВ-доменов с фосфотирозин-содержащей последовательностью в составе рецептора может осуществляться по одному или нескольким из трех механизмов: 1) Само по себе связывание 8Н2-домена сигнальной молекулы-фермента изменяет его внутреннюю активность. 2) Сигнальная молекула фосфорилируется рецептором по остатку тирозину, и это приводит к ее активации. 3) В результате связывания с рецептором сигнальная молекула сближается с плазматической мембраной и за счет этого получает возможность взаимодействовать с примембранными белками или мембранными липидами (Schlessinger, 2000).
Механизмы регуляции пролиферации клеток при действии факторов роста
Клеточный цикл соматических клеток делят на интерфазу и митоз. Основным событием интерфазы является репликация ДНК, а митоза - карио- и цито кинез. Внутри интерфазы выделяют фазы G1 (пресинтетическая фаза), S (фаза синтеза ДНК) и G2 (постсинтетическая фаза) (рис. 6 А). Строгая регуляция событий клеточного цикла служит для поддержания генетической стабильности дочерних клеток.
Для того чтобы клетка прошла клеточный цикл, необходимо последовательное преодоление так называемых контрольных, или сверочных точек (checkpoints). Обычно выделяют три основные контрольные точки: Gl/S, G2/M и митотическую, или метафазную (между метафазой и анафазой митоза). Это те моменты в ходе прохождения клеточного цикла, когда клетка проверяет свое состояние (а в G1/S контрольной точке и статус внешних сигналов) и в случае, если что-то не в порядке, останавливается (блокируется) в клеточном цикле. Конечно, это несколько упрощенная схема: например, клетки могут останавливаться на разных этапах прохождения фазы G1, могут останавливаться в фазе S и т.д. В фазе G1 при прохождении G1/S контрольной точки клетка проверяет размеры, наличие питательных веществ, состояние ДНК, а также наличие разрешающих и отсутствие запрещающих пролиферацию сигналов извне. Именно в фазе G1 возможна физиологическая (не патологическая) остановка клеточного цикла в ответ на совокупность внеклеточных сигналов, например, при отсутствии факторов роста или адгезии на внеклеточном матриксе. Момент в ходе фазы G1, после которого присутствие факторов роста в среде теряет значение и клетка независимо от их присутствия проходит весь цикл до следующей фазы G1, называется точкой рестрикции. Многие авторы отдельно выделяют фазу GO. По сути, это особый вариант блока клеточного цикла в фазе G1 со своими биохимическими и морфологическими особенностями. Поскольку именно в фазе GO оказываются клетки, которым «не надо» делиться, в том числе терминально дифференцированные клетки, и могут там оставаться неопределенно долго, может быть удобно рассматривать GO не как блок в фазе G1, а как особую фазу «вне цикла» (Hulleman, Boonstra, 2000; Ekholm, Reed, 2000).
При прохождении G2/M контрольной точки проверяется в первую очередь полнота репликации. Поскольку механизм передачи сигнала от недореплициро-ванной ДНК сходен с механизмом рецепции поврежденной ДНК, то именно в
А: Фазы клеточного цикла (Gl, GO, S, G2, М) и комплексы циклинов и циклин-зависимых киназ, отвечающих за их прохождение. Стрелкой указан период клеточного цикла, когда присутствие факторов роста во внеклеточной среде необходимо для продвижения по клеточному циклу. R - точка рестрикции. Б: Изменение количества циклинов в различных фазах клеточного цикла. В: Ингибиторы циклин-зависимых киназ, их накопление и действие на циклин-киназные комплексы. Г: Регуляция транскрипции с участием транскрипционных факторов E2F за счет гиперфосфорилирования белка Rb при прохождении фазы G1 клеточного цикла. фазе G2 клетка чаще всего останавливается в ответ на повреждение ДНК (хотя остановка в других участках клеточного цикла тоже возможна). В метафазной контрольной точке проверяется, все ли хромосомы собраны на срединной пластинке и все ли кинетохоры соединены с натянутыми, готовыми к расхождению микротрубочками (Hulleman, Boonstra, 2000; Ekholm, Reed, 2000).
В нормальных клетках любая неполадка из вышеперечисленных может приводить к остановке клетки в клеточном цикле до тех пор, пока не поступит адекватный сигнал из внешней среды или до успешного осуществления репарации ДНК. В случае неудачи (или сразу же - в зависимости от типа клеток) в клетке запускается программа старения или апоптотической гибели. Парадоксально, но такие признаки, как способность останавливаться в отсутствие подходящих сигналов с клеточной поверхности и блоки клеточного цикла после повреждения ДНК, сцеплены. Это говорит о конвергенции сигналов с клеточной поверхности и с ДНК на общих мишенях. С другой стороны, блоки клеточного цикла на границе фаз G2/M в ответ на повреждение ДНК обнаруживаются у большинства клеток независимо от степени их трансформированное (хотя нормальные клетки обычно могут останавливаться быстрее и надежнее), а правильная регуляция перехода через границу фаз G1/S - это основное свойство нормальных клеток. Трансформируясь, клетки в той или иной степени приобретают способность к автономной, то есть независимой от внешних сигналов, пролиферации (Копнин, 2000; Hulleman, Boonstra, 2000).
Прохождение клеток по клеточному циклу регулируется активностью комплексов циклинов с циклин-зависимыми киназами (рис. 6 А) - главных двигателей клеточного цикла. Серин-треониновые циклин-зависимые киназы фосфо-рилируют белки-мишени только после связывания с циклинами, играющими роль регуляторной субъединицы. Активность циклин-киназных комплексов необходима для своевременного включения и выключения генов, регулирующих переход клеток от фазы к фазе. Соответственно, прохождение каждой фазы клеточного цикла контролируется своим набором циклин-киназных комплексов (рис. 6 А). В фазе G1 последовательно активируются комплексы циклин D1-3-Cdk4,6 и E-Cdk2.
Трансфекции
Препараты фотографировали на микроскопах Axioscope (Carl Zeiss, Germany), Leica DMRE (Германия) фотоаппаратом Nikon Coolpix в режимах флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии. а: Анализ морфологических особенностей клеток в проходящем свете:
Клетки в лунках 24-луночной платы (Nunc), выращенные на покровных стеклах, а также открепленные клетки фиксировали 3,7 %-ным формалином в PBS, окрашивали DAPI (1 мкг/мл). б: Анализ структур хроматина (окраска DAPI):
Клетки, выращенные на покровных стеклах, а также открепившиеся клетки фиксировали 3,7 %-ным формалином и окрашивали 1 мкг/мл DAPI в PBS. в: Анализ фрагментации ДНК in situ (TUNEL assay):
Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 3,7 %-ным формалином в PBS, промывали трижды PBSE (1 мМ ЭДТА в PBS), пермеабилизо-вывали в растворе 0,1 % Тритона Х-100 в PBSE в течение 5 мин, затем промывали PBSE. Препараты преинкубировали в течение 30 мин в буфере для TdT (терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) (Calbiochem, США), и далее 1,5 ч при 37 С в том же буфере, содержащем дополнительно 50 мкМ 13-биотиндезокси-АТФ, 500 мкМ дезокси-АТФ и 1,2 ед/мкл TdT (Calbiochem). Реакцию останавливали инкубацией 5 мин в растворе 50 мМ ЭДТА в PBS с последующей промывкой PBS. Для уменьшения неспецифического связывания инкубировали препараты в 4 % растворе BSA в PBS в течение 1 ч. Далее препараты инкубировали в растворе антител против компонентов ядерных поровых комплексов в разведении 1:80 в 4 % растворе BSA в PBS в течение 1 ч. После промывок PBS 3 раза по 5 мин препараты инкубировали в растворе, содержавшем антитела козы, выработанные против иммуноглобулинов мыши, конъюги-рованные с CY3 (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) в разведении 1:900, авидин, конъюгированный с FITC, в разведении 1:200 и 0,5 мкг/мл DAPI в 4 % растворе BSA в PBS в течение 45 мин. После промывок PBS 3 раза по 5 мин препараты фиксировали на предметных стеклах в растворе "ProLong" (Molecular Probes, США). Флуоресценцию наблюдали при облучении на длине волны 515 нм для FITC, 570 нм для CY3 и 460нм для DAPI.
Апоптотическую гибель клеток оценивали электрофоретически по появлению фракции экстрахромосомной ДНК. Для этого прикрепленные клетки трип-синизировали, объединяли с открепленными и подсчитывали в камере Горяева. Равные количества клеток (2,5 105) лизировали на льду в течение 15 мин в гипотоническом буфере следующего состава: 5 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5 % Тритона Х-100 и 100 мМ ЭДТА. Клеточные лизаты центрифугировали, надосадоч-ную жидкость отбирали в отдельные пробирки, в которые добавляли NaCl до конечной концентрации 0,15 М и РНКазу А до 100 мкг/мл, а затем инкубировали 1 ч при 37 С. После этого в пробы добавляли SDS до конечной концентрации 0,5 % и протеиназу К до 200 мкг/мл и инкубировали 2 ч при 56 С. Затем осуществляли депротеинизацию хлороформом и осаждение ДНК. Электрофорез проводили в 2 %-ном агарозном геле в Трис-боратном буфере, рН 8,0. После электрофореза гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали при ультрафиолетовом освещении.
Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре ACR1400 (Bruker, Франция) или Beckman Coulter (США). Вычисления были проведены с использованием программ WinList и ModFit LT (Verity Software House, США). Во всех случаях использовался фильтр по параметрам фронтальное светорассеяние -боковое светорассеяние.
Распределение клеток по фазам клеточного цикла (окраска йодидом про-пидия): Прикрепленные клетки трипсинизировали, соединяли с плавающими, фиксировали 50 %-ным этанолом при -20 С и промывали PBSE дважды. Фиксированные клетки ресуспендировали в PBSE, содержащем 50 мкг/мл иодида про-пидия и 50 мкг/мл РНКазы А, и инкубировали 30 мин при 37 С.
Количество пройденных клеточных циклов (мечение CFDA-SE): Перед посевом трипсинизированные клетки инкубировали 5 мин в суспензии в бессывороточной среде ДМЕ, содержащей 2,5 мкМ сукцинимидного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFDA-SE, Invitrogen, США). После двух промывок в среде ДМЕ с сывороткой часть клеток фиксировали, а оставшиеся клетки рассевали в плотности 1,1 х 104 клеток в 0,18 мл среды на 1 см2. Через 12-14 ч добавляли ингибиторы киназ (если указано), а еще через 40 мин - 200 нг/мл EGF. Через 2 сут прикрепленные клетки трипсинизировали, фиксировали 50 %-ным этанолом при -20 С и дважды промывали PBSE. Фиксированные клетки ресуспендировали в PBSE, содержащем 5 мкг/мл иодида пропидия и 50 мкг/мл РНКазы А, и инкубировали 30 мин при 37 С. Среднее количество пройденных делений п вычисляли по формуле n=log2(m/mHCX), где m и тисх - интенсивность флуоресценции CFDA-SE, соответствующая максимуму распределения клеток в данной точке и клеток, фиксированных сразу после мечения. в: Поздние стадии апоптоза (реакция TUNEL):
Прикрепленные клетки трипсинизировали, соединяли с плавающими, фиксировали 50 %-ым этанолом при -20 С и промывали PBSE дважды. Сайты неспецифического связывания блокировали инкубацией в 5 %-ном растворе БСА в PBSE в течение 2 ч, а затем снова промывали PBSE и преинкубировали в буфере для TdT (Fermentas, Литва) 30 мин. После этого клетки инкубировали в буфере для TdT, содержащем 25 мкМ биотинилированного dUTP (Sigma), 250 мкМ dATP (Сибэнзим, Россия) и 0,5 ед/мкл TdT (Fermentas) 2,5 ч при 37 С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 15 мМ. После этого промывали PBSE и добавляли смесь, содержащую 50 мг/мл БСА, авидин, конъюгирован-ный с FITC, и 100 мкг/мл РНКазы A (Sigma) в PBSE на 1 ч при комнатной температуре. После промывок PBSE клетки ресуспендировали в PBSE, содержащем 5 мкг/мл йодида пропидия.
В клетках клональных вариантов 1а, 8а и па снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора stat1 (грудинкин и др., 2003)
В качестве дополнительного метода, позволяющего количественно определить долю апоптотических клеток, мы применили проточную цитофлуоримет-рию с использованием реакции TUNEL (рис. 16). Методом TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin Nick-End Labeling) можно обнаружить апоптотические клетки путем детекции образующихся при апоптозе разрывов ДНК (Heartwole, 1999). Суть метода заключается в пришивке in vitro биотинилированных нук-леотидов по местам разрывов ДНК в фиксированных клетках с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) с последующей окраской FITC-конъюгированным авидином. Мы обнаружили значительное увеличение доли клеток А431 с высокой интенсивностью флуоресценции FITC, иммобилизованного в результате реакции TUNEL (TUNEL-позитивных, апоптотических клеток) при действии EGF (рис. 16, столбец «TUNEL»). Напротив, лишение сыворотки приводило к уменьшению процента TUNEL-положительных клеток. Увеличение доли TUNEL-позитивных клеток и их выделение в отдельную субпопуляцию хорошо видно также в координатах SSUNEL и PIUNEL. Кроме того, анализ гистограмм в координатах PIUNEL позволяет заключить, что апоптотическая гибель инициируется во всех фазах клеточного цикла (рис. 16).
Для изучения деталей апоптотических процессов, проходящих в клетках А431 при действии EGF, мы провели реакцию TUNEL с одновременным окрашиванием ДНК клеток раствором DAPI для выявления конденсации хроматина иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами против белков ядерных поровых комплексов (рис. 17). На препаратах адгезионных клеток А431, обработанных ЭФР (800 нг/мл, 3 суток), мы наблюдали появление только неболь
Клетки А431 рассевали в плотности 1,1 хЮ4 клеток на см2, через 16-20 ч добавляли 200 нг/мл EGF («EGF») или меняли среду на среду ДМЕ без сыворотки («Без сыворотки»). В момент добавления EGF («0 сут») или через 3 сут после момента добавления EGF прикрепленные клетки объединяли с открепившимися, фиксировали, проводили процедуру TUNEL, окрашивали PI и анализировали на проточном цитофлуориметре. В столбцах показано распределение по следующим параметрам: "TUNEL" - флуоресценция TUNEL (указано процентное содержание TUNEL-позитивных (апоптотических) и TUNEL-негативных (нормальных) клеток); "PI" - флуоресценция PI; "FS-SS" -прямое светорассеяние против бокового светорассеяния (регион R1 использовался как фильтр для остальных гистограмм строки); " SSUNEL" -флуоресценция TUNEL против бокового светорассеяния; "PIUNEL" -флуоресценция TUNEL против флуоресценции PL шого количества TUNEL-позитивных клеток, что соответствует изложенной выше концепции о быстром откреплении клеток от субстрата. Многие клетки, детектирующиеся по флуоресценции TUNEL, демонстрируют картину классической апоптотической конденсации хроматина в виде отдельных телец («фрагментация ядра», пикноз, кариорексис), причем участки локализации разрывов ДНК совпадают с местоположением конденсированного хроматина (рис. 17 А). Однако, помимо классических апоптотических клеток, мы обнаружили TUNEL-позитивные клетки, не выявляющиеся при окраске DAPI (рис. 17 Б). По-видимому, в таких клетках ДНК расщеплена практически полностью, а молекулами, достраивающимися трансферазой, являются небольшие фрагменты ДНК, устойчивые к дальнейшему расщеплению. Соотношение интенсивностей свечения FITC и DAPI в этих клетках напоминают эффект обработки ДНКазой фиксированного препарата. Литературные данные, описывающие подобный феномен, нам не известны. Увеличение количества TUNEL-позитивных, PI-негативных клеток наблюдалось также по данным проточной цитофлуоримет-рии (рис. 16, столбец «PIUNEL»).
Из данных литературы известно (Faleiro, Lazebnik, 2000), что иммунофлуо-ресцентная окраска ядерных поровых комплексов (кольцо по краю ядра) маскируется в клетках с активированной каспазой 9. Эффект маскировки окраски ядерных поровых комплексов чаще наблюдался в DAPI-негативных, а не в DAPI-позитивных апоптотических клетках А431 (рис. 17 А, Б). Таким образом, мы можем предполагать отличие механизмов EGF-индуцируемого апоптоза в клетках А431 от наиболее изученного случая - апоптоза в ответ на повреждение ДНК в клетках с диким типом р53 (сравн. рис. 17 В - клетки ElA+cHa-Ras, обработанные адриамицином).
В целом, мы можем заключить, что в использованных в работе условиях EGF вызывает в клетках А431 остановку клеточного цикла в фазах G2 и G1, но конечным результатом действия EGF является индукция апоптоза, сопровождающегося откреплением клеток от субстрата.
