Введение к работе
Актуальность прблемы.
В настоящее время в клеточной биологии большое внимание уделяется изучению процессов, связаных с регуляцией репродукції,» шісток эукарнот. Одним из них является действие ростовых факторов. Многие ростовые факторы (РФ), гормоны, нейротрансмиттеры, связываясь с соответствующими рецепторами на плазматической мембране клеток, активируют внутриклеточные реакции, приводящие клетки к синтезу ДНК и, в итоге, к их к- ІЄИИЮ. Рецепторы РФ, в частности рецептор эпидермалыюго фактора роста (ЭФР-Р), обладакя протешпеиназной активностью, специфичной по тирозину, то есть являются рецепторными тирозинкиназами (РТК). Связывание РФ с рецептором приводит к активации РТК, катализирующей фосфорилирование как самого рецептора, так и некоторых белков, участвующих во внутриклеточной передаче митогенаого сигнала с поверхности клеток к ядру. Несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению этих процессов, их механизмы к настоящему времени остаются предметом исследований.
Когда было обнаружено, что у большинства типов клеток одной из
первичных реакций на связывание РФ с рецептором является увеличение уровня
внутриклеточного инозитолгрифосфата (ИТФ), стимулирующего выход ионов
Са** из внутриклеточных "хранилищ", и появление диацилглнцерола (ДЛГ),
физиологического активатора протеинкиназы С (ПКС) , особое внимание было
уделено пиролизу инозитолфосфолипидов (И'1>), в результате которого и
появляются ИТФ и ДАГ. Ферментом, катализирующим этот гидролиз оказалась
фосфолипаза С. К настоящему времени известно 4 изоформы (типа) этого
фермента : а, р, б и у. Каждый тип включает в себя несколько подтипов,
обозначаемых арабскими цифрами после греческих букв: ФЛСуІ, ФЛСу2.
Показано, что все ФЛС обладают двумя сходными каталитическими доменами,
назваными X и Y К настоящему времени удалось установить два основных
механизма активации этого фермента: бактериальные токсины, аналоги
гуанозинтрифосфата изменяют активность ФЛС через О-белки; так же акмшность
ФЛС может изменяться при действии РФ і .тем прямой к^іалентт-іі
модификации фермента фосфорилированием. Продемонстрировано, что
тирозиикиназный домен рецепторов, в частности ЭФР-рснсп гора (ЭФР-Р),
необходим для инициации пиролиза ИФ. Известно, что именно ФЛСуІ способна
к ассоциации с рецепторами РФ и, вероятно, активируется нуїсм
фосфорнлнроваїшя по тирозину за счет активности РТК. Однако сини, мс*:.-і\ фосфорилировапием по тирозину и увеличением сіюсоГчіосін ФЖ і і гидроліповать фосфатидилинозитол фосфаты не так проста, кпк это кінаїо-і « начале исследований в этой обласні. Фосфорилировзіше очииісимоіі ФЛі'уІ ч> vitro не приводило к увеличению се активности ; замешсти". ппнот in , ,wh. -фосфорнлнроваїшя ,Y-783, в молекуле ФЛС,1 не нріикчіилс * пкичччшм -каталитической активности in vitro; іг го же время ік<-іірс<ч-ия ш'і '-'' ' .і>
в метках NIH ЗТЗ вела к полному блокированию ФРВТ-индуцированного шдролиза ИФ. В таких клеточных линиях как А431, NIH ЗТЗ, Ref52 и др. О-бслки не участвуют в активации ФЛСуІ, однако на первичных гепатоцитах крысы показано, что во взаимс, ействии ФЛСуІ с ЭФР-Р кроме РТК принимает участие G-бслок. Более того, Смит с соавторами (Smith et.al.,1994) показали способность ФЛСуІ независимо от се липазпой активности индуцировать синтез ДНК. в клетках NIH3T3.
В отличие от других изозимов фосфолипаза Cylt кроме кагалитических X и У
доменов, содержиг так называемые Src-гомологичные последовательности (SH
домены). SH2 домен обеспечивает связь белка с фосфотирозин (pY)-
содержащнми последовательностями других белков, SH3 домен,
предположительно, обеспечивает связь белков с актиновым цитоскелегом
Обнаружение белков, имеющих подобные домены, не обладающих
каталитическими активносгями (Nek, р85 субъединица фосфатидилинозитол-3 киназы, Drk. Sem5 ), по адаптирующих белок-белковые взаимодействия за счет этих структурных доменов, наводит на мысль о наличии подобной адалтерной функции и у ФЛСу.
Еще одним обстоятельством, придающим значимость рассматриваемой проблеме,является отсутствие какой либо информации о функции и участии в активации и/или врегуляции ФЛСу ряда белков, хо-чммунопреципитирующих с этим ферментом.
Так же до сих пор остаются невыясненными ни вопрос о влиянии количества рецепторов РФ (ЭФР-Р), ни вопрос о различиях ФЛСуЬзависимых механизмов, запускаемых ростовыми факторами в нормальных и трансформированных клетках.
Цели и задачи исследования!.
Цель» данной работы являлось изучение взаимодействия рецептора ЭФР и ФЛСуІ, а также других белок-белковых взаимодействий, индуцированных ЭФР на клеточных линиях с различным ответом на действие ЭФР. В связи с этим задачи исследования определены следующим образом:
1. Выявить наличие ФЛСуІ в различных тканях и клеточных линиях. Определить,
существует лк взаимодействие между ФЛСуІ и ЭФР-Р.
-
Сравнить ассоциацию ФЛСуІ и ЭФР-Р в клегочных линиях, где ЗФР индуцирует и не и'.щуцирует синтез ДНК.
-
Сравнить фосфорилированке ФЛСуІ к других белков в нормальных и внеокотранеформированных клеточных лгниях.
-
Исследозат; ЭФР-инду7(ировалнук> ассоциацию ФЛСуІ с другими белками в нормальных и высокограпсформированных клеточных линиях.
-
Определить влияние количества ЭФР-Р на активацию ФЛСуІ.
, Научная новизна полученных результатов.
Установлено наличие я распределение ФЛСуї в тканях некоторых органов крысы и в некоторых клеточных линиях, таких как А431, МГ22, первичных гепатоцитах мыши., первичных фибробластах человека. Показано, что данный фермент присутствует в относительно большом количестве в гомогенатах мозга и печени крыс, в меньшей степени - в гомогенатах почек и легкого, практически отсутствует в гомогенатах селезенки и сердца. В кллках МГ22 и в первичных гепатоцитах ФЛСуІ присутствует в относительно большем и примерно равном количестве.
В клетках А431 обнаружена ассоциация ЭФР-Р и ФЛСуІ как до, так и после обработки клеток ЭФР. Это предполагает независимость ассоциации ФЛСу с ЭФР-Р от активирования РТК в этих клетках.
Выявлен ранг не описанный белок с молекулярной массой 66 кДа (рбб), способный к ассоциации с ЭФР-Р. Пептидное картирование рбб свидетельствует, что этот белок является фрагментом ФЛСуІ, возможно продуктом ее естественного протеолиза. Предполагаются конкурентные отношения между ФЛСуІ и рбб за месга связывания с ЭФР-Р в клетках А431.
На клетках мышиной гепатомы определено количество и аффинность рецепторов ЭФР, показано ішгибпрующее действие ЭФР на синтез ДНК. Продемонстрирована ЭФР зависимая ассоциация ЭФР-Р и ФЛСуІ. Вопреки ожидаемому, в клетках МГ22 белок рбб, ассоциированный с ЭФР-Р и ко-иммунопреципишрую/ций с ФЛСуІ, не был обнаружен. При этом выявлялись белки с молекулярными массами 70 и 110 кДа, ко-иммунопреципитирукчдие с ФЛСуІ, фосфорилкруюшиссї по тирозину при действии ЭФР.
На первичных гепатоцитах мыши определено количество ЭФР-Р, примерно равное количеству ЭФР-Р клеток мышиной гепатомы. Показано нндуцируюшее действие ЭФР на слптсз ДНК. При ЭФР-индуцированной ассоциации с ЭФР-Р и фосфорилнроваиии ФЛСуІ не обнаружен фосфорилпрованным по тирозину рИО. Отсутствие фосфорилированного рПО отличает первичные гепатоциты мыши от клеток мышиной гепатомы.
Практическая ценность работы.
Сравнение клеток сходного происхождения (МГ22 и первичных гепатоцитов) позволило выявить некоторые отличия в ФЛСуІ-заоиснмілх биохимических путях, активизированных действием ЭФР, в нормальных и ьысокотрансформированных клетках.
Применение антител, выработанных на SH-содержащий участок ФЛСуІ, позволяет иммунопреципитировать другие SH-содержаишс белки и выявлять и\ взаимодействия и ЭФР-зависимое фосфорнлировлиие при помощи антител к рУ.
Совмещение протеолитического расщепления белков с пептидным картированием в процессе электрофореза отрос сокращает п)<смя ироїчж.іич
стандартной процедуры, позволяет использовать для создания пептидньїх карт небольшие количества белков и протеаз, заметно уменьшает нсснецифическую деградацию белков.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Материалы диссертации были представлены на 4-ow Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прзга,Чех.ословакш, 1У94), докладывались на Российских конференциях и научных семинарах лаборатории физиологии меточного цикла Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результате*, выводов и списка литературы, содержащего >$ публикаций. Работа изложена на //У страницах машинописного текста и иллюстрирована // рисунками.
