Введение к работе
Актуальность проблемы.
Биологическое действие эпидермального фактора роста (ЭФР) на клетки реализуется через специфический рецептор - крупный трансмембранный белок, обладающий тирозинкиназной (ТК) активностью и несколькими сайтами автофосфорилирования, находящимися на цитоплазматическом конце рецептора. Связьшание ЭФР с рецептором приводит к стимуляции ТК и инициирует два ряда событий: активацию сигнальных путей и интернализацию ЭФР-рецепторных комплексов во внутриклеточные компартменты. ЭФР поступает в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (Willingham, Pastan, 1981). Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние периферические эндосомы, где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану, а остальные попадают в околоядерные поздние эндосомы, после чего деградируют в лизосомах (Beguinot et al., 1984: Sorkin et al., 1988). Соотношение рецепторов, вступающих на тот или иной путь, может изменяться в одних и тех же клетках, что указывает на то, что процесс сортировки является регулируемым.
Несмотря на то, что исследования эндоцитоза ведутся уже не одно десятилетие, механизм перехода из ранних в поздние эндосомы до сих пор является предметом дискуссии.
Известно, что на ранних этапах рецептор остается достаточно долгое время экспонирован в цитоплазму своим С-концевым участком, который содержит активированный тирозинкипазный домен и сайты автофосфорилирования, и способен взаимодействовать с различными внутриклеточными субстратами (Корнилова и др., 1988). Таким образом, изменяя скорость сортировки рецепторного белка в поздние эндосомы (а, следовательно, и уровень его рециклирования), клетка может изменять эффективность и длительность сигнала, идущего с активированного рецептора ЭФР, находящегося в ранних эндосомах. Именно поэтому механизмы, регулирующие сортировку, вызывают наибольший интерес. Имеются данные, несомненно свидетельствующие о существовании рецептор-специфической сортирующей системы (Благовещенская и др., 1994; French et al., 1994). Однако, конкретные белки, опосредующие этот процесс, неизвестны. Одним из подходов к решению этой задачи может стать изучение роли С-терминального домена и ТК рецептора в опосредовании его сортировки. Полученные данные помогут определить некоторые свойства этих "сортирующих белков" (такие, как способ их активации и механизмы взаимодействия с рецептором), что может явиться первым шагом на пути к их идентификации.
В то же время, эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов является частным случаем внутриклеточного везикулярного транспорта. Очевидно, что ЭФР-специфическая сортирующая система должна каким-то образом взаимодействовать с универсальными белками-регуляторами везикулярного транспорта, обеспечивающими образование, узнавание и слияние донорных и акцепторных везикул. Результатом взаимодействия этих систем является обеспечение доставки конкретных белков в конечные пункты их назначения.
К таким универсальным регуляторам везикулярного транспорта относятся белки окаймления (клатрин, кавеолин, СОР-белки), адаптины, тримерные G-белки, N-этилмалеимид-чувствительные факторы (NSF) и др. (Elferink et al.,1993; Orci et al„ 1993; Dconen et al., 1995). Наиболее многочисленную группу представляют Rab-белки -малые ГТФазы, имеющие высокую степень гомологии с белком p21Ras. К настоящему моменту идентифицировано более 30 членов этого семейства, опосредующих различные этапы транспортных везикулярных пугей. Многочисленность этого семейства позволяет предполагать, что именно они обеспечивают специфичность транспортных реакций. В поздних эндосомах были обнаружены Rab9 и Rab7, причем функция Rab7 остается до сих пор неизвестной (Chavrier et al., 1990; Shapiro et al., 1993). С одной стороны, существуют данные об участии Rab7 в опосредовании перехода из поздних эндосом в лизосомы (Chavrier et al., 1995). С другой стороны, появились работы, позволяющие предполагать вовлечение Rab7 в регуляцию перехода из ранних в поздние эндосомы (Mukhopadhuay et al., 1997). С этой точки зрения Rab7 становится одним из основных кандидатов на роль фактора, обеспечивающего сопряжение работы ЭФР-специфической сортирующей системы с общими механизмами регуляции везикулярного транспорта, однако исследования, посвященные этой проблеме, отсутствуют.
Механизм действия Rab-белков относительно изучен только для Rab5. По аналогии с Rab5 предполагают, что роль Rab-белков заключается в обеспечении специфического взаимодействия донорного компартмента с соответствующим акцепторным и в опосредовании слияния этих мембран. Тем не менее, для окончательных выводов о роли Rab-белков в регуляции везикулярного транспорта необходимы исследования функционирования каждого конкретного члена семейства.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизмов сортировки рецепторов ЭФР из ранних в поздние эндосомы и участия в этом процессе малой ГТФ-азы Rab7. В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:
-
Выяснить роль С-терминального домена рецептора ЭФР, содержащего основные сайты автофосфорилирования, и рецепторной тирозинкиназы в сортировке ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомалыюй деградации.
-
Исследовать взаимоотношения малой ГТФ-азы Rab7 с рецепторами ЭФР в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза.
-
Охарактеризовать внутриклеточные компартменты, с которыми взаимодействует Rab7.
-
Исследовать влияние деполимеризации тубулинового цитоскелета на ход рецептор-опосредованного эндоцитоза ЭФР.
Научная новизна.
Продемонстрировано, что ТК активность рецептора ЭФР и, в меньшей степени, интактность его С-концевого домена, необходимы для эффективной сортировки рецепторов на путь деградации. Таким образом, именно переход из ранних в поздние эндосомы является ключевым сайтом действия интернализованного рецептора ЭФР.
Показано, что интактность тубулинового цитоскелета, опосредующая перемещение ЭФР-ренепторных комплексов с периферии клетки в охолоядерную область, не является необходимой для лизосомалыюй деградации рецепторов.
Впервые показано, что изменение локализации Rab7 в клетке происходит в результате действия сигнала, стимулируемого не интернализацией рецептора как таковой, а инициируемого активированной рецепторной ТК. Обнаружено, что локализация интериализованных рецепторов с активной ТК и Rab7 в значительной степени совпадает. Тем не менее, в условиях разрушения тубулинового цитоскелета с помощью нокодазола, ко-локализашя структур, содержащих активированный рецептор ЭФР и Rab7, практически отсутствует.
Впервые продемонстрировано, что Rab7 локализован в клетке не только на ранних и поздних эндосомах, но и на мембранах эцдоплазматического ретикулума (ЭПР). При стимуляции эндоцитоза Rab7 уходит с ЭПР и ассоциируется с ранними, а затем поздними эндосомами. При этом его количество во фракции цитоскелета увеличивается.
Теоретическое и практическое значение работы.
Большинство работ по исследованию механизмов везикулярного транспорта проводится с использованием лигандов, поступающих в клетку путем жщкофазного эндоцитоза. В этом случае сортировка в поздние эндосомы происходит с очень низкой эффективностью. Использование нами в качестве модели ЭФР-стимулируемого рецептор-опосредованного эндоцитоза позволяет экспериментально получить
синхронную волну транспортных событий, в частности, сортировки, что облегчает исследование сопутствующих этим событиям процессов.
Набор клеточных линий, экспрессирующих мутантные рецепторы ЭФР с различной способностью к вступлению на путь деградации представляет собой удобный инструмент изучения молекулярных механизмов сортировки.
Результаты, полученные в данной работе, изменяют традиционные представления о возможных функциях Rab-белков, существенно расширяя их.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Материалы диссертации докладывались на ежегодном Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), Международном конгрессе по клеточной биологии (Сан-Франциско, США 1996), ХХХШ Международном физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), Европейском Конгрессе по молекулярной и клеточной биологии (Брайтон, Великобритания, 1997), Европейской научной конференции "Динамика мембран в эндоцитозе" (Сан Федю, Испания, 1997), Всероссийском Симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1998), и на научных семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ^^ публикаций. Работа изложена на il{ страницах машинописного текста и иллюстрирована 23 рисунками.
