Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время промесс pcueirrop-oiiocpejonamioro эилошггоза (1'ОЭ)
ростовых фактороя является предметом интенсивных исследований, поскольку
оказалось, что поступающие в клетку в ходе РОЭ рецепторы, в том числе и
рецептор эиндермалышп» фактора роста (ЭФР), обладают лнганд-
стимулированной тирозинкнназпой активностью (I.ai et al., 198V; Ncsterov et a!., I WO) и участвуют в каскадных реакциях фосфоріинроваиияУдефосфорнлнровання внутриклеточных белков, что в конечном счете приводит к передаче мнтогенного сипіала (Di C'ugliclmo et al., 1994).
Применение нммунофлюоресисіггного, электронно-микроскопического »1 биохимического анхтнэов позволило в значительной степени охарактеризовать различные этапы внутриклеточного прокессинга ЭФР-рспситорных комплексов. Считается установленным, что связывание ЭФР со своим рецептором на плазматической мембране (ПМ) индуцирует нитерпалнзаиию ЭФР-рспситорных комплексов - эффективное поступление во внутриклеточные комиаргменты через клатрин-оканмленные ямки. Первым компартментом, в котором обнаруживаются иктернхтпзованные ЭФР-рспепторныс комплексы, являются ранние эндосомы. Они составляют главный сортирующий компартмент эндошпозного пути, поскольку в нем определяется внутриклеточная судьба ЭФР-реиспторных комплексов: ремнклнронанне на ПМ (Tcslenko et al., 1987; Sorkin ct al., 1989), либо поступление на дсірадаипонш.ій путь в лизосомы (Miskimins, Shimizu, 1982; Ikguinot et al., 198-4). Те лиганд-ренепторные комплексы, которые направляются (сортируются) на деградацию, поступают дхзее в поздние энлосомы, локхтизующнеся в области пара-Гольджн, и затем в лизосомы. В лнзосомах происходит деградация как ЭФР, так и его рецептора.
Лихтиз связывания ЭФР с клетками продемонстрировхт существование
двух классов рецепторов, различающихся по сродству к ЭФР: высоко- и
ннзкоаффинных. Существуют доказательства о преимущественном
автофосфорилнровании и основном вкладе высокоаффинных рецепторов в процессы передачи митогенного сипіхіа, в то время как данные о внутриклеточном происссинге разных популяций рецепторов отсутствуют.
Сейчас становится очевидным, что прохождение всех этапов эндоцнтозного пути ЭФР-рсиепторных комплексов контролируется многими факторами. Так, обнаружено, что некоторые участки в молекуле рецептора ответственны за прохожлсиие определенных стадий эилоиитоза. Среди этих участков основну*) регуляторную функцию выполняет тирозинкиназа (ТК) рецептора. Считается установленным, что рецепторная ТК, осуществляя фосфорилнрованне внутриклеточных белков, опосредует передачу ЭФР-индуцнрованного мігтогенного сигнхіа. Однако, .тіпсрагурньїе данные об участии ТК в регуляции эилошггоза неполны и противоречивы.
>
К настоящему моменту известен ряд белков, функционирующих в качестве регуляторов внутрнклеточноіо мембранного транспорта, частым случаем которого является эндощггоз. К ним относятся аннексины, белки СОР, ARF, Rab-семейств. Последнее семейство особенно интересно тем, что обладает высокой структурной и функциональной гомологией с Ras-белком - ключевым звеном в ЭФР-зависимом сигнальном каскаде. Вопрос о том, вовлекаются ли Rab-белки в регуляцию ЭФР-опосредованного эндошгтоза, остается открытым.
В ходе рецептор-опосредованного и жидкофазного эндошгтоза лнганды, направляющиеся в лизосомы, проходят через серию эндосомалыгых комчзртментов. Однако, неизвестно, различаются ли эти компартмеїгтьі н регуляторные механизмы, коїгтролируюшие доставку в них лиганда, для двух типов эндоцитоза. До сих пор этой проблеме не уделялось особого внимания.
Ешс одним обстоятельством, придающим значимость рассматриваемой проблеме, является полное отсутствие данных по регуляции ЭФР-опосредованного эндоцитоза в клетках, экспрессирующнх низкое, "физиологическое" количество рецепторов. Изучение этого вопроса может дать точное представление о роли ЭФР-заоисимого эндоцитоза в проведении митогсшюго сигнала.
Цепи и задачи исследования.
Целью данной работы является выявление факторов, необходимых для регуляции различных этапов эндоцнтозного пути рецепторов ЭФР.
В связи с этим, задачи исследования определены следующим образом:
1. Сравнить внутриклеточную судьбу высоко- и низкоаффинных рецепторов
ЭФР.
2. Исследовать внутриклеточный процесеннг рецепторов, обладающих
активированной и нсактивированной ТК в клетках Л431.
-
Изучить взаимоотношения маркера поздних энлосом Rab7 с экдосомальнымн компзртментамн, содержащими рецептор ЭФР, в ходе эндоцитоза в клетках А431.
-
Проанализировать пути внутриклеточного процесеннга ЭФР н пероксидазы хрена (ПХ) в условиях разборки микротрубочек мокодазолом и ингибирования вакуолярной Н*-ЛТФазы бафнломнцнном А1 (Баф А1) в клетках А431.
5. Сравнить эндощггоз ЭФР-реиепторных комплексов в ЭФР-завнснмых
клетках НСП, растущих в присутствии и отсутствии ростового фактора.
Научная новизна полученных розуяьтатос.'
Установлено, что тирозинкнназная активность рецептора участвует в регуляции, по крайней мере, двух ключевых этапов эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов: интернализацпи и сортировки (перехода из ранних энлосом в
поздние). Однако, требование активации ТК рецептора для его аффективной сортнронкн является более жестким.
Впервые исследованы взаимоотношения эндосомхтьных компартментов, содержащих рецепторы ЭФ1', с маркером поздних эндосом Rab7 в ходе РОЭ. Показано, что Rab7 ассоннируеіся не только с поздним, но и сортирующим ЭНДОСОМХ1Ы1ЫМИ компартментами, содержащими рецепторы ЭФР.
Продемонстрированы рахтпчня механизмов, регулирующих два основных типа эндощггоза: жидкофаэного (мнкропнноцнтоза) к РОЭ. Обнаружено, что система ннтактных мнкротрубочек и активность вакуолярной Н*-.\ТФазы, которая создает градисігт рП вн>три органелл эндоцнтозного пути, являются необходимыми условиями эффективной сортировки жидкофазного маркера ПХ. Напротив, на сортировку ЭФР-рснепторных комплексов эти факторы не оказывают влияния.
В ЭФР-завнсимых клетках эпителия маточной железы мыши UCII продемонстрировано, что эффективность перехода ЭФР-рспситорных комплексов из ранних в поздние эндосомы зависит от того, росли ли клетки в присутствии НЛП отсутствии ЭФР в среде.
Практическая ценность работы.
Применение моноклональных антител, специфически узнающих высоко- и низкоаффинные рецепторы, является идеальным подходом, с помощью которого можно изучать функционирование каждого класса рецепторов разных факторов роста в любых клеточных линиях.
Неспособность моноклонхтьных антител стимулировать ТК активность после связывания с соответствующим к рецепторами ростовых факторов является одним из преимуществ использования антител в качество нейтральных зондов для изучения рати ТК активности в натнвной системе и поэтому позволяет избежать неспеинфических эффектов, возможных при использовании трансфектаитных клеточных линий, мутантных по ТК активности.
Новый специфический блокатор вакуолярной Н*-АТФазы - бафиломпинн АІ - представляет самый лучший на сегодняшний день агент для изучения роли рН в экдоцитозмом транспорте в любых клеточных линиях, поскольку позволяет избежать побочных эффектов, вызываемых ионофорамн и слабыми основаниями.
Система повторного центрифугирования субклеточных органелл і градиентах с различной концентрацией Перколла может быть с успехом применена хтя максимального разделения любых органелл эндоцнтозного пун различных белков.
Япробаїшя работы.
По теме днесертации'отбликовано 7 работ.
Матернхчы диссертации докладывались на Международной школе по внутриклеточному транспорту (Эспиньо, Португалия, 19У4), ежегодном Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), конференции Европейского общества клеточных биологов (Хейдельбсрг, Германия, 1995), Европейской научной конференции "Мембранная динамика и эндоцнтозе" (Пларни, Ирландия, 1995), в Европейской молскулярно-бнологнческой лаборатории (Хейдельберг, Германия, 1995) и на научных семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН..
Объем а структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 211 публикаций. Работа изложена на "1>3 страницах машинописного текста и иллюстрирована 22 рисунками и 3' таблицами.
