Введение к работе
і ,
Актуальность проблемы: Одно из центральных мест в клеточной биологии занимает исследование механизмов, регулирующих рост и размножение клеток. Особое внимание исследователей привлекает действие Факторов роста - белков, которые специфически стимулируют синтез ДНК и пролиферацию клеток.' Механизм действия Факторов роста активно изучается в последние годы, тем не менее он остается недостаточно ясным. Следует отметить, что большая часть работ в этой области проводится in vitro, и обнаруживаемые закономерности не всегда точно соответствуют процессам, происходящим в клетке. В связи с этим нам представляется важным проведение иммунно-морФологических исследований на световом и электронно-микроскопическом уровне, позволяющих изучить локализацию белков, участвующих в передаче митогеиного сигнала.
Наиболее изученным Фактором роста является эпидермальный Фактор роста (ЭФР). Взаимодействие ЭФР с клеткой осуществляется через высоко специфичные рецепторы на плазматической мембране. Рецептор. ЭФР - белок 170 кДа с внешним лиганд-связывающим доменом, гидрофобной трансмембранной частью и внутриклеточным доменом, обладающим тирозинкиназной активностью. Протеинниназа рецептора способна как к ФосФорилированию самого рецептора (звтоФосФорилированиэ), так и к ФосФорилированию внутриклеточных субстратов. Поиск белков, которые Фосфорилируются рецептором после его активации ЭФР и, вероятно, участвуют в процессе передачи сигнала является приоритетной задачей современной молекулярной и клеточной биологии.
Взаимодействие ЭФР с клеткой не ограничивается связыванием с рецептором на плазматической мембране. ЭФР поступает внутрь клетки с помощью механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза. Существуют различные точки зрения на роль эндоцитоза. Согласно одной из них, процесс эндоцитоза является частью негативно регулируемого механизма обратной' связи и. служит для 'удаления активных рецепторов с поверхности клеток. По другой точке зрения, именно интерналкзовэнные рецепторы,. перемещаясь внутри клетки и взаимодействуя с различными субстратами, могут выполнять Футсцию переноса стимулирующего сигнала с плазматической моибраны в ядро.
Для выяснения общих закономерностей действия ростовых Факторов интересным и важным является сравнение интернализации и процессияга различных Факторов роста. Поэтому в данной работе изучался Ев только процэссинг ЭфР.но и менее изученного Фактора роста, выделяемого тромбоцитами (ФРТ).
Цели и задачи исследования: 1.Подучить .электронно-микроскопические (ЭМ) доказательства возможности использования моноклональных антител (моноАТ) к рецептору ЭФР для изучения интернализации ЭФР-Р комплексов (ЭфР-РК). Провести иммунноцитохимическое исследование зндоцитоза ЭФР-Р в клетках А431
2.Оценить уровень спонтанного зндацитоза в клетках А431 на электронно-микроскопическом уровне.
3.Изучить дайствиэ примаквина на рециклирование ЭФР-рецэпторных комплексов методой непрямой иммунноФлуоресценции. 4.Исследовать зависимость интернализации рецептора от его струотуры на примере рецептора ФРІ.
5. Изучить внутриклеточную локализацию Фосфолипазы Gyl субстрата Фоорорилирования ЭФР-Р.
Научная новизна работы. Показан путь интернализованяого
ЭФР-Р в клетках А431 на ЭМ уровне с помощью коныогатов
^коллоидного золота с моноАТ к ЭФР-Р. Показано, что используемые
моноАТ 5А9, являясь маркирами шггернализованного рецептора, не
влияют на связывание лиганда и процэссинг ЭФР-рзцепторных
комплексов.
Представленное иммунноцитохимическов исследование улътракриосрезов говорит о возмошшсти использования этого иотода для изучения интернализации ЭФР-Р.
Обнаружено, что для клеток А431 характерен высокий уровень спонтанного конститутивного эпдоцитоза.
Показано, что лизосомотрошый амин примаквин частично ингибирует рециклирование ЭФР-РК.
Изучение эндоцитоза нормального и мутантного рецепторов ФРТ позволило сделать вывод о важной роли .внутриклеточного домена рецептора для лигавд-зависимоа интернализации.
Впервые показана внутриклеточная локализация фосфолипэзы Cyl на ЭМ уровне. Обнаружена ко-локализация. ФЛ Cyl с ЭФР-Р на плазматической мембране. При действии ЭФР происходит совместное
перераспределения этих белков. Впервые показана ко-локализация ФЛ Cyl и ЭФР-Р в зндосомах- клеток А431 после действия ЭФР.
Научно-практическое значение работы. Полученные данные об интернализации и внутриклеточном процзссингв рецепторов ЭФР и ФРТ необходимы для понимания механизмов Функционирования эндосомалъного аппарата клетки.
Полученные данные о ко-локализации ФЛ Cyl и ЭФР-Р на плазматической мембране и в зндосомах важны для понимания механизма передачи сигнала, регулирующего клеточную пролиферацию.
Используемые в работе методические приемы, в особенности иммуннозлеісгронно-микроскопическое исследование, могут быть успешно применены для исследования внутриклеточной локализации многих биологически активных веществ.
Примаквин используется в качестве противомалярийного препарата. Полученные данные по его действию на процэссияг рецэптора ЭФР необходимо учитывать при использовании примаквина в практических цэлях.
Апробация работы.Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Функциональная морфология клeтки,,, (С.-Петербург,1991) и на Менздународной конференции "Клеточные программы роста, диФФврэнцировки и неоплазии" (Хельсинки, Финляндия,1992).
Публикации.По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объём работы. Диссертация . изложена на ЦЫР страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, состоящего ш2-С& наименований. Материалы диссертации иллюстрированы /~ рисунками.
1. Культивирование клотогс А431.
Клетки эпипэрмялыгоя карциномы человека А431 были получены из Банка клеточных культур ДОЩ РАН , С.-Петербург). Клетки культивировали в срэдр іігла с добавлением 10% сьторотки крушого рогатого скота в СОи-инкубаторз при +37С.
2. адэйтронио-микроскопшеские исследования.
2.1. Изучение ультраструктуры клеток А431.
Клетки А431 сеяли на покровные стекла. Через 48 ч , когда клетки достигали состояния субконфлюента, покровные стекла переносили в рабочую среду (PC), содержащую среду Игла, 0,1 бычьего сывороточного альбумина, 20 мМ hepes, рН 7.3. В ряде случаев в PC добавляли ЭФР (100 нг/мл), полученный в наша лаборатории (Соркин и др., 1989 ). Клетки Фиксировали ЗЖ забуФврзнвым глютаральдогидом и постфиксировали 1% 0в04, растворенным в том т буфере,заливали в смесь Эпона с Аралдитом по стандартной методике.
2.2. Иммуннозлектронно-микроскопическое исследование интернали-
зации ЭФР-Р в клетках А431.
Коллоидное золото получали по методу Слота и Гитаа (Slot and Geuze49a5).KoHbioraTbi. моноАТ с золотом (AT-золото)получали
ПО Методу ЛЮКОКа И Роса (Lucocq and Roth,t985). МоноАТ 5А9 были
получены (Сорокин и др., '1988) и аффинно очищены в нашей лаборатории.К покровным стеклам с клетками А431 поело промывки PC добавляли АТ-золото. Клетки инкубировали .1 ч при +4С, затем часть стекол Фиксировали, а . часть - Фиксировали после дополнительной инкубации в теплой среде в течении .часа при +37С. Для запуска зндоцитоза в среду добавляли ЭФР (100 нг/мл), затем стекла с клетками нагревали до +370 1 мин,30 мин или 2 ч, посла чего Фиксировали для ЭМ исследовании как описано .выше. Б качестве контроля вместо антител клетки инкубировали в растворе 10* сыворотки.
2.3. Изучение криосрезов клеток А431.
Клетки А431 выращивали на пластиковых Флаконах и брали в эксперимент через 48 часов после посева. К части клеток добавляли ЭФР(100 нг/мл) на 1 мин. Клетки снимали с пластика смесью трипсина с версеном, центрифугировали. Б мин при 1000 об/мин, промывали фосфэтным буфером (рН 7,4) и Фиксировали смесьп 4 раствора парФормальдегвда с 0,04% раствором глутаральдегида. Затем осадок клеток замораживали по .стандартной методике я- получали ультракриосрезы
(Токп*ави4973). Часть сеточек со срезами окрашивали по методу Токуяши (ТокиуавиДяав) поликлояальными антителами к ЗФР-Р
(ПОЛучеННЫМИ- ИЗ Лаборатории Dr.Carpenter), ЧасТЬ
поликлональньии антитвлани к ФЛ Cyl <так яэ полученными из лаборатории Вг.Ьирепют), часть - инкубировали в 10 сыворотке (контрольные сеточки) в течении 1 часа или в течении ночи. В качестве' вторых антител использовали коньвгат 6 нм золота с
КОЗЬИМИ антителами против КРОЛИЧЬИХ (Amershaoi). Для
морфологического анализа часть сеточек антителами не окрашивали.
3. Эксперименты с радиоактивным производным ЭФР - Х"1-ЭФР и
конъюгатом коллоидного золота с моноАТ.
Клетки А431 сеяли на 24-луночную плату в концентрации 200 тыс. клеток на лунку.Через 48 ч клетки, достигшие состояния монослоя, инкубировали в PC, содержащей 30 нг/мл i-ЭФР в течении 1 ч при +4С.причем часть лунок инкубировали только с 1 -t-ЭФР, в часть добавляли также 250НМ моноАТ с коллоидным золотом,. а в часть - 50 нМ. моноАТ с золотом. Затем клетки переносили в +37 С на 30 мин.Клвтки промывали 4' раза холодной PC и помещали в 0,2 М натрий - ацетатный буфер, рН 4.5 (НАБ) при +4С на 2 мин для удаления поверхностно-связанного 1251-ЭФР. двухминутная обработка повторялась дважды, обе кислотные отмывки смешивали и использовали для измерения количества i-ЭФР, ассоциированного с плазматической мембраной. Затем клетки солобилизировали в . 1М наОН. Таким образом с каждой ячейки определяли два параметра: количество 12Б1-ЭФР на плазматической мембране и .количество
внутриклеточного 1-ЭФР.
4. ИммунноФлуоресцентное ' (Иф) изучение действия примаквина на
зндоцитоз ЭФр-Р в клетках А431.
К клеткам, выращенным на покровных стеклах, добавляли в PC ЭФР (100 нг/мл) одаоврененно с моноАТ к ЭФР-Р 5АЭ. Клетки инкубировали 1ч при ЛС, затем часть покровных стекол Фиксировали, а часть инкубировали при 37С 0,5-1 ч без ЭФР и антител. В ряде экспериментов добавляли примаквин (этом) в концентрации 0,3 мМ, часть стекол затем отмывали от примаквина
в среде Игла с 10Ж содержанием сьгаоротки крупного рогатого скота .при 37С в течения 1ч. Затем некоторые стекла посла промывки Фиксировали, некоторые - обрабатывали НАБ 'при 4 0 в течение 3 мин для смывки ЭФР с поверхности клеток, а затем переносили в PC (с добавлением ЭФР или в его отсутствие) на Зч. Часть клеток инкубировали при 37С, часть -при комнатной температуре в атмосфере СО^.В ряда экспериментов на 3 ч добавляли 0,3 мМ примаквин.Клетки Фиксировали 4Ж Формалином в течение 10 мин, затем инкубировали 15 мин в PC с 0,2 сапонином (Негк) и окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с Флуоресцентным красителем Техав-мкі (Sina).B качества контроля к клеткам вместо моноАТ добавляли PC с 10 еодерканием сыворотки крупного рогатого скота.
б. Изучение интернализации нормального и мутантного ФРТ-Р методами непрямой иммуннофлуоресцэнции (НИФ) и с помощью
125І-ФРІ. " .
Опыты проводили на эпителиальных . клетках . яичника китайского хомячка СНО, ' полученных от доктора Хедцина
(C-H-Heldin; Lvrfwig Institute for Cancer Research, Sweden), В
норме не имеющих рецептора ФРІ и трансФицированных геном этого ,рецептора. У некоторых из таких клеток зкспрессировался нормальный рецептор {клетки СНО wt), у других - мутантний рецептор с неизмененными зкстрзцеллюлярной и трансмембранными доменами и почти полностью отсутствующим цитоплазматическим доменом (клетки СНО естм). Клотки культивировали в среде И2 с добавлением 10% эмбриональной коровьей сыворотки в С02-инкубаторе при 37С на покровных стеклах. Через 48 ч, когда клетки достигали. состояния" субконФЛюента, покровные стйкла переносили в РС.Рэкомбинантныя ФРГ, очищенный из зкспрэссионной
системы SaccharomyceB cerevieiae И охарактеризованный В
лаборатории доктора Хелдина (batman et аьдэав), добавляли к клеткам СНО - wtB концентрации 100 нг/мл и к клеткам СНО всти в концентрации 300 нг/мл на 30 мин или на 2 ч. При этом клетки инкубировали в С02-инкуОаторэ при +3?С.. В ряде экспериментов через Б мин после инкубации с ФРГ к клеткам добавляли хлороквин СОД мМ; Sigma) на 30 мин или на 2 ч.Клетки Фиксировали 4%-ным Формалином в течении 10 мин, затем инкубировали 15 мин в PC с
сапонином ( 0,2 х ; Merck), окрашивали мышиными моноклональными антителами к рзцэптору ФРТ В2, полученными и охарактеризованными в лаборатории доктора Хелдина при использовании очищенного свиного рецептора ФРІ как антигена (Rcmnstrand et аьдэво) Эти антитела связываются с экстрацеллюлярной частью рецептора. В качестве вторых антител использовали овечьи антитела против мышиных, коньюгированные о
ФЛуорЗСЦвНТНЫМ красителем Texas-red (Sigma). Эксперименты ПО
взаимодействию i-ФРТ с клетками проводили следующим образом. Клетки.высевали в пластиковые чашки, через 48 ч промывали PC и инкубировали при *37С в PC. содержащей 2 нг/мл 125г-ФРГ. По окончании инкубации клетки промывали 5 раз холодной PC. Для определения количества связанного с рецептором радиоактивного лиганда чашки обрабатывали 0,2 М уксусной кислотой с 0,5 М Had, i« 2,7 в течении 5 мин на льду и быстро промывали тем же раствором, радиоактивность обеих промывок суммировали. Для определения количества интернализированного " комплекса 1-ФРТ-рецбптор клетки после промывки холодной PC солюбилизировали в среде, содержащей 1 Ж Тритона х-юо, 10 Ж глицерина и 20 мМ hkpbs при 370 в течении 30 мин Скорость интернализации определяли как отношение интернализированного лиганда к поверхностно-связанному. В качестве контрольных экспериментов проводили инкубацию с i-ФРЇ клеток СНО, не трансФвцированных геном рецептора. Полученные в контроле значения радиоактивности вычитали из значений, полученных для клеток CHO-wt и СНО-кст.
6. Изучение локализации фосфолипззы Cyl методом непрямой двойной иммуноФлуоресценции.
К клеткам А431, выращенным на покровных стеклах, добавляли ЭРР (80 иг/мл) на 1-5 мин. В ряде" случаев ЗФР не доставлялся.
' После промывки клетки Фиксировали 0,25% раствором акролеина на Фосфатном буфере в течении 10 мин, после чего ф МИН' обрабатывали 0,5% раствором детергента Triton-x-ioo, і Часть стекол обрабатывали смесью ташпслональнш антител к ФЛ Cyl и
' моноклональных антител к ЭФР-Р 2Е9 (полученными в лаборатории
Pr-Boonstra) В ТвченИИ 1 Ч. ЧаСТЬ СТЄК0Л ТЗК0Є Жв ВрвМЯ
инкубировали в 10% сыворотке в качестве контроля. После
промывок все стекла инкубировали в течении часа в смеси вторичных антител : обезьяних против кроличьих, коньюгировашшх с Флуоресцентным красителем птс, и ослиных против мышиных, коньюгированных с другим Флуоресцентным красителем - тюте.
