Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нейробиологические аспекты регуляция гисто- и органо-типических свойств секреторных эпителиев околоушной и поджелудочной желёз .
1.1. Морфофункциональная характеристика околоушной и поджелудочной желёз 16
1.2. Морфофункциональное состояние околоушной и поджелудочной желёз при стрессорных воздействиях, особенности их регенераторных возможностей 27
1.3. О характере влияний неиромедиаторов и гипоталамических нейро-пептидов на структурно-функциональную реорганизацию эпителиев околоушной и поджелудочной желёз 31
1.4. Вопросы культивирования и пересадок околоушной и поджелудочной желёз 44
Глава 2. Материал и методы исследования.
2.1. Исследование морфофункционального состояния секреторных эпителиев околоушной и поджелудочной желёз, ядер гипоталамуса нейрогипофиза у крыс в условиях эмоционально-болевого стресса.53
2.2. Органотипическое культивирование in vivo околоушной и поджелудочной желёз по методу Ф.М.Лазаренко 54
2.3. Органотипическое культивирование in vivo околоушной и поджелудочной желёз в диффузионных камерах (ДК) 56
2.4. Органотипическое культивирование in vivo и in vitro околоушной и поджелудочной желёз при воздействии нонапептидов (окситоцина, вазопрессина), катехоламинов (дофамина, адреналина, норадреналина) и ацетилхолина 58
2.5. Методы исследования 59
Глава 3. Морфофункциональные параллели между стрессорными изменениями гипоталамо-гипофизарно-нейросекреторной системы и процессами пролиферации, роста, цитодиф-ференцировки секреторных эпителиев околоушной и поджелудочной желёз .
3.1. Исследование нонапептидергических ядер гипоталамуса и нейрогипофиза, у крыс в условиях эмоционально-болевого стресса 70
3.2. Исследование секреторных зпителиев околоушной и поджелудочной желёз с одновременной оценкой состояния нейротрансмиттерной медиации в условиях эмоционально-болевого стресса 88
Глава 4. Совместное органотипическое культивирование in vivo околоушной и поджелудочной желёз с фрагментами гипоталамуса, содержащими крупноклеточные нонапептидергические ядра, по методу Ф.М.Лазаренко .
4.1. Структурно-функциональное состояние фрагментов гипоталамуса, культивируемых in vivo по методу Ф.М.Лазаренко 150
4.2 Экспериментальное исследование эпителиев околоушной и поджелудочной желёз методом совместного культивирования in vivo по Ф.М.Лазаренко с фрагментами гипоталамуса, содержащими супраоптические или паравентрикулярные ядра ... 152
Глава 5. Сокультивирование in vivo околоушной и поджелудочной желёз с фрагментами гипоталамуса, содержащими нонапептидергические ядра в диффузионных камерах (ДК) 23 5
Глава 6. Морфологические эффекты прямого влияния гипоталамических нонапептидов (окситоцина, вазопрессина), катехоламинов (дофамина, адреналина, норадреналина) и ацетилхолина на секреторные клетки околоушной и поджелудочной желёз в условиях культивирования in vivo и in vitro 256
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 281
Выводы 311
Литературный указатель 314
- Морфофункциональное состояние околоушной и поджелудочной желёз при стрессорных воздействиях, особенности их регенераторных возможностей
- Органотипическое культивирование in vivo околоушной и поджелудочной желёз по методу Ф.М.Лазаренко
- Исследование секреторных зпителиев околоушной и поджелудочной желёз с одновременной оценкой состояния нейротрансмиттерной медиации в условиях эмоционально-болевого стресса
- Экспериментальное исследование эпителиев околоушной и поджелудочной желёз методом совместного культивирования in vivo по Ф.М.Лазаренко с фрагментами гипоталамуса, содержащими супраоптические или паравентрикулярные ядра
Введение к работе
Актуальность темы
В биологии тканей ключевой проблемой является раскрытие закономерностей гисто- и морфогенеза органов животных и человека, а также факторов, определяющих их проявления (А.Г.Кнорре, 1971; А.А.Заварзин, 1976,1985; М.3уссман,1977; С.И.Щелкунов,1958, 1977; В.П.Михайлов, Г.С. Катинас, 1984; Н.Н.Кочетов, 1986,1991; В.Д.Новиков,1999). Процессы пролиферации, роста, тканевой и клеточной дифференцировки являются одними из обязательных компонентов эмбриональных и репаративных гистогенезов, выяснение и конкретизация которых требует дальнейшего изучения.
Одними из наиболее важных факторов, определяющих и поддерживающих тканевой гомеостаз, обеспечиващих процессы адаптации висцеральных систем, считаются медиаторы вегетативной нервной системы (Д.А.Сахаров, 1974, 1979; Г.А.Бузников, 1979; В.И.Скок и др.1987) и гипоталамические нейропептиды (А.Л.Поленов,1979,1980,1981,1983; Б.В.Алёшин,1979,1987; И.Г.Акмаев, 1979,1992,1997; А.А.Стадников, 1989,1999,2001; Дж.Бернсток М.Коста, 1979). Анализ фундаментальных работ, касающихся изучения нейрогуморальной регуляции процессов клеточной репродукции, роста и дифференцировки (на примере эндокринных желёз), показал существенное значение гипоталамических нонапептидов и моноаминов в реализации тканями своих гисто- и органотипических потенций. Однако, ряд вопросов этой сложной проблемы до настоящего времени остаётся недостаточно изученным Прежде всего это касается выяснения механизмов нейроэндокринного контроля пролиферации и роста эпителиоцитов неэндокринных тканей, избирательного прямого действия этих регуляторных факторов на процессы репаративных гистогенезов. Требуют также новых
доказательств выдвинутые в концептуальном плане представлештя о немаловажной роли гипоталамических нонапептидов и моноаминов (окситоцина, вазопрессина, дофамина, норадреналина) в осуществлении тканями различного генеза своих гисто- и органотипических возможностей. Они в полной мере могут быть сопоставлены с известными утверждениями гистофизиологов об охранительно-тормозном влиянии на функции висцеральных органов окситоцина и вазопрессина, наблюдаемом особенно в стрессорных ситуациях (А.А.Поленов, 1983; Е.А.Черниговская и др., 1988; Е.Д.Бажапова и др.,1996; В.В.Кузик, Д.М.Макина, 2003). Однако в настоящее время данные рассуждения довольно противоречивы, а для экзокринных желёз полностью не исследованы.
Изучение механизмов регуляции морфогенеза и регенерации пищеварительных желёз в последние годы привлекает большое внимание исследователей (I.Dardick et al.,1990a 19906, 1993; U.Ahlgren et al.,1996; S.K.Kim et al.,2001; L.MPatterson, H. Zheng, H.R.Berthoud et al, 2002; D.S.Dichmann et al.,2002; H.Bilal et al.,2003), поскольку их знание открывает новые возможности в управлении функцией желёз в нормальных условиях, а также направленной коррекции морфогенетических процессов в условиях патологии.
Тем не менее до настоящего времени остаются недостаточно изученными нейрогуморальные факторы и механизмы их регуляторных влияний на процессы, которые лежат в основе детерминации, гистогенезов, дифференцировки и интеграции клеточных и тканевых структур пищеварительных желёз различного генетического происхождения в сравнительном аспекте.
Секреторные экзокринные клетки околоушной и поджелудочной желёз являются удобными объектами для выяснения общих закономерностей пролиферации, роста, цитодифференцировки клеточных элементов и определения границ компенсаторно-приспособительных и регенераторных
возможностей, реализованных при воздействии различных стрессорных факторов. Использование при этом комплекса методик для исследования морфологии желёз (электронная микроскопия, цито- и гистохимия, цитоспектрофотометрия, авторадиография, морфометрия), позволяет более полно судить о единстве и взаимосвязи структуры, функции и обменных процессов секреторных клеток пищеварительных желёз. Сравнение развития эпителия секреторного аппарата ротовой полости и поджелудочной железы даёт возможность подойти к анализу процесса генетической детерминации клеток и тканей. Это связано с тем, что рассматриваемые железы возникают в эмбриогенезе из двух различных зачатков. Околоушная железа развивается из эмбрионального зачатка эктодермы и относится к эпителиям эктодермальной природы, тогда как экзокринный эпителий поджелудочной железы является производным зачатка энтодермы и относится к эпителиям энтодермальной природы (Н.Г.Хлопин,1946).
Эволюция секреторного аппарата ротовой полости и секреторного экзокринного эпителия поджелудочной железы протекала в тесной связи с их функциями, которые отражали взаимоотношение организмов с внешней средой и является выражением адаптации организмов к условиям существования и, в частности, к различным условиям питания и обработки пищевых веществ (Е.Ш.Герловин, 1978). Однако в связи со спецификой условий функционирования и, по видимому, с особенностями их детерминации, филогистогенез этих двух типов желёз существенно отличается друг от друга. Так, секреторный эпителий ротовой полости подвергся значительной прогрессивной эволюции, тогда как экзокринный эпителий поджелудочной железы характеризуется большей стабильностью у позвоночных (А.Н.Северцов,1939; И.И.Шмальгаузен,1946). Анализ причин этого явления может представить интерес для изучения влияния факторов внешней среды на гистогенез тканей и рассмотреть вопросы о стойкости детерминации эпителия слюнных желёз и поджелудочной железы при
изменённых условиях существования и роль при этом регуляторних нейромедиаторных и нейроэндокриных факторов, а также межклеточных и межтканевых взаимодействий в детерминации її дифференциации клеток и тканей.
Таким образом исследование нейроэндокринной регуляции процессов гистогенеза, репаративной регенерации, диапазона компенсаторных и приспособительных возхможностей секреторных эпителиев экзокринных желёз млекопитающих является перспективным, важным направлением современной гистологии и клеточной биологии.
Настоящее исследование входит в комплексный план научно исследовательской работы Оренбургской государственной медицинской академии (номер государственной регистрации 01.9.50 006155).
Цель исследования. Установить роль її значение гипоталамических нонапептидов, нейромедиаторов и моноаминов в регуляции процессов пролиферации, роста и цитодифференцировки железистого эпителия различного генетического происхождения (околоушная и поджелудочная железы).
В связи с этим сформулирорваны следующие
Задачи исследования:
Определить характер реализации своих гисто- и органотипических свойств, реактивных и компенсаторных возможностей эпителиями околоушной и поджелудочной желёз с параллельным установлением коррелятивных связей с состоянием органной адрен- и. холинергической медиации и гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы у экспериментальных животных в условиях эмоционально-болевого стресса.
Уточнить и конкретизировать закономерности тканевых превращений эпителиев околоушной и поджелудочной желёз в условиях их культивирования в организме по методу Ф.М.Лазаренко и в диффузионных камерах.
3. Выяснить роль и значимость нейромедиаторов (дофамина,
норадреналина, ацетилхолина) и гипоталамических нейрогормонов в
регуляции репаративных гистогенезов околоушной и поджелудочной желёз в
условиях культивирования in vivo.
Установить значение нонапептидергических нейросекреторных центров гипоталамуса в реализации железистым эпителием различного генеза своих гисто- и органотипических возможностей путем совместного культивирования данных эпителиев с супраоптическими или паравентри-кулярными ядрами in vivo по Ф.М. Назаренко и в диффузионных камерах.
Определить влияние прямого воздействия нейромедиаторов и гипоталамических нонапептидов на объём адаптационных и регенераторных возможностей эпителиев околоушной и поджелудочной желёз в условиях культивирования их тканей in vivo и in vitro.
Научная новизна работы.
Впервые на основе комплексного экспериментально-гистологического анализа определён диапазон гисто- и органотипических свойств, реактивных и компенсаторных возможностей эпителия околоушной и поджелудочной желёз в сопоставлении с оценкой уровней органной адрен- и холинергической медиации, а также состояния гипоталамо-гипофизарной нонапептидергической нейросекреторной системы при действии стрессор-ньгх факторов.
Новым в исследовании является определение степени участия нейроэндокринной и периферической нейротрансмиттерной систем в поддержании тканевого гомеостаза пищеварительных желёз, в обеспечении процессов компенсации нарушенных функций при стрессорных реакциях организма.
Получены дополнительные сведения об органоспецифических особенностях эпителиосоединительнотканных взаимоотношений, детермина-ционных свойствах тканей околоушной и поджелудочной желёз в условиях
их культивирования в организме по методу Ф.М.Лазаренко и в диффузионных камерах.
Впервые определено существенное значение нонапептидергических нейросекреторных центров гипоталамуса в реализации железистым эпителием различного происхождения (эктодермального - околоушная железа) и (энтодермального - поджелудочная железа) своих гисто- и органотипических свойств.
Получены новые данные о важном значении нейромедиаторов (дофамина, норадреналина, ацетилхолина) и гипоталамических нейрогормонов (окситоцина, вазопрессина) в регуляции репаративных гистогенезов тканей исследованных желёз.
Определена дифференцированная и разнонаправленная роль гипоталамических нонапептидов и медиаторов симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы в регуляции процессов репаративных гистогенезов, дедифференцировки, репродукции, пролиферации, роста и дифференцировки секреторного эпителия пищеварительных желёз, а также обосновано положение о стойкой детерминированности их тканеспецифических свойств.
Сформулировано положение о том, что гуморальные факторы нонапептидергических ядер гимоталамуса являются регуляторами дедифференцировки дефинитивного железистого эпителия экто- и энтодермальных желёз, стимуляторами их клеточной репродукции. Данные факторы стимулируют реализацию железистыми структурами околоушной и поджелудочной желёз своих гистобластических потенций, характеризующих генетически различные эпителии и могут трактоваться как феномен дивергентного морфогенеза.
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные результаты дополняют современные представления об особенностях гистофизиологии и репаративной регенерации околоушной и
поджелудочной желёз. Прослеженные эффекты субклеточной, клеточной и тканевой реорганизации в различных по происхождению пищеварительных желёз на воздействие нейрогормонов окситоцина, вазопрессина и нейромедиаторов создают основу для более глубокого понимания роли нонапептидов как межуровневых морфогенетических факторов и нейромедиаторов симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы в регуляции гистогенезов и морфо-функциональных цитодифференцировок. Эти данные вносят существенный вклад в развитие учения о биологии тканей. В своей совокупности результаты работы открывают перспективы для последующего изучения прямого влияния нонапептидов и нейромедиаторов на процессы гибели, переживания, пролиферации, роста и цитодифференцировки клеток различных органов и тканей, в том числе и для обоснования возможного их применения в клинической практике как стимуляторов репаративной регенерации, а также обоснования методов коррекции патологических состояний в стоматологиии, гастроэнтерологии. Использование разработанного способа воздействия на процессы пролиферации и функциональной специализации железистых эпителиев при культивировании в организме и вне организма повысит эффективность научных исследований в работе экспериментальных гистологических лабораторий, в том числе и для решения частных вопросов трансплантологии.
Внедрение
Результаты работы используются в учебном процессе при изложении материала на лекциях и проведении практических занятий со студентами на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской медицинской академии, на кафедре анатомии и гистологии Оренбургского аграрного университета; на кафедре анатомии, физиологирт человека и животных Оренбургского педагогического университета, в проведении экспериментальных исследований в лаборатории функциональной морфологии клетки
Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук, в проблемной научно-исследовательской лаборатории "Нейроэндокринная регуляция гомеостазиса про- и эукариот" Южно-Уральского научного центра Российской академии медицинских наук, в радиоизотопной лаборатории Южно-Уральского научного центра Российской академии медицинских наук.
Основные положения выносимые на защиту.
Характер реализации гисто- и органотшшческих свойств, реактивных и компенсаторных возможностей эпителия околоушной и поджелудочной желёз при действии стрессорньтх факторов определяется и реализуется адекватным состоянием гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной систем и соответствующим уровнем органной адрен- и холинергической медиации.
Гистологический и цитологический анализ участия нейроэндокринной и периферической нейротрансмиттерной систем в поддержании тканевого гомеостаза пищеварительных желёз, в обеспечении процессов адаптации и компенсации нарушенных функций при стрессорньтх реакциях организма.
Факторы нонапептидергических нейросекреторных центров гипоталамуса, являются существенными в реализации железистым эпителием различного происхождения эктодермального (околоушная железа) и энтодермального (поджелудочная железа) своих гисто- и органотипических возможностей проявившихся, в условиях их культивирования с суттра-оптическими или паравентрикулярными ядрами гипоталамуса в организме по методу Ф.М.Лазаренко и в диффузионных камерах.
Нейромедиаторы (дофамин, норадреналин, ацетилхолин) и гипо-таламические нейрогормоны (окситоцин, вазопресеин) реализуют проявления элементарных процессов репаративных гистогенезов структур околоушной и поджелудочной желёз при их органотипическом культивировании в организме и вне организма.
Нейрогормоны, содержащиеся в крупноклеточных ядрах гипоталаму-
са, изученные нейротрансмиттеры являются важными факторами, которые создают оптимальные условия для осуществления гистотипической и функциональной дифференцировки, не изменяя тканевой генетической детерминации аденоцитов исследованных желёз. Апробация работы
Материалы работы доложены на ТТ съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), на научно-практической конференции морфологов Тюменской области "Компенсаторно-приспособительные механизмы внутренних органов и головного мозга в норме, патологии и эксперименте" (Тюмень, 1996), на научном совещании морфологов, посвященном 100-летию со дня рождения Н.Г.Хлопина "Гистогенетический анализ изменчивости и регенерации тканей" (С.-Петербург, 1997), на Российской научной конференции "Вопросы оперативной микрохирургии и микрохирургической анатомии" (Оренбурге 997), на Всероссийской научной конференции, посвященной 70-летию со дна рождения проф. П.В.Дунаева "Закономерности морфогенеза и регуляции тканевых процессов в нормальных, экспериментальных и патологических условиях" (Тюмень,1998), на TV Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Нижний Новгород, 1998), на 111 международном (VII) Совещании по суркам стран СНГ "Сурки Палеарктики: биология и управление популяциями" (Россия, Оренбургская обл., Бузулук,1999), на TV съезде Российских морфологов с международным участием (Ижевск, 1999), на научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения З.д.н. Р.Ф., проф. С.С.Михайлова (Москва, 1999), на научном совещании, посвященном 125-летию со дня рождения проф. А.А.Максимова (Санкт-Петербург, 1999), на V Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ульяновск, 2000), на международной конференции "Структурные преобразования органов и тканей на. этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов" (Астрахань, 2000), на 3-ем международном симпозиуме "Совре-
менные проблемы нейробиологии" (Саранск, 2001), на международной научной конференции "Экология и здоровье в XXI веке" (Ульяновск, 2001), на международной научной конференции, "Актуальные вопросы морфологии и хирургии XXI века" (Оренбург,2001), на научной конференции "Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей" (Санкт-Петербург, 2001), на VI Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Уфа, 2002), на Всероссийской конференции, посвященной 150-летию со дня рождения чл.- корр. РАН, проф. А.С.Догеля "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии" (Томск, 2002), на Международной конференции "Нейроэндокринология - 2003" (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научной гистологической конференции "Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях", посвященной памяти чл. -корр. АМН СССР, проф. Ф.М.Лазаренко (Оренбург, 2003).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 35 работ в материалах Международных, Всероссийских, республиканских научных конференций, Международных конгрессов, съездов из них 7 статей, 15 работ, 13 материалов, оформлено 1 рационализаторское предложение.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 3 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы.
Работа иллюстрирована 147 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает 765 источников, в том числе зарубежных 362.
Морфофункциональное состояние околоушной и поджелудочной желёз при стрессорных воздействиях, особенности их регенераторных возможностей
К реакциям приспособления организма к окружающей среде относится сформулированное G.Selye (1952) понятие "стресса". Этим термином обозначены неспецифические механизмы адаптации в ответ на разнообразные факторы внешней среды, которые резко увеличивают активность ГТНС и повышают продукцию АКТГ и кортикостероидов.
Следует заметить, при перенапряжении 11 НС (в условиях хронического стресса) как в самой системе нейроэндокринной регуляции, так и в регуляторно зависимых периферических органах, могут возникнуть соответствующие морфофункциональные изменения, свойственные "болезням адаптации" ( А.А.Филаретов, 1987; О. Khorram, et al., 1985; M.Parker Key et al., 2003 ). Стрессорные повреждения различных органов и систем, в том числе и гипоталамо-гипофизарной, формируются как результат чрезмерного усиления адаптивного эффекта стресса (Ф.З.Меерсон,1991).
Основой обеспечения реакции ГТНС на стрессорные факторы является нервная импульсация, которая возникает в соответствующих рецепторах, в последующем поступает в промежуточный мозг и затем воздействует на НСК гипоталамуса, в которых и происходит трансформация нервного сигнала в гормональный сигнал (Я.И.Ажипа, 1981 ). Такое преобразование в нейросекреторную активность импульсов, поступающих в гипоталамус из других отделов головного мозга, обеспечивается двойственным характером НСК, выражающимися в проявлении ими нервнопроводниковых и эндокринных свойств.
Проведенные исследования (Б.А.Фролов, А.А.Стадников, 1991, 1993; S.Terentyeva et al.,1998 ) свидетельствует о том, что блокирование (либо рассинхронизация) процессов высвобождения нонапептидов приводит к резкому ограничению их участия в развитии зашитно-приспособительских реакций животных, в частности при анафилактическом шоке, экспериментальной гриппозной инфекции, аутоиммунной патологии.
Согласно фундаментальным исследованиям (М.А.Беленький,1977; М. А.Беленький, А.Л.Поленов,1990; A.Livingstone, 1975; H.Bern, K.Lederis,1978) гипоталамические нонапептидные нейрогормоны принимают непосредственное участие в адаптивной регуляции клеточного и тканевого гомеостаза.
Стрессорные же изменения гипоталамо-аденогипофизарнных гормонов достаточно непостоянны и во многом зависят от характера стрессорного фактора. Имеются сведения о соответствующих изменениях соматотропной функции в ответ на стрессорный стимул. При этом характер этих изменений различен у грызунов и приматов (S.M.Glick,1963; S.Reichlin,1974 ). Необходимо отметить, что не всегда стрессорные эффекты у приматов вызывают подъем уровня данных гормонов, а также АКТГ или кортикостероидов (G.V.Brown, S.Reichlin,1972). У крыс и мышей при стрессе секреция соматотропина снижается (М.В.Угрюмов, 1989). Допускается возможность угнетения секреции гормона роста через конкурентное действие кортиколиберины (CRivier, W.Vale,1985 ).
С другой стороны в разнообразных стрессорных ситуациях 11 НС (в части ее нонапептидергической составляющей), как правило, дает однотипную реакцию: активацию всех своих отделов, проявляющуюся в резком уменьшении содержания нейросекреторного материала в задней доле гипофиза (И.А. Красновская, 1974; A.L.Polenov,1981; А.Л.Поленов, 1983; А.А.Стадников, Н.Н.Шевлюк, 1996; А.А.Стадников, 1999,2001). При этом содержание вазопрессина и, в меньшей мере, окситоцина в крови повышается и во много раз превышает обычные концентрации, характерные для интактных животных (Ю.О.Абельсон, 1977; М.С. Константинова, Ю.В. Наточин, 1979; M.Parker Key et al., 2003).
Степень активности 11 НС прежде всего зависит от силы и длительности действия стрессорного фактора, от исходного состояния нейросекреторных клеток (НСК). В условиях длительного действия дестабилизирующих факторов, формируется адаптогенная регуляторная недостаточность, которая может проявиться и на периферии в различных висцеральных органах (.Ф.З.Меерсон, 1991;А.А.Стадников,1999, 2001).
В условиях эмоционально-болевого стресса изменяется и состояние адренергической иннервации органов, в частности пищеварительной системы (Е.М.Крохина, Ю.Г.Скоцеляс, Е.А.Юматов, 1977; П.А.Вундер и др., 1999) и структурные изменения в органах связаны с активизацией адренергической медиации и с повышенным уровнем катехоламинов, выделяющихся в иннервируемые ткани Согласно сведениям Ю.Н.Копаева и соавт.(1974), М.М.Тендлер (1974), J.D.Balentine (1982), J.Carisson (1987), B.Peter (1995), M.Morita (2002) различные сильнодействующие экзогенные факторы (гипокинезия, электрическое раздражение гипоталамической области, радиационные влияния, нормобарическая оксигенация,) вызывают выраженные морфологические сдвиги в эпителиальной паренхиме пищеварительных желёз. При этом в гландулоцитах концевых отделов слюнных и поджелудочной желёз снижается количество секреторных гранул, в них уменьшается содержание белка и рибонуклеиновых кислот. В цитоплазме панкреатоцитов появляются разрозненные липидные включения.
Важно отметить исследования Н.К.Зенкова и др. (1999) и M.Morita (2002), показывающие влияние нормобарической оксигинации на развитие внутриклеточного окислительного стресса с дальнейшей реализацией запрограммированной гибели клеток - апоптоза. Авторы указывают на то,что что увеличивающиеся при воздействии данного стрессорного фактора в количестве цитокины, стероидные гормоны и другие соединения, индуцирующие апоптоз, стимулируют продукцию клетками активированных кислородных метаболитов или снижают содержание клеточных антиоксидантов, что приводит к повреждению дезоксирибонуклеиновой кислоты, нарушению функций митохондрий и изменению липидного состава мембран в результате активизации радикальных окислительных процессов.
Согласно сведениям В.Ф.Машанского и др. (1987), H.David (1977) ранние структурные и ультраструктурные реорганизации органелл (в ответ на различные стрессорные воздействия ) соответствуют характеру и степени определённых функциональных и биохимических клеточных изменений. Однако динамика ранних реакций клеточных органоидов при этом носит противоречивый характер и остается малоизученной.
Уровень пролиферативной активности аденоцитов слюнных желез крайне низок и не имеет чёткой локализации (Д.С.Саркисов, 1987). По сведениям Н.В.Нечаевой, В .Я. Бродского (1973) регенерация подчелюстных и околоушных желез после их повреждения выражена слабо. Восстановление нарушенных структур происходит за счет эпителиального роста протоков с образованием атипичного и функционально неполноценного регенерата, сопровождающегося усилением клеточного деления ацинарного эпителия и значительной диффузной гипертрофией клеток и ядер. Авторы при этом отмечают, что у молодых животных регенерация осуществляется за счет деления клеток (с формированием новых ацинусов), а у старых особей имеет место лишь их гипертрофия.
Следует еще раз подчеркнуть, что регенераторные процессы в поджелудочной железе отличаются сложностью и разнообразием своих проявлений. На основании радиоавтографических исследований клеточное обновление в этом органе происходит медленно (Д.С.Саркисов, 1987). При этом в качестве механизмов регенерации рассматриваются митотическое деление клеток, их полиплоидизация, гипертрофия и превращение одних клеток в другие, в частности, ацинозных в островковые.
Органотипическое культивирование in vivo околоушной и поджелудочной желёз по методу Ф.М.Лазаренко
С использованием классического метода культивирования тканей in vivo по Ф.М.Лазаренко (1959) изучались закономерности имплантационных превращений тканевых структур выбранных желёз, как при культивировании только фрагментов желёз (30 животных) (36 имплантатов), так и в сериях экспериментов по совместному культивированию тканей околоушной и поджелудочной желёз с фрагментами гипоталамуса, содержащими супраоптические (СО) (30 животных) (36 имплантатов) или паравентрикулярные (ПВ) ядра. (30 животных) (36 имплантатов). У животных реципиентов накануне имплантации производили электрическое разрушение соответствующих ядер гипоталамуса. При совместном культивировании с ядрами гипоталамуса использовали также материал, взятый от крыс доноров, предварительно находившихся в условиях длительного эмоционально-болевого стресса (30 животных) (36 имплантатов).
Взятие материала у крыс-доноров проиводился после их умерщвления под эфирным рауш-наркозом. Выделенный материал помещался в стерильную чашку Петри с охлажденной (+4 С) питательной средой 199. Отпрепарированные фрагменты органов помещались в другую стерильную чашку Петри, со свежей порцией аналогичной охлажденной средой с антибиотиком (стрептомицин) в разведении 1: 50000 ед в 1 мл. Указанная доза препарата не влияет на результаты такого рода эксперимента (З.СХлыстова, 1959), но предотвращает имплантаты от инфицирования. Полученный материал измельчался острым лезвием так, чтобы размер каждого отдельного фрагмента не превышал в своем объеме 0,5 мм . Измельченный материал смешивался с целлоидиновым "песком" в соотношении 1:2. Крысам - реципиентам под эфирным наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики, под кожу передней брюшной стенки на поверхность мышцы живота производили имплантацию полученной смеси.
В сериях опытов по совместному культивированию околоушной и поджелудочной желез с ядрами гипоталамуса к имплантированному материалу добавлялись соответствующие фрагменты гипоталамуса. После эвтаназии крыс-доноров быстро вскрывалась полость черепа, извлекался головной мозг и помещался в стерильную чашку Петри с охлажденной до +4 С средой 199. Выделение крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса производились при помощи микроскопа МБС-9, используя стереотаксические карты (Я.Буреш с соавт.,1962). Гипоталамус разрезался фронтально, ориентируясь по перекресту зрительных нервов. Затем глазными ножницами клиновидно вырезались небольшие фрагменты в области залегания супраоптических (СО) и паравентрикулярных (ПВ) ядер. Извлеченные фрагменты гипоталамуса помещались в другую стерильную чашку Петри с питательной средой 199. Для контроля на каждую стадию опыта вместо участков гипоталамуса помещались фрагменты лобных долей конечного мозга тех же крыс-доноров. Для оценки правильности выделения гипоталамических ядер проводился выборочный гистологический анализ взятого для трансплантации материала и оставшихся после выделения ядер частей гипоталамуса.
В работе проведены серии опытов по исследованию экзогенного введения в область имплантатов нейромедиаторов (дофамин, адреналин, норадреналин ацетилхолин) (90 животных) (108 имплантатов), гипоталамических нонапептидов (окситоцин) (30 животных) (36 имплантатов). Дофамин вводился в дозе 0,2x10"4 мг, адреналин гидрохлорид в дозе 5х10"8 мг, норадреналин гидротартрат в дозе 0,1x10"5 мг, ацетилхолин хлорид в дозе 25x10"9 мг, окситоцин 0,5x10"5 ME на массу культивируемого материала (5 мг) согласно рекомендациям И.П.Западнюка и др. (1983) и М.Д.Машковского (1972). У каждого животного-реципиента во всех вариантах опытов было сформировано по 2 имплантата. Прооперированных животных содержали в стандартных условиях вивария. В каждой серии опытов взятие материала осуществляли через 1,3, 6, 8, 10, 15 суток от начала имплантации. Имплантаты выделялись, не нарушая целостности их наружной соединительнотканной капсулы.
Исследования проведены про на 240 крысах. Контрольное культивирование проведено на 30 животных (36 имплантатов). ДК изготавливались из полихлорвиниловых капсул на основе модификации методов G. Algire et al. (1954), Т.ПЕвгеньевой (1983,1994), Э.И.Дедкова (1995,1996). Наша модификация ДК (С.Д.Валов, 1998) .использовалась в настоящей работе на основе рацпредложения N1241, выданного 23.10.98 г. Оренбургской государственной медицинской академией. При этом применялись миллипоровые фильтры фирмы "Synpor" с величиной пор 0,3 мкм. В полость камеры помещались 3-4 фрагмента околоушной или поджелудочной желез (размером по 3 мм ). Камера закрывалась плотно с двух сторон крышками с фильтрами. Готовые камеры помещались в стерильную чашку Петри со средой 199. Крысам-реципиентам под эфирным наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики производили подкожную имплантацию по две диффузионной камеры.
Исследование секреторных зпителиев околоушной и поджелудочной желёз с одновременной оценкой состояния нейротрансмиттерной медиации в условиях эмоционально-болевого стресса
Целью настоящего раздела исследования явилось определение диапазона гисто- и органотипических свойств, реактивных и компенсаторных возможностей секреторного эпителия околоушной и экзокриннои части поджелудочной желез с параллельной оценкой уровней адрен- и холинергической медиации исследуемых органов при действии стрессор-ных факторов.
Установлено, что у интактных животных секреторные клетки ацинусов околоушной слюнной железа выделяют секрет, в составе которого определяются белки, гликопротеиды и гликозоаминогликаны. Гландулоциты концевых отделов имеют структуру, характерную для сероцитов. На основании гистохимических данных, было показано, что секреторные гранулы железистых клеток дают интенсивную реакцию на суммарный белок и слабую - на ШИК- позитивные субстраты (рис. 10,11). В базальной части секреторных клеток определяется хорошо развитая гранулярная эндоплазматическая сеть, на рибосомах которой идет синтез секреторного продукта, попадающего затем в цистерны и везикулы пластинчатого комплекса. В последнем происходит структурное оформление секреторных гранул, сопряжённое с синтезом углеводного компонента.
Ядра сероцитов имеют овальную форму. Они могут располагаться в центральной или базальной части клетки в зависимости от фазы секреторного цикла. Количество митохондрий в клетках невелико. Они чаще всего располагаются вблизи гранулярной эндоплазматической сети (рис.12) и комплекса Гольджи.
Околоушная железа интактной крысы. Фиксация: жидкость Буэна Окраска: реакция по методу Даниэлли Увеличение: об. 90, ок. 10 а - концевые отделы Околоушная железа интактной крысы. Фиксация: жидкость Буэна Окраска: перйодат-ШИФФ- реакция Увеличение: об. 90, ок. 10 а - концевые отделы Рис. 12 Околоушная железа интактной крысы. Железистая клетка (сероцит) белкового концевого отдела.
В апикальной части клеток располагаются секреторные гранулы, по мере созревания изменяющие свою структуру и форму. Зрелые гранулы имеют средние размеры, округлую форму и умеренную электронную плотность (рис.13). Вокруг железистых клеток концевых отделов определяются миоэпителиальные клетки, имеющие уплощенную, звёздчатую форму, контактирующие с базальной мембраной. Ядра миоэпителиоцитов уплощенные, в околоядерной их цитоплазме сконцентрированы мембранные органеллы. В цитоплазме миоэпителиальных клеток идентифицированы продольно ориентированные миофиламенты.
Внутридольковые выводные протоки околоушной железы чётко дифференцируются на вставочные и иссчерченные. Вставочные отделы образованы кубическими или призматическими клетками, окружёнными миоэпителиоцитами, имеющими диффузную пиронинофилию. В цитоплазме кубических клеток слабо развиты гранулярная эндоплазматическая сеть и пластинчатый комплекс Гольджи. На их боковых поверхностях определяются комплексы межклеточных соединений по типу интердигитаций.
Исчерченные протоки образованы светлыми, темными, мио-эпителиальными. Характерной особенностью светлых и тёмных эпителиоцитов являются инвагинации плазмолеммы в базальной части клеток. Между складками цитолеммы располагаются большое число митохондрий.
Нервные волокна в железе располагаются в соединительной ткани вокруг концевых отделов и выводных протоков. В адренергических нервных терминалях определено присутствие моноаминов, которые имеют изумрудно-зеленую люминесценцию по ходу варикозных расширений (рисЛ5). Уровень содержания моноаминов составлял 3,5±1,4 условных единиц шкалы измерительного регистрирующего устройства спектро-фотометрической приставки. По спектральному анализу в группе флюоресцирующих катехоламинов преобладает норадреналин. В холинергических нервных волокнах гистохимическим методом обнаруживается ацетилхолинэстераза, которая имеет визуально низкий уровень активности около ацинусов и более высокий - вокруг вставочных и особенно исчерченных выводных протоков (рис.16).
Экзокринная часть поджелудочной железы интактных животных образована концевыми отделами (ацинусами) и системой выводных протоков, выстланных однослойным однорядным эпителием. Концевые отделы формируют призматические секреторные клетки, в которых выделяются базальная (гомогенная) и апикальная (зимогенная) части. Базальный полюс панкреатоцитов даёт интенсивную реакцию на рибонуклеиновые кислоты. Секреторные клетки имеют округлое ядро с хорошо выраженным ядрышком. В их апикальной части располагаются секреторные гранулы. Гистохимический анализ зимогенных гранул показал высокое содержание суммарного белка и низкий уровень определения ШИК-позитивных субстратов по сравнению с гландулоцитами околоушной железы .
Экспериментальное исследование эпителиев околоушной и поджелудочной желёз методом совместного культивирования in vivo по Ф.М.Лазаренко с фрагментами гипоталамуса, содержащими супраоптические или паравентрикулярные ядра
Необходимо сразу отметить, что характер основных структурно-функциональных превращений железистого эпителия исследованных пищеварительных желёз был однотипен. С другой стороны, исходя из целевой установки настоящей работы, мы сочли целесообразным прежде чем перейти к изложению фактического материала по сокультивированию фрагментов околоушной и поджелудочной желез с ядрами гипоталамуса, изложить результаты контрольной имплантации выбранных органов без добавления нейросекреторных ядер гипоталамуса.
На ранних стадиях опытов (первые 2 суток) в контрольной серии клеточные элементы эпителия и соединительной ткани околоушной железы претерпевают явления депрессии, которые морфологически проявляются в том, что цитоплазма и ядра их уменьшаются в размерах. В каждом имплантате намечается, а потом чётко идентифицируется периферическая зона, с жизнеспособными эпителиальными клетками, и центральная зона, в которой все структуры дегенерируют и распадаются. Протяжённость сохранной зоны имплантата зависит от положения фрагмента культивируемого материала по отношению к целлоидину и тканям реципиента.
Одновременно с отмиранием дифференцированных секреторных элементов миоэпителиальные клетки приходили в пролиферативное состояние. Они увеличивались в размерах, интенсивно окрашивались по Браше и охватывали снаружи дегенеративно изменённые секреторные элементы альвеол, клетки вставочных отделов и слюнных трубок (рис.57). В цитоплазме миоэпителиальных клеток уменьшалась численность органелл и исчезали миофиламенты. Клетки начинали мигрировать в отёчную соединительную ткань имплантата.
Клетки вставочных отделов слюнной железы оказывались более стойкими к условиям имплантации, чем секреторные клетки альвеол. Они набухали и приобретали малодифференцированный вид. Пришедшие в пролиферативное состояние клетки перемещались вдоль вставочного отдела и нагромождались на его свободном конце, обращенном к межцеллоидиновой прослойке.
Клетки слюнной трубки дегенерируют, но в цитоплазме некоторых из них ещё видна специфическая исчерченность. Необходимо отметить, что значительная часть эпителиальных клеток с базальной исчерченностью погибает. Миоэпителиальные клетки слюнных трубок также как и в альвеолах набухают и принимают вид пролиферирующих клеточных элементов.
В центральной части имплантата располагаются секреторные клетки со светлой цитоплазмой и пикнотическими ядрами. В цитоплазме клеток определяются участки секвестрации, разрушенные органеллы, большое количество лизосом и аутофагосом. В ранние сроки культивирования, наряду с дегенеративными процессами и гибели части гландулоцитов донорского материала, происходит дегрануляция сохранившихся секреторных клеток, которые располагаются преимущественно в периферической зоне имплантата (табл.6). Процесс утраты гранул на стадии 1-3 суток культивирования у различных аденоцитов околоушной железы не одинаков. В одних гландулоцитах наблюдается наибольшая по степени выраженности и более ранняя по времени дегрануляция. Клетки увеличиваются в размерах, цитоплазма их просветляется. В ней появляются светлые вакуоли крупных размеров. В других клетках этот процесс менее выражен. Цитоплазма клеток дают слабую диффузную реакцию на РНК и суммарный белок. В цитоплазме железистых клеток заметно уменьшается интенсивность включения радиоактивного лейцина (рис.58), что свидетельствовало о уменьшении синтетических процессов белковых субстратов. Ядерно-цитоплазматические отношения увеличивались (табл.7).
При электронномикроскопическом изучении в ядрах подобных клеток отмечается увеличение гетерохроматиновых зон, уменьшение размеров ядрышка, а в кариолемме уменьшение количества поровых комплексов. В цитоплазме уменьшается число рибосом на мембранах гранулярной эндоплазматической сети. Отмечались редукция эндоплазматической сети и пластинчатого комплекса Гольджи. В цитоплазме увеличивается число свободных рибосом.
В итоге дедифференцированные гландулоциты концевых отделов, миоэпителиоциты и клетки вставочных протоков активизировались и начинали пролиферировать, а образовавшийся эпителиальный регенерат врастал в молодую соединительную ткань. Нами отмечено увеличение включения Н3 - тимидина в ядрах камбиальных клеток (рис.59).
На стадии 4-6 суток активизированные камбиальные элементы митотически делятся, формируют эпителиальные тяжи, которые разрастаются массам. Перемещение клеток с образованием тяжей осуществляется по собственной соединительной ткани пересаженного фрагмента слюнной железы по направлению к источникам раздражения -целлоидину или некротическим массам. Перемещение клеток с образованием тяжей осуществляется по собственной соединительной ткани пересаженного фрагмента слюнной железы и по сгусткам фибрина, образуя многослойное структуры. Кроме разрастаний эпителия (рис.60) по межцеллоидиновым прослойкам соединительной ткани в виде тяжей, часть пролифератов формирует кисты.
Все клетки выросшего пласта однородны и недифференцированны. Они имеют неправильную форму и окращиваются основными красителями. Ядра овальные. В цитоплазме отмечаются неразветвлённая эндоплазмати-ческая сеть, уменьшенные в размерах пластинчатый комплекс и митохондрии.
