Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Межвидовая ксенотрансплантация 8
1.2.Лечение нейродегенеративных заболеваний методом трансплантации... 14
1.3. Восстановительный потенциал центральной нервной системы и связанные с ним проблемы трансплантологии 21
1.3.1.Формирование глиального рубца и его влияние на регенерацию аксонов 21
1.3.2. Характеристика методов, направленных на улучшение восстановительных свойств ЦНС при повреждениях 23
1.4. Нейротрофические факторы (НФ) 27
1.4.1. Понятие и классификация нейротрофических факторов 31
1.4.2. Общая характеристика лигандов семейства GDNF(GFLs) 32
1.4.3. Характеристика рецепторов лигандов семейства GDNF 34
1.4.4. Индуцируемая GDNF RET-зависимая передача сигнала внутрь клетки 36
1.4.5. Индуцируемая GDNF RET-независимая передача сигнала внутрь клетки 37
1.4.6. Взаимодействие сигнального пути, индуцируемого GDNF, с сигнальными путями других факторов 40
1.4.7. Экспрессия и физиологические функции GDNF 42
1.4.8. Защитные и восстановительные свойства GDNF 44
1.4.9. Общая характеристика лигандов семейства NGF 47
1.4.10 Характеристика фактора роста нервов 48
1.4.11. Структура фактора роста нервов 52
1.4.12 Рецепторы NGF v -. 55
1.4.13. Сигнальные каскады, запускаемые NGF 59
1.4.14. BDNF как член семейства NGF 60
1.4.15. Внутриклеточные каскады, активируемые BDNF 62
1.4.16. Исследование мышей, нокаутированных по гену BDNF 64
1.4.17. Свойства BDNF, влияние на дифференцировку нейронов 65
1.4.18. Влияние нейротрофических факторов на поведение и память 67
1.4.19. Нейротрофические факторы при нейродегенеративных заболеваниях..69
1.5. Белки теплового шока (Hsp)
1.5.1. Классификация Hsp 73
1.5.2. Факторы индукции Hsp 76
1.5.3. Регуляция экспрессии белков семейств Hsp 78
1.5.4. Локализация и свойства Hsp 87
1.5.5. Hsp70 л-...ІІУ 88
1.5.6. Структурно-функционалный анализ белков семейства Hsp 70 89
1.5.7. Hsp и апоптоз 99
1.5.8. Стресс, адаптация и белки теплового шока 100
1.5.9. Перспективы использования системы Hsp в медицине 103
1.5.10. Экспрессия шаперонов в головном мозге 104
2. Материалы и методы 106
2.1. Методы 106
2.1.1. Рестрикция плазмидной ДНК 106
2.1.2. Электрофорез в агарозном геле 106
2.1.3. Выделение фрагментов ДНК из геля 106
2.1.4. Лигирование 107
2.1.5.Приготовление компетентных клеток 107
2.1.6. Трансформация компетентных клеток плазмидами 108
2.1.7. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli в малом объеме 108
2.1.8. Выделение плазмидной ДНК из E.coli в большом объеме 109
2.1.9.Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну) ПО 2.1.10. Анализ ДНК-последовательности Ill
2.1.11.Конструкции 112
2.1.12.Метод инъекций 114
2.1.13. Выведение линий 114
2.1.14. Гибридизация in situ на целых эмбрионах 119
2.1.15. Очистка плазмид для введения в культуру клеток Млекопитающих... 121
2.1.16. Введение плазмиды в клетки линии НЕК293 при помощи ExGen 500 Transfection Reagent 121
2.1.17. Введение плазмиды в ЭСК мыши (линия R1) методом электропорации 122
2.1.18. Выделение суммарного препарата РНК 122
2.1.19. Проведение электрофореза РНК 123
2.1.20. Нозерн-блот гибридизация 123
2.1.21. Электрофорез в ПААГ...: 125
2.1.22. Вестерн-блот гибридизация 125
2.1.23. Культивирование клеток линии НЕК293 126
2.1.24. Получение мышиных эмбриональных фибробластов 126
2.1.25. Желатинизирование культуральныхчашек 127
2.1.26. Обработка МЭФ митомицином С 127
2.1.27. Культивирование ЭСК мыши линии R1 128
2.1.28. Проведение трансплантации 128
2.1.29. Получение срезов мозга 129
2.1.30. Иммуноцитохимический анализ 129
2.1.31. Количественная оценка величины глиального рубца 130
2.1.32. Ко-культивация фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей gdnf 130
2.1.33. Получение первичной:культуры КлетоК В.те1апоаз1ег, трансгенных по гену ngf
2.2.1. Реактивы 131
2.2.2. Растворы, среды 132 і л t J)!
2.2.3. Вектора 139
2.2.4. Праймера 139
2.2.5. Антитела 139
2.2.6. Линии клеток 140
3. Результаты 140
3.1. Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по нейральному гену млекопитающих 140
3.2. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на трансгенные клетки 140
3.3. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при шжультивации 160
3.4. Влияние неироэктодермы трансгенных линий на окружающие клетки при ксенотрансплантации 170
3.5. Влияние белка теплового шока HSP70 дрозофилы на образование рубца при трансплантациях 180
3.6. Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих 184
3.7. Использование полученного вектора LP1, содержащего п/р область гена hsp70 дрозофилы .и маркерный ген gfp, в культурах клеток и в целых организмах : : 192
3.8. Получение конструкции для экспрессии ngf в клетках млекопитающих 199
3.9. Изучение влияния гиперэкспрессии ngf при ко-культивации
3.10. Получение конструкции для экспрессии gdnf в клетках млекопитающих 209
3.11. Исследование влияния гиперпродукции белка GDNF на трансгенные клетки 216
3.12. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf при ко-культивации 223
3.13. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnfna образования глиальной
ткани при трансплантациях 224
4. Обсуждение результатов 229
Выводы 241
Список литературы
- Характеристика методов, направленных на улучшение восстановительных свойств ЦНС при повреждениях
- Электрофорез в агарозном геле
- Количественная оценка величины глиального рубца
- Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих
Введение к работе
Актуальность темы
Известно, что нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона или болезнь Альцгеймера и др., а также ишемический инсульт и ему подобные травматические нарушения мозговых тканей - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте. Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект. Особенно перспективна возможность использования региональных стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении. Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации.
Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина. В глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга. Это может привести к его полному отмиранию уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю. Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глио-мезодермальной капсулы (Корочкин, 2000).
Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии. В разрабатываемых конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов. В состав этих конструкций не должны входить вирусные элементы.
Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на приживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии. Этому и посвящена настоящая работа.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является: поиск путей управления дифференцировкой стволовых клеток, использование трансгенных клеток для трансплантаций в мозг млекопитающих, а также улучшения приживляемости трансплантата. Центральным был вопрос исследования с помощью методов молекулярной генетики и клеточной биологии, возможных способов предотвращения формирования рубцовой ткани при нейрохирургических операциях.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Получить трансгенные линии дрозофилы, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий.
2. Изучить влияние экспрессии чужеродного нейрального гена на трансгенные клетки дрозофилы.
3. Исследовать воздействие полученных трансгенных клеток на клетки или ткани млекопитающих при кокультивации.
4. Провести ксенотрансплантацию и проанализировать влияние трансгенных клеток, экспрессирующих нейротрофические факторы, на приживляемость трансплантата и на образование глиального рубца.
5. Изучить возможность использования промотора гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 в клетках млекопитающих в качестве управляющего элемента трансгенов.
6. Получить трансгенные линии НЕК293, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий.
7. Провести трансплантацию клеток трансгенной линии НЕК293 в мозг крысы. Проанализировать влияние нейротрофического фактора на образование глиального рубца.
Положения, выносимые на защиту:
1. Нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку клеток млекопитающих нейрального происхождения при их совместном культивировании.
2. Смешанная ксенотрансплантация эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена hsp70 дрозофилы стимулирует дифференцировку клеток крысы в нейральном направлении трансплантируемых клеток на границе трансплантат – мозг реципиента.
3. Ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат – ткани мозга реципиента.
4. Обнаружена позитивная роль белков теплового шока HSP70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях.
5. Обнаружено, что трансдуцированный промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 активизируется в клетках млекопитающих при температуре 39оС, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки.
6. Обнаружено, что трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижают образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс.
7. Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у эмбриональных спинальных ганглиев и у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf .
Научная новизна и практическая ценность работы
Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих перспективность применения аутологичных стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, публикации, посвященные практическим вопросам подготовки и клинического применения этих клеток немногочисленны. Данная работа поможет перевести клиническое применение новых клеточных технологий при лечении нейродегенеративных заболеваний на систематическую научную основу. В данной работе предлагается новый подход к лечению нейродегенеративных заболеваний посредством трансплантации клеток носителей нейротрофических факторов. Были разработаны различные способы генноинженерных манипуляций с клетками и трансплантаций полученного материала в мозг.
1. Создана оригинальная модель доставки нейротрофического фактора в поврежденный участок мозга млекопитающих с помощью клеток трансгенных линий дрозофилы. Экспрессия чужеродного гена, проходит лишь в промежутке времени, определенном укороченным жизненным ресурсом клеток дрозофилы в чужеродной ткани млекопитающих. При этом данные клетки –носители не склонны к делению. В результате был разработан метод трансплантации смеси стволовых клеток человека и дифференцированных нервных клеток трансгенных линий дрозофилы, несущих ген фактора роста под контролем промотора гена теплового шока.
2. Обнаружено, что присутствие в ко-трансплантанте нейральных эмбриональных клеток дрозофилы, продуцирующих нейротрофический фактор, противодействует образованию глиального рубца. Данный результат имеет значение для разработки терапевтических методов борьбы с глиозом
3. Предложен новый невирусный промотор для регуляции экспрессии гена введенного в клетки реципиента. Возможность использования невирусных регулируемых структур позволяет включать активность чужеродных генов лишь в определенные необходимые промежутки времени, что важно для безопасности их клинического применения.
4. Для ряда заболеваний необходима постоянная экспрессия определенного гена. Для таких случаев была создана модель на основе родственных человеку трансгенных клеток, способных экспрессировать чужеродный ген постоянно. Использование человеческих клеток обеспечивает длительное их переживание и постоянное продуцирование терапевтического белка.
Полученные результаты имеют практическое и теоретическое значение. Появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, а также открывается возможность выработки ряда практических рекомендаций по применению стволовых и прогениторных клеток в хирургии и трансплантологии.
Предлагаемые подходы к фундаментальным исследованиям стволовых клеток являются оригинальными и основываются на предложении новой техники анализа и управления поведением стволовых клеток.
Апробация работы
Основные результаты докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах, в том числе на 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, 1999, 41th Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, 2000, 6thEast European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, Moscow-Puschino, 2000, Conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS, Novosibirsk, 2000, Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine, Egypt, Hurtada, 2004г, . ELSO, Nice, 2004, Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2005.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Характеристика методов, направленных на улучшение восстановительных свойств ЦНС при повреждениях
Были предложены следующие методы, направленные на улучшение восстановительных свойств центральной нервной системы при травмах: супрессия синтеза структурных белков астроцитов, локальное удаление астроцитов из места, повреждения, использование факторов, ингибирующих астроглиозис, влияние на белки внеклеточного матрикса, ассоциированные с глиальным рубцом. Ниже будут рассмотрены эти методы и обсуждены их достоинства и недостатки.
Супрессия синтеза белков астроцитов. При развитии астроглиозиса наблюдается увеличение экспрессии двух структурных белков астроцитов -глиального кислого фибриллярного белка и виментина. Было предположено, что снижение концентрации этих белков приведет к уменьшению глиального рубца, образующегося при повреждениях в пределах центральной нервной системы.-Была получена-линия-трансгенных мышей, лишенная гена gfap (gfap-/-). Однако трансгенные- мыши демонстрировали нормальный глиальный ответ на повреждения центральной нервной системы. Кроме того, было показано, что аксоны не способны прорастать через поврежденную зону (Pekny et.al., 1997, Wang et.al., 1997). У трансгенных мышей, лишенных гена І-виментина (vimentin- -/т)- а it также у- мышей с двойным нокаутом (отсутствуют гены gfap и виментина), наблюдается нормальный реактивный глиоз в ответ на травму ЦНС. К сожалению, репаративные свойства нервной ткани в данных случаях изучены не были (Pekny et.al., 1999). Однако можно предположить, что-виментин и GFAP не оказывают влияния на репаративные свойства ЦНС, поскольку они не являются белками поверхности астроцитов, и не показано их влияние на синтез предполагаемого ингибитора регенерации ЦНС — хондроитинсульфатного протеогликана.
Удаление астроцитов из места повреждения. Было предположено, что удаление глиальных клеток из травмированного участка предотвратит формирование глиального рубца. Одним из методов воздействия на астроциты является введение аналога глутамата L-a-амино-адипата (L-AAA), который оказывает токсическое действие на эти клетки и в то же время не влияет на выживаемость нейронов (Khurgel, 1996). Показано, что введение L ААА способствует образованию вокруг очага поражения зоны, свободной от астроцитов, которая сохраняется в течение семи дней. В пределах этой зоны снижена CSPG-иммунореактивность по сравнению с контролем (McGraw etal., 1928).. : Другой метод воздействия на астроциты — создание трансгенных мышей, несущих под gfap - промотором ген тимидин киназы герпеса (Delaney, 1996, Bush, 1998). При реактивном глиозе в ответ на повреждение происходила активация этого промотора, что приводило к синтезу тимидин киназы. В очаг .иповреждения («вводили ганцикловир, который под воздействием синтезируемого фермента превращался в цитотоксическое вещество, убивающее астроциты. При использовании этой модели было показано, что в очаге повреждения повышается число нейрофиламент-М позитивных аксонов по сравнению с диким типом. Можно заключить, что микроокружение, возникающее при удалении астроцитов из травмированной области, способствует прорастанию аксонов. Однако следует отметить, что в поврежденной области, свободной от астроцитов, не было обнаружено тел нейронов. Кроме того, у трансгенных мышей не происходило восстановление гемато-энцефалического і барьера в месте травмы, в то время как у животных дикого типа он восстанавливался в течение 14 дней (Bush et.al., 1998). Поскольку астроциты играют важную роль в поддержании гомеостаза ЦНС в целом, то даже их локальное удаление может привести к нежелательным последствиям.
Использование факторов, ингибирующих астроглиозис. Одним из факторов, влияющих на астроглиоз, является TGF-J31. TGF-pi участвует во многих процессах, протекающих в ЦНС, в том числе в клеточной пролиферации и дифференцировке. Имеются данные, что при нейротравме экспрессия TGF-pl и его рецепторов колокализуется с микроглией в очаге поражения (McTigue et.al., 2000). Введение TGF-pi в поврежденный кортекс вызывает сильный астроглиоз, сопровождающийся экспрессией фибронектина, ламинина и GFAP. При использовании антител к TGF-pi синтез этих белков снижался (Logan et.al., 1999). Однако снижение уровня функционально активного TGF-pi может привести к нежелательным последствиям, поскольку он является фактором выживания мотонейронов.
Описаны попытки применения интерлейкина-10 (IL-10) при повреждениях центральной, нервной системы. IL-10 При введении в кортекс супрессирует ответ макрофагов И микроглии на травму, снижает реактивный глиоз (Balasingam et.al., 1996).
Влияние на белки внеклеточного матрикса, ассоциированного с глиальным рубцом. Существует несколько способов влияния на белки внеклеточного матрикса, ассоциированного с глиальным рубцом. Один из них - прерывание синтеза этих белков. В экспериментах in vitro было продемонстрировано, что использование Р-ксилозида (ингибитор синтеза протеогликанов) эффективно снижает синтез CSPG (Fichard et.al., 1991). Однако использование і этого ингибитора синтеза протеогликанов опасно из-за проявляющегося в большинстве случаев токсического эффекта.
В состав внеклеточного матрикса, ассоциированного с глиальным рубцом, входит коллаген типа IV. Известно, что 2,2 - дипиридин (DPY) препятствует формированию тройной спирали коллагена. Были проведены работы, в которых! в-очаг-поражения нервной ткани вводили DPY (Stitchel et.al., 1999, Weidner et.al., 1999). Показано уменьшение синтеза коллагена типа IV. Однако процесс восстановления аксонов зависел от расположения очага поражения. Таким образом, разные популяции нейронов требуют различных условий для осуществления процесса регенерации. При использовании DPY также следует учитывать, что коллаген типа IV является структурным компонентом кровеносных сосудов.
Использование ингибиторов образования внеклеточного матрикса, ассоциированного с глиальным рубцом, возможно только в небольшой промежуток времени после нанесения травмы.
В случае, если формирование рубца уже произошло, возможно использование специфических ферментов для расщепления компонентов внеклеточного матрикса. Был проведен ряд исследований in vitro и in vivo (Zuo et.al., 1998; Lemons et.al., 1999). Тем не менее, полученные данные неоднозначны, регенерация поврежденных аксонов наблюдалась не во всех случаях.
Электрофорез в агарозном геле
Эксперименты по воздействию GDNF на клетки нервной системы можно условно подразделить на два класса: работы, направленные на изучение защитной функции этого фактора и исследования его восстановительных свойств после повреждений различной этиологии. Надо отметить, что четкое подразделение не всегда возможно. Например, при введении GDNF незадолго до повреждения, наблюдаемый эффект может быть отнесен как на счет защитной, так и восстановительной функций. Кроме того, такие эксперименты можно разделить на группы в зависимости от эффективности GDNF при повреждениях того или иного происхождения (механические, свободными радикалами или нейротоксинами, приводящими к их образованию, токсическими веществами, действующими по другому пути, и другие) (Jollivet et.al., 2004).
Показано, что GDNF предотвращает и уменьшает сенсорные аномалии, развивающиеся в модели нейропатической боли, не влияя на поведение, связанное с болью у нормальных животных (Timothy et.al.,2000). GDNF уменьшает эктопические разряды в сенсорных нейронах после повреждения, что является следствием восстановления глиальным фактором поврежденных ионных каналов. Эти находки могут стать базой для использования GDNF для терапии нейропатических болей.
После перерезания медиального пучка переднего мозга у взрослых крыс дофаминергические нейроны среднего мозга подвергаются апоптозу. Через 14 дней после аксотомии количество ТН+ нейронов в черной субстанции уменьшается на 50%. Было показано, что введение GDNF через имплантированную канюлю способствует выживанию 85% поврежденных нейронов черной субстанции. При этом защитное действие GDNF не зависит от расстояния до участка повреждения. Таким образом, GDNF предотвращает, вызванные аксотомией гибель и атрофию клеток (Li et.al., 1995).
Болезнь Паркинсона характеризуется дегенерацией дофаминэргических нейронов среднего мозга. Была выдвинута гипотеза, что GDNF может предотвращать дегенерацию этих нейронов и усиливать физиологическую активность выживших клеток. Проведены успешные опыты на животных, подтверждавшие это предположение (Gash et.al., 1995; Sauer et.al., 1995; Tomac et.al., 1995; Lapchak et.al., 1997). На основании полученных результатов были проведены клинические исследования, при которых больным в течение года вводили интравентрикулярно GDNF. Однако у некоторых пациентов клинические проявления болезни не исчезли. Было также установлено, что у больных, умерших через семь месяцев после терапии, число деградировавших нейронов не уменьшилось при интравентрикулярном введении GDNF. Таким образом, было заключено, что интравентрикулярное введение GDNF не является оптимальным в случае человека, и требуется разработка других путей доставки этого нейротрофического фактора к месту деградации нейронов (Kordower et.al., 1999).
Все вышеизложенное относится к эффектам экзогенного GDNF, введенного до или после повреждения в мозг животного. Однако существуют данные об эндогенной экспрессии GDNF и его рецепторов в ответ на повреждения. Так, экспрессия мРТПС GDNF и GFR-al обнаружена в поврежденных периферических нервах при различных нейропатиях у человека, а также при воспалительных процессах,, приводящих к демиелинизации нервов, хронической демиелинизующей полинейропатии и амилоидных полинейропатиях различного происхождения (Yamamoto, 1998). Также при периферических нейропатиях GDNF может транспортироваться ретроградно рецептор-опосредованным образом. Спинальные мотонейроны экспрессируют рецептор GDNF, а сам нейротрофический фактор синтезируется денервированной скелетной мышцей. GDNF способствует ветвлению аксонов, что является необходимым для реиннервации (Lie et.al., 1998).
Была изучена роль GDNF в развитии эпилепсии на модели киндлинга (Kokaia et.al., 1999). После индукции эпилептического припадка наблюдалось увеличение количества мРНК GDNF, NRTN и их рецепторов в различных частях мозга. Показан нейропротективный эффект GDNF по отношению к нейронам гиппокампа при транзиентной ишемии переднего мозга. При этом наблюдалось увеличение экспрессии GDNF, GFRa-1 и RET в гиппокампе, а также GFRa-2 в кортексе (Kokaia et.al., 1999).
Эти данные свидетельствуют о важной роли GDNF во взрослом организме - защите и восстановлении дифференцированных нервных клеток после повреждений.
В настоящее время наиболее хорошо изучены нейротрофические факторы, относящиеся к семейству нейротрофинов. К семейству нейротрофинов относятся фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор мозга (BDNF), нейротрофин-3, нейротрофин-4/5, нейротрофин-6 и нейротрофин-7 (Kawamoto et.al., 1999). В представленной ниже таблице сведены основные члены данного семейства . Табл. 1.3. Семейство NGF ( http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.ip )
Изучение этого семества крайне необходимо для понимания регуляции нейрональной дифференцировки в мозгу. Например, ряд работ показал, что NGF стимулирует диффернцировку и оказывает антипролиферативный эффект на опухоли нейроэндокринного происхождения (Владиченская и др., 2006). Исследование мышей с knock-out генов нейротрофинов {ngf, bdnf, nt3, nt4) показали, что отсутствие генов нейротрофинов ngf, bdnf, ntS приводит к сильному дефициту нейронов и к ранней послеродовой смерти. Отсутствие же nt4 приводит к ограниченной потери нейронов и мыши не умирают рано, то есть нейроны, зависимые от NT4, не являются критическим фактором для выживания организма в целом. Кроме того, при анализе мутантных мышей с отсутствием нейротрофиновых рецепторов, было обнаружено, что рецептор TrkA является функциональным рецептором для NGF, TrkB - для BDNF и NT4, ТгкС- для NT3. Также было обнаружено, что в отсутствии TrkC NT3 может действовать и через другие рецепторы. Дальнейшие исследования, использующие различные делеции Trk и нейротрофинов, показали, что хотя BDNF и NT4 содействуют определенным популяциям нейронов в большинстве случаев, другие нейронные субпопуляции могут поддерживаться как BDNF, так и NT4. Это свидетельствует о том, что существует эффект компенсации между нейротрофинами (Conover, 1997).
Количественная оценка величины глиального рубца
Клетки снимали с чашки или матраса: промывали версеном, затем добавляли несколько капель трипсина (0,25%) и помещали в термостат (37С) на 3 минуты. Добавляли небольшое количество среды, в которой культивировались клетки, и переносили в пробирку для центрифугирования. Также на этом этапе подсчитывали число клеток с помощью камеры Горяева.
Центрифугировали клетки со средой 5 минут, 1,5 тыс. об/мин. Супернатант сливали, к осадку добавляли небольшое количество PBS, центрифугировали 5 минут, 1,5 тыс. об/мин. Супернатант сливали, к осадку добавляли раствор плазмиды из расчета 6-7 мкг на 1 106клеток и PBS. На мишень вносили 55 мкл полученной смеси. Трансфекцию осуществляли на электропораторе СУМ4 (ИМБ РАН, Москва) при следующих параметрах -напряжение 400V, продолжительность импульса - 1,5 мс. Клетки рассевали на чашки с фидерным слоем (мышиные эмбриональные фибробласты, обработанные митомицином) с соответствующим количеством среды.
Выделение суммарного препарата РНК проводили при помощи реактива Tri Reagent («Sigma»).
Клетки снимали с чашки или матраса: промывали версеном, затем добавляли несколько капель трипсина (0,25%) и помещали в термостат (37С) на 3 минуты. Добавляли небольшое количество среды, в которой культивировались клетки, и переносили в пробирку для центрифугирования. Также на этом этапе подсчитывали число клеток с помощью камеры Горяева.
Центрифугировали клетки со средой 5 минут, 1,5 тыс. об/мин. Супернатант сливали, к осадку добавляли небольшое количество PBS, центрифугировали 5 минут, 1,5 тыс. об/мин. Супернатант сливали, к осадку добавляли необходимый объем Tri Reagent из расчета 1 мл на 1-5 106 клеток и тщательно перемешивали. Затем приливали 0,2 мл хлороформа на каждый миллилитр использованного Tri Reagent, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Затем центрифугировали 15 мин, 12 тыс. об/мин и отбирали верхнюю фазу в чистую пластиковую пробирку объемом 1,5 мл. Добавляли 0,5 мл изопропанол на каждый мл использованного Tri Reagent, перемешивали, выдерживали при комнатной температуре 5 мин и центрифугировали 10 мин, 12 тыс. об/мин. После этого удаляли супернатант, осадок промывали не менее чем 1 мл 75% этилового спирта (на каждый мл использованного Tri Reagent) и центрифугировали образец 5 мин, 7,5 тыс. об/мин. Удаляли супернатант, осадок высушивали и растворяли в 20 мкл дистиллированной воды, обработанной DEPC (см. п. 2.2.2, о).
Подготовка РНК к нанесению на гель. К одному объему 5х буфера для нанесения (см. п. 2.2.2, ш) РНК добавляли 4 объема раствора РНК и перемешивали. Инкубировали 5 мин при 65 С, охлаждали на льду.
Проведение электрофореза. Подготовленные пробы наносили на 1,2% агарозный гель (см. п. 2.2.2, т), предварительно уравновешенный в соответствующем буфере для проведения электрофореза в течение 30 мин. Длительность электрофореза - 1ч при напряжении 80В. После окончания процесса гель промывали водой, свободной от РНКаз, и помещали гель на 20 мин в 0,01 М NaOH/3 М NaCl.
Перенос на мембрану. Наполняли контейнер буфером для переноски на мембрану (п. 2.2.2, п), сверху на контейнер устанавливали кусок плексигласа, на который помещали отрезок ватмана ЗММ , по размерам превышающий гель. Концы ватмана опускали в буфер для переноски. На влажный ватман помещали гель лунками вниз, сверху - нейлоновую мембрану HybondN+ фирмы Amersham, предварительно смоченную деионизированной водой и выдержанную 5 мин в 10х SSC. Гель окружали пленкой Saran Wrap. На мембрану помещали два листа ватмана ЗММ, смоченных в буфере для переноски, стопку полотенец из фильтровальной бумаги (высота 5-8 см) и груз 400-500 г. Перенос осуществляли в течение ночи. Затем на мембране отмечали карандашом положение лунок геля, мембрану переносили в 300 мл 6х SSC, инкубировали 5 мин при комнатной температуре на шейкере. После этого мембрану высушивали.
Предгибридизация. Мембрану инкубировали в 15 мл предгибридизационного буфера (п. 2.2.2, п)в течение 1 часа при 65 С.
Приготовление зонда. Радиоактивно меченый зонд получали с помощью набора реагентов, предоставляемого фирмой «Fermentas». В пластиковую пробирку объемом 1,5 мл помещали ДНК-матрицу (100 нг), 10 мкл раствора гексануклеотидов в пятикратном буфере и деионизированную воду до 40 мкл. Выдерживали 5 мин на кипящей водяной бане, охлаждали на льду. Добавляли 3 мкл смеси A (mix А, содержит 0,ЗЗмМ dGTP, 0,ЗЗмМ dCTP, 0,ЗЗмМ dTTP), 6 мкл[а-32Р]- dATP (50 мкКи), 1 мкл (1 и) фрагмента Кленова ехо". Инкубировали 10 мин при 37С, после этого добавляли 4 мкл смеси дезоксирибонуклеотидов (содержит 0,25мМ dGTP, 0,25мМ dTTP, 0,25мМ dCTP) и выдерживали 5 мин при 37С. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,5М EDTA, рН 8,0.
Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих
Открытие стволовых клеток в нервной ткани стало важным событием в современной неврологии. Оно вызвало переоценку целого ряда устоявшихся представлений, особенно для восстановительных процессов в центральной нервной системе. Стволовая клетка в нервной ткани характеризуется теми же основными свойствами, что и стволовая клетка вообще, а именно: сохранением способности к делению, которая утрачивается на стадии нейробласта, и плюрипотентностью, т.е. возможностью дифференцироваться в различных направлениях (вероятно не только в нейральном). Стволовые нервные клетки можно идентифицировать по молекулярным маркерам, которые отражают последовательные стадии их развития: это нестин - для стволовой клетки, виментин - для клетки-предшественника, бета-тубулин - для нейробласта, GFAP (кислый глиальный фибриллярный белок) - для клетки, развивающейся по глиальному направлению и ряд других маркеров. Наличие таких маркеров позволило выявить популяционную гетерогенность стволовых клеток. Например, типичное процентное распределение специфических иммуногистохимических маркеров в популяции фетальных стволовых нервных клеток человека следующее: нестин - 43,1 %, виментин - 63,2 %, бета-тубулин - 70,1 %, GFAP - 3,2 %, NCAM - 12,0 %, CD34 - 1,3 %, CD45 -0,5 %. Подобная гетерогенность в какой-то степени определяет специфику реакции стволовых клеток на различного рода внешние воздействия - в частности, изменение соотношения клеток с различным потенциалом отражается на характере их дифференцировки при попадании в различную микросреду. Например, повышенное содержание нестин-содержащих клеток будет способствовать повышению эффективности воздействия микроокружения на их дифференцировку. Кроме того, программа дифференцировки стволовых нервных клеток достаточно консервативна для разных таксонов; например, стволовые клетки человека способны мигрировать и развиваться в случае их трансплантации в мозг крысы.
Одной из задач работы являлся поиск способа управления дифференцировкой нейральных стволовых клеток в условиях их культивирования и трансплантации. Эта проблема важна в теоретическом плане, поскольку приближает нас к пониманию сущности клеточной дифференцировки. Кроме того, решение этой проблемы важно для прикладных работ, поскольку позволит получать популяции клеток, дифференцирующихся в нужном для клеточной терапии направлении. (Корочкин, 2002)
Существуют три способа воздействия на дифференцировку клеток в культуре ткани: 1 - добавление кондиционной среды; 2 - добавление к культуральной среде активирующих специфическую дифференцировку факторов; и 3 - трансфекция культивируемых клеток генами, которые кодируют факторы, индуцирующие клеточную дифференцировку. В случае нервной ткани этими факторами являются нейротрофические факторы (Perez-Navarro et.al.,2000; Triaca et.al.,2003).
В данной работе детально изучается третий способ воздействия. Критическое значение для экспрессии трансфицированного гена имеет правильный выбор промотора. Желательно, чтобы он был регулируемым, например, мог бы активироваться при температуре тела человека или активироваться только при более высокой температуре, не выходящей за физиологические пределы.
При создании наших базовых генетических конструкций в качестве управляющего элемента мы применили п/р область гена hsp70 дрозофилы. В приведенных выше исследованиях нами были выяснены основные вопросы, касающиеся функционирования полученных нами конструкций, содержащих нейротрофические факторы под контролем упомянутой п/р области в клетках и тканях дрозофилы и млекопитающих, включая человека.
При исследовании полученных нами трансгенных линий дрозофилы, содержащих гены нейротрофических факторов человека - NGF, GDNF и BDNF под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы было показано, что нейротрофические гены млекопитающих экспрессируются в тканях дрозофилы находясь под неродственным промотором. Как и предполагалось, экспрессия данных генов оказалась температурно-зависимой. Полученные трансгенные линии дрозофилы характеризуются высокой транскрипционной активностью человеческих генов gdnf, ngf и bdnf в условиях теплового шока — при 37С. Наличие экспрессии чужеродных белков подтверждена гибридизацией in situ, методом иммуноблотинга (Reinshagen et.al., 2000). Действие этих белков на окружающие клетки и ткани исследованы при трансплантации клеток дрозофилы в мозг крыс и при кокультивации их с клетками и органотипическими культурами нервных тканей животных и человека. В этих экспериментах во фрагментах эмбриональной эктодермы трансгенных линий дрозофилы активировался синтез трансдуцированных нейротрофических факторов и маркерных белков, обусловленный температурным воздействием среды по сути хитшоковым для тканей насекомых. Продуцируемые факторы оказывали нейротрофное воздействие на окрыжающие ткани млекопитающих.
В результате исследований по кокультивации, была получена модель, в которой эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, будучи источниками синтеза нейротрофического фактора, стимулируют рост нейральных отростков у кокультивированных эмбриональных, нервных клеток в строго заданном направлении. Интересно, что волокна млекопитающих не просто росли, но и вступали в контакт с нейральными тканями такого отдаленного таксона как дрозофила. Разработанная экспериментальная модель может быть полезна для дальнейших исследований действия трансдуцированных белковых факторов и сигнальных молекул на ткани и клетки подопытных животных и человека.
Опыты с ксенотрансплантацией в мозг крысы нейральной ткани эмбриона трансгенной дрозофилы линии СЗ-1М (gdnf) в смеси с нервной тканью эмбриона крысы показали, что экспрессирующийся в ткани мухи тарнсдуцированный фактор выделяется в окружающюю ткань и оказывает трофическое воздействие на ткань реципиентного мозга и котрансплантированные фетальные клетки крыс. Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих.
Морфологическое изучение показало, что в случаях такой котрансплантации наблюдается хорошая приживляемость трансплантата и резкое снижение гибели котрансгшантированных фетальных клеток крыс. Хорошая выживаемость клеток трансплантата может быть отражением нейропротективной функции выделяемого тканью мухи GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы вследствие апоптоза. Полгамо хорошей выживаемости котрансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающего трансплантат неокортекса крысы. Интересно отметить, что такой интенсивной васкуляризации не наблюдается при в обычных аллотрансплантатах фетальной нервной ткани в кору крыс. На этом основании можно предположить, что ангиогенный эффект обусловлен присутствием в трансплантате ксеногенной ткани дрозофилы. Усиленную васкуляризацию могут вызывать факторы, выделяемые ксеногенными клетками, в том числе возможно и трансдуцированный GDNF.
