Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 12
3.1. Клеточная адгезия 12
3.1.1. Внеклеточный матрикс (ВКМ) 12
3.1.2. Белки ВКМ ламинин 2/4 (ЛМ), фибронектин (ФН) и их рецепторы 13
3.1.3. Фокальная адгезия 16
3.1.4. Актиновый цитоскелет (АЦ) 18
3.1.4.1. Формирование актиновых структур в процессе распластывания клетки на субстрате 20
3.1.4.2. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур 22
3.2. Внутриклеточная сигнализация 24
3.2.1. Внеклеточные сигнальные молекулы и их рецепторы 24
3.2.1.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор (ЭФР-Р) 25
3.2.2. Основные пути проведения сигнала в клетке, активируемые ЭФР 26
3.2.3. Транскрипционные факторы (ТФ)ОТкВ, SRF и API 28
3.2.3.1. NFKB 28
3.2.3.2. SRF 31
3.2.3.3. API 32
3.2.3.4. Активация NFKB, SRF и API эпидермальным фактором роста 33
3.2.3.5. Малые ГТФ-азы семейства Rho 34
3.2.3.6. Активация NFKB, SRF и АРІ в результате возбуждения интегриновых рецепторов 35
3.3. Участие актинового цитоскелета в проведении сигнала..36
3.3.1. Мембранный уровень сигнализации 36
3.3.2. Цитоплазматический уровень сигнализации 38
3.3.3. Ядерный уровень сигнализации 42
3.3.3.1. Ядерно-цитоплазматический транспорт 42
3.3.3.2. Участие актина в ядерных событиях 43
3.4. Заключение 44
4. Материалы и методы исследования 47
4.1. Получение ламинина 2/4 47
4.2. Получение фибронектина 48
4.3. Получение моноклональных антител 5а9 к рецептору эфр 48
4.4. Разделение белков в системе диск-электрофореза 50
4.5. Культивирование клеток 50
4.6. Подготовка субстратов 51
4.7. Распластывание клеток на субстратах 51
4.8. Изучение структуры актинового цитоскелета 53
4.9. Изучение перераспределений в клетке р65 и винкулина 53
4.10. Антитела 54
4.11. Получение ядерных экстрактов 54
4.12. Выявление днк-связывающей активности траникрипционных факторов 55
4.13. Количественный анализ днк-связывающей активности тф
56
5. Результаты 59
5.1. Реорганизации актинового цитоскелета при взаимодействии клеток а431 с иммобилизованными лигандами в Течение 24 4 59
5.2. Взаимодействие транскрипционных факторов с консенсутными последовательностями ДНК 64
5.2.1. Конкурентный анализ транскрипционных факторов 64
5.2.2. Исследование изменений ДНК-связывающей активности ТФ после перестроек АЦ, вызванных переводом клеток в суспензионное состояние, и культивированием на лигандах в течение 1 ч 66
5.3. Уточнение сроков исследования 67
5.4. Анализ динамики ац и активности тф в процессе распластывания клеток (ДО 2 Ч) 69
5.4.1. Распластывание клеток на фибронектине 69
5.4.1.1. Анализ формирования АЦ при распластывании клеток 69
5.4.1.2. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ 72
5.4.2. Распластывание клеток на ламинине 2/4 76
5.4.3. Распластывание клеток на антителах 5А9 к рецептору ЭФР 79
5.5. Исследование распределений винкулина при распластывании клеток на фибронектине или ламинине 2/4 82
5.5.1. Распределение винкулина в процессе распластывания клеток на ФН 84
5.5.2. Распределение винкулина в процессе распластывания клеток на ЛМ 84
5.6. Анализ перестроек ац и активности тф при воздействии на распластанные клетки ЭФР 85
5.6.1. Анализ перестроек АЦ и активности ТФ в клетках, распластанных на ФН .85
5.6.1.1. Анализ динамики АЦ 85
5.6.1.2. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ 88
5.6.2. Анализ перестроек АЦ и активности ТФ при воздействии ЭФР на клетки, распластанные на ЛМ 93
5.6.3. Анализ перестроек АЦ и активности ТФ при воздействии ЭФР на клетки, распластанные на AT 96
5.6.4. Исследование перераспределений винкулина под действием ЭФР на
распластанные на ФН и ЛМ клетки 100
5.6.4.1. Распределение винкулина в клетках, распластанных на ФН 100
5.6.4.2. Распределение винкулина в клетках, распластанных на ЛМ 102
5.7. Анализ динамики ац и активности тф при последовательном воздействии на распластанные клетки цитохалазщиномдиэфр 102
5.7.1. Исследование ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, выращенных на пластике 105
5.7.2. Сравнительный анализ ДНК-связывающей активности ТФ при воздействии ЭФР на клетки, выращенные на пластике и на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах 108
5.7.2.1. Сравнение изменений ДНК-связывающей активности NFKB клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах и клеток, выращенных на пластике 110
5.7.2.2. Сравнение изменений ДНК-связывающей активности SRF клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах и клеток, выращенных на пластике 112
5.7.3. Анализ активности ТФ при последовательном воздействии цитохалазином Д и ЭФР на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах 112
5.7.3.1. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ в распластанных на ФН клетках, последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 115
5.7.3.2. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ в распластанных на ЛМ клетках, последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 115
5.7.3.3. Анализ изменений ДНК-связывающей активности ТФ в распластанных на AT клетках, последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 117
5.7.4. Анализ реорганизаций АЦ при последовательном воздействии цитохалазином Д и ЭФР на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах 118
5.7.4.1. Реорганизации АЦ в результате последовательной обработки ЦХ и ЭФР клеток, распластанных на ФН 119
5.7.4.2. Реорганизации АЦ в результате последовательной обработки ЦХ и ЭФР клеток, распластанных на ЛМ 123
5.7.4.3. Реорганизации АЦ в результате последовательной обработки ЦХ и ЭФР клеток, распластанных на AT 126
5.7.5. Сравнительный анализ перестроек АЦ и изменений уровня
ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, распластанных на иммобилизованных
лигандах и последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 127
5.7.5.1. Сравнительный анализ перестроек АЦ и изменений уровня ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, распластанных на ФН и последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 128
5.7.5.2. Сравнительный анализ перестроек АЦ и изменений уровня ДНК-связывающей активности ТФ в клетках, распластанных на ЛМ или AT и последовательно обработанных ЦХ и ЭФР 129
5.8. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы Р65 и уровня ДНК-связывающей активности NFKB 131
5.8.1. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы р65 и уровня
ДНК-связывающей активности NFKB при распластывании клеток 132
5.8.1.1. Распластывание клеток на фибронектине 132
5.8.1.2. Распластывание клеток на ламинине 2/4 134
5.8.1.3. Распластывание клеток на антителах к рецептору ЭФР 135
5.8.2. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы р65 и уровня ДНК-связывающей активности NFKB при обработке ЭФР клеток, распластанных на разных лигандах 137
5.8.3. Сравнительный анализ перераспределений субъединицы р65 и уровня ДНК-связывающей активности NFKB при последовательной обработке цитохалазином Д и ЭФР клеток, распластанных на разных лигандах 142
6. Обсуждение результатов 145
7. Выводы 160
8. Список работ, опубликованных по теме диссертации 162
9. Список использованной литературы
- Белки ВКМ ламинин 2/4 (ЛМ), фибронектин (ФН) и их рецепторы
- Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор (ЭФР-Р)
- Разделение белков в системе диск-электрофореза
- Взаимодействие транскрипционных факторов с консенсутными последовательностями ДНК
Введение к работе
Изучение механизмов передачи сигнала с клеточной поверхности в ядро является одной из центральных задач современной клеточной и молекулярной биологии. Сигнал возникает в результате взаимодействия клеточных рецепторов с сигнальными молекулами. При этом запускается ряд внутриклеточных реакций, называемых совокупно внутриклеточной сигнализацией. Внутриклеточная сигнализация, в конечном счёте, приводит к модуляции экспрессии тех или иных генов, которые, в свою очередь, регулируют такие функции клетки, как пролиферация, дифференцировка, деление, апоптоз, биологическая подвижность, а также различные стороны клеточного метаболизма.
Адгезия клеток к белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) является одним из пусковых механизмов внутриклеточной сигнализации. Распластывание клеток на иммобилизованных белках ВКМ можно использовать как модельную систему, которая позволяет выявлять процессы, связанные с адгезией на молекулярном и на субклеточном уровнях организации клетки. Взаимодействие клеток с белками ВКМ осуществляется поверхностными рецепторами адгезии, среди которых лучше всего охарактеризованы интегриновые рецепторы (Van Aelst, D Souza-Schorey, 1997; Hall, 1998; Schoenwaelder, Burridge, 1999). Интегрины ассоциированы с подмембранными структурами актинового цитоскелета (АЦ) в образующихся при распластывании клеток трансмембранных комплексах, где они активируют сигнальные молекулы, способствуя переносу в ядро белковых факторов, индуцирующих транскрипцию генов (Miyamoto et al., 1998; Clark, Brugge, 1995).
АЦ является обязательным участником адгезии, способствуя стабилизации множественных взаимодействий и определяя форму клетки (Hynes, 1999; Geiger et al., 2001). При этом происходит реорганизация АЦ под влиянием элементов ВКМ. Влияние ВКМ на АЦ в значительной степени реализуется через интегриновые рецепторы (Sastry,
Horwitz, 1993; Yamada, Miyamoto, 1995).
В культивируемых клетках структуры АЦ представлены стресс-фибриллами, разнообразными пучками микрофиламентов в цитоплазме и филоподиях, а также сетью микрофиламентов в ламеллах клеток (Small et al., 1999). При распластывании клеток эпидермоидной карциномы А431 на фибронектине в цитоплазме клеток обнаруживаются стресс-фибриллы, на ламинине2/4 - сеть актиновых филаментов в ламелле, и на антителах к рецептору ЭФР - сеть актиновых филаментов в филоподиях и ламеллах (Are et al., 2001). Соответствующие структуры АЦ обнаруживаются у большинства клеток, распластанных в течение 1 ч на данных лигандах (Петухова и др., 2004).
Участие малых ГТФ-аз в возникновении тех или иных типов пространственной организации АЦ было показано в 1992 году Ридли и Холлом (Ridley,- Hall, 1992) и исследуется в последующих работах этой группы исследователей. Также в ряде работ было показано наличие связи между состоянием АЦ и проведением сигнала от поверхностной мембраны к ядру клетки (Puck, Krystosek, 1992; Yamada, Geiger, 1997). Предполагается три варианта участия АЦ в этом процессе: роль скаффолда (Hopkins et al., 2000; Yin, Janmey, 2003), роль «рельсов», по которым перемещаются сигнальные молекулы (Small et al., 1999), и самостоятельная передача сигнала самим цитоскелетом (Maniotis et al., 1997) или его компонентами (Batchelor et al., 2004; Бабаков и др., 2004). Все эти данные приводят к предположению о том, что изменение тех или иных типов пространственной организации АЦ может оказывать влияние на процесс активации соответствующих данным типам цитоскелета транскрипционных факторов (ТФ).
Для проверки данного предположения была использована уже существующая модель распластывания клеток эпидермоидной карциномы человека А431 на белках ВКМ фибронектине, или ламинине 2/4, или на антителах 5А9 к рецептору ЭФР (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004). В рамках этой модели реорганизации АЦ можно наблюдать в процессе распластывания клеток (Small et al., 1998), при действии на распластанные
клетки ЭФР (Are et al., 2001), а также после воздействия на клетки цитохалазина Д
(Nemeth et al., 2004).
Были выбраны ТФ, которые специфически взаимодействуют с регуляторными
последовательностями кВ, SRE, и API. Показано, что активность данных ТФ может
изменяться в связи с адгезией и реорганизацией АЦ. Так, активность SRF регулируется
динамикой актина при участии ГТФ-азы RhoA и через Raf-MEK-ERK сигнальный путь
(Sotiropoulos et al., 1999; Gineitis, Treisman, 2001). Семейство Rel/NFKB ТФ индуцируется
малыми ГТФ-азами, МЕКК1 и убиквитинируїощими ферментами за счёт деградации 1кВ и
при разборке АЦ цитохалазином Д (May, Ghosh, 1998; Nemeth et al., 2004). В нашей
лаборатории были получены данные о том, что субъединица р65 ТФ NFKB
взаимодействует с актином и актин-связывающим белком а-актинином и
перераспределяется в цитоплазме клетки в зависимости от характера организации
актиновых структур (Are et al., 2001; Бабаков и др., 2004). Для API показано участие в
процессах, связанных с подвижностью клеток (Malliri et al., 1998).
Белки ВКМ ламинин 2/4 (ЛМ), фибронектин (ФН) и их рецепторы
Вещество, заполняющее пространства между клетками в тканях, т.е. ВКМ, состоит из белков, образующих полимерную сеть, и полисахаридов гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарина, гепарансульфата и кератансульфата), которые обычно ковалентно связаны с белком в форме протеогликанов (Wight et al., 1992). Белки ВКМ можно разделить на два функциональных типа: преимущественно структурные (коллаген, эластин) и, в основном, адгезивные (фибронектин, ламинин и др.). Полисахариды образуют гелеподобное сильно гидратированное основное вещество, в которое погружены полимерные сети фибриллярных белков. Водная фаза ВКМ обеспечивает диффузию различных веществ и тургор тканей. Показано, что протеогликаны могут связывать различные растворимые сигнальные молекулы (напр. ЭФР), т.о. являясь резервуаром, из которого эти сигнальные молекулы высвобождаются под влиянием тех или иных условий, в частности при заживлении ран (Raghow, 1994). Фибриллярный компонент ВКМ обеспечивает упругий каркас и прикрепление (адгезию) клеток, в свою очередь сам являясь для клетки комплексом сигнальных молекул. ВКМ продуцируется и секретируется специализированными клетками in situ и в различных тканях имеет различный состав (Adams, Watt, 1993; Smola et al., 1998). В соединительных тканях адгезию осуществляет, в основном, фибронектин. В эпителиальных тканях клетки прикрепляются к базальной мембране специализированному слою ВКМ, представляющему собой тонкую пластинку, разделяющую клеточные слои или отделяющую их от окружающей соединительной ткани и содержащую обязательно коллаген типа IV, протеогликаны (в основном гепарансульфаты) и гликопротеины ламинин и нидоген (Smola et al., 1998). Кроме участия в формировании структуры эпителиальных тканей, базальная мембрана окружает отдельные мышечные волокна, жировые клетки и шванновские клетки. При связывании элементов ВКМ (напр. фибронектина или ламинина) клеточными рецепторами запускаются различные сигнальные каскады, что оказывает значительное влияние на поведение клеток: дифференцировку, пролиферацию, миграцию и др. (Extracellular matrix: structure and functions, 1985; Raghow, 1994). Из составляющих ВКМ молекул в данной работе были использованы фибронектин и ламинин 2/4.
Белки ВКМ ламинин 2/4 (ЛМ), фибронектин (ФН) и их рецепторы Ламинины - семейство высокомолекулярных ( 900 кДа) мультидоменных белков, образующих наряду с коллагеном IV основу базальной мембраны. Семейство включает, по крайней мере, 12 изоформ ламининов, которые составляются различными комбинациями трёх белковых цепей: а, р и у. В настоящее время известно 5 тяжёлых а цепей, 3 лёгких Р и 3 лёгких у цепи. Разные цепи ламинина синтезируются только в определённых тканях и на определённых этапах развития организма (Engvall, Wewer, 1996). В частности, ламинин, который мы использовали в данной работе (ламинин 2/4 (ЛМ)), представляющий собой комплекс из ламинина 2 ( x2piyl) и ламинина 4 (a2p2yl), синтезируется, в основном, в плаценте человека и в значительно меньших количествах - в скелетных и сердечной мышцах, коже и Шванновских клетках (Vuolteenaho et al., 1994). ЛМ имеет сайты для связывания других компонентов ВКМ, таких как коллаген IV, энтакрин, нидоген и протеогликаны (Sasaki et al, 1988). На поверхности клеток присутствуют несколько типов рецепторов, взаимодействующих с ЛМ. Основным классом для связывания ламининов являются интегриновые рецепторы. К неинтегриновым рецепторам ЛМ относятся 67 кДа лектиновый рецептор, а-дистрогликан и др. (Mecham et al., 1989; Ekblom, 1996).
Фибронектин - крупный мультидоменный гликопротеин с молекулярной массой примерно 540 кДа, секретируемый клетками соединительной ткани и состоящий из двух белковых цепей (субъединиц), одинаковых по общему плану строения, которые связаны друг с другом двумя дисульфидными мостиками у С-концов этих цепей (Engel, 1992). Каждая субъединица формируется, в основном, тремя типами аминокислотных повторов и разделена на глобулярные домены, связанные между собой участками гибкой полипептидной цепи. Известно, что центральный связующий с клеткой домен содержит RGD-последовательность (Arg-Gly-Glu), необходимую для взаимодействия с интегриновыми рецепторами. N-концевой домен может связываться с фибрином, гепарином, а также с самим ФН. Этот домен играет основную роль в формировании полимерной ФН-сети. В других доменах существуют специфические сайты узнавания и связывания фибрина, гепарина, коллагена и др. (Sechler et al., 1998). Существуют три формы ФН: 1. ФН плазмы - растворимая димерная форма; 2. поверхностный ФН - олигомерная форма (олигомеры могут быть временно прикреплены к поверхности клеток); З.матриксный ФН - труднорастворимая фибриллярная форма (Mosher, 1989; Hynes, 1990). Образование полимерной сети ФН происходит только на клеточной поверхности. Это обстоятельство принципиально отличает его от ламинина и других белков ВКМ (Peters, Mosher, 1987). Клетки соединительной ткани разных органов синтезируют различные изоформы ФН. Всё разнообразие изоформ ФН складывается в результате альтернативного сплайсинга РНК единственного гена, содержащего около 50-ти экзонов (Sechler et al., 1998).
Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор (ЭФР-Р)
Сигнальные молекулы - те молекулы, которые, в конечном счёте, определяют поведение клетки в организме: будет ли она делиться или пролиферировать, или перейдёт в стадию подготовки к апоптозу и т. д. Сигнальными могут быть молекулы в виде растворимых гормонов белкового или стероидного происхождения, белков, заякоренных к поверхности соседних клеток или депонированных в толще внеклеточного матрикса (ВКМ) (Pawson, Nash, 2000), а также сами белки ВКМ (Geiger et al., 2001). Нерастворимые белки ВКМ фибронектин и ламинин 2/4 были описаны выше. Из растворимых сигнальных молекул в данной работе был использован эпидермальный фактор роста. ЭФР - один из наиболее изученных факторов, был выделен впервые Кохеном в 1962-ом году из подчелюстных желёз мыши (Cohen, 1962), представляет собой одноцепочечный полипептид молекулярной массой 6 кДа, хорошо растворимый в воде, состоящий из 57-и аминокислотах остатков и стабилизированный тремя дисульфидными мостиками (Savage et al., 1972). ЭФР относится к семейству ЭФР-подобных пептидов. К этому семейству относят также TGFa, амфирегулин, р-целюлин, гепарин-связывающий ЭФР-подобный фактор (HB-EGF), эпирегулин, фактор роста глии и др. (Riese, Stern, 1998). Все члены семейства ЭФР-подобных пептидов являются продуктами одного и того же гена и представляют собой сплайсинговые формы, синтезируются в виде трансмембранных предшественников и потом в результате протеолиза превращаются в зрелые внеклеточные формы (Massagye, Pandiella, 1993). Все члены семейства в зависимости от специфичности и благодаря ЭФР-подобному домену могут взаимодействовать с ЭФР-Р и с другими белками семейства Erb В рецепторов, к которому относится ЭФР-Р. В настоящее время описаны 4 типа рецепторов, относящихся к семейству Erb В (ЭФР-Р (EGF), ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ и ЕгЬВ4), отличающихся по составу связываемых гормонов и активации сигнальных путей (Sliwkowski et al., 1994; Lemmon et al., 1997). Все эти рецепторы относятся к классу трансмембранных рецепторов, цитоплазматический домен которых обладает тирозин-киназной активностью. При обработке клеток ЭФР происходит димеризация ЭФР-Р, активация их тирозинкиназы и автофосфорилирование С-концевых тирозинов (Ullrich, Schlessinger, 1990). К аминокислотным последовательностям ЭФР-Р, содержащим фосфорилированные тирозины, через SH2 домены присоединяются сигнальные белки и фосфорилируются тирозиновой киназой рецепторов (Schlessinger, 1990). Рецепторы Erb В-семейства способны к гетеродимеризации и кросс-активации друг друга, поэтому присутствие на мембране клетки рецептора, который может связаться с гормоном, достаточно для активации почти всех членов Erb В-семейства рецепторов (Riese et al., 1996).
Основные пути проведения сигнала в клетке, активируемые ЭФР Существует несколько сигнальных каскадов, активируемых ЭФР. Одним из наиболее хорошо изученных каскадов является фосфоинозитидный путь проведения сигнала от мембраны клетки к её ядру (схема 3). Он запускается через активацию ЭФР-Р фосфолипазы Су (ФЛСу), которая, катализирует гидролиз фосфатидил инозитол-4,5-дифосфата (РІРг) с образованием диацилглицерола (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфата (ІРз). 1Рз способствует мобилизации из внутриклеточных депо ионов Са , которые регулируют работу различных протеинкиназ (напр. протеиновых киназ (ПК) А и С), актин-связывающих белков, работу акто-миозинового комплекса и т. д. ДАГ активирует ПКС. ПКС фосфорилирует белки-мишени по остаткам серина и треонина (Berridge, 1993; ЭФР-
Rhee, Вае, 1997). ІРз инактивируется дефосфорилированием до ІРг или с помощью киназы ІРз (РІзК) фосфорилируется до ІР4, являющегося ингибитором работы ФЛСу. РІ3К может активироваться непосредственно присоединением к ЭФР-Р через свою субъединицу р85 (Carpenter, 1992) или белком Ras.
Ras относится к группе мономерных ГТФ-связывающих белков и является ключевым белком каскадов, запускаемых ЭФР и активирующих MAPs (митоген-активируемые белки). Активность Ras зависит от типа ассоциированных с ним гуаниновых нуклеотидов: ГДФ или ГТФ. Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs) способствуют образованию активной ГТФ-связанной формы Ras. Белки GAPs (белки активирующие ГТФ-азную активность) инактивируют Ras, гидролизуя ГТФ до ГДФ (Нео, Meyer, 2003). Активация рецептора ЭФР приводит к его ассоциации с адапторными белками Sch и/или Grb2, которые рекрутируют к цитоплазматической мембране фактор обмена ГДФ на ГТФ Ras-белка - белок SOS. SOS стимулирует образование Ras-ГТФ, т.е. активированной формы Ras (схема 4). ЭФР-Р
Разделение белков в системе диск-электрофореза
Покровные стёкла, обработанные Repel-Silan (Pharmacia Biotech., Sweden) для придания поверхности гидрофобных свойств, и бактериологические чашки Петри диаметром 90 мм (гидрофобная поверхность, ПО "Ленполимер", СССР) покрывали растворами различных лигандов (фибронектина, ламинина 2/4, AT 5А9, полилизина) с концентрацией 10 мкг/мл. Выдерживали в течение ночи при 4С, затем трижды отмывали фосфатным буфером (ФБ). Обрабатывали 2%-м бычьим сывороточным альбумином (heat shock fractionated), приготовленным на ФБ, в течение 1 ч при температуре 37С для предотвращения неспецифического взаимодействия клеток с субстратом и снова трижды отмывали ФБ.
Суспензию клеток наносили на тёплые покровные стёкла или чашки Петри с иммобилизованными на них лигандами в количестве 2х104кл (100 мкл) на стекло и 5х106кл (4 мл) на чашку и культивировали при 37С в атмосфере 5% С02. Для исследования динамики распластывания клеток на субстратах из общего числа чашек Петри или покровных стёкол через 10, 20, 30, 40, 50, 60 мин, 1.5 и 2 ч от начала распластывания изымали по одной чашке Петри или одному покровному стеклу для биохимического и цитологического анализа соответственно.
При исследовании динамики влияния ЭФР на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах, клетки инкубировали при 37С в атмосфере 5% СОг 1 ч и затем производили смену среды на среду ДМЕМ с ЭФР (100 нг/мл) и вновь помещали в инкубатор при тех же условиях. Через 5, 30, 60 мин и 2 ч после смены среды производили дальнейшее исследование.
При исследовании влияния на клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах, цитохалазина Д клетки инкубировали при 37С в атмосфере 5% СОг 1 ч и затем производили смену среды на среду ДМЕМ с цитохалазином Д (2 мкг/мл) и вновь помещали в инкубатор при тех же условиях. Через 30 мин после смены среды одну чашку Петри или одно покровное стекло брали на анализ. В остальных среду с цитохалазином Д меняли на среду ДМЕМ с ЭФР (100 нг/мл) без цитохалазина Д и вновь помещали в инкубатор при тех же условиях. Через 5, 30, 60 мин и 2 ч после смены среды производили дальнейшее исследование (всего 5 чашек и 5 стёкол).
В качестве контроля действия ЭФР на клетки, обработанные цитохалазином Д, клетки, культивируемые на покровных стёклах, после их обработки цитохалазином Д, снова культивировали, но в среде ДМЕМ без цитохалазина Д и ЭФР. Через 5 и 30 мин после смены среды стёкла брали на морфологический анализ.
Для исследования динамики изменений актинового цитоскелета при распластывании клеток на иммобилизованных лигандах в течение 24 ч клетки культивировали только на покровных стёклах в среде ДМЕМ как описано выше. Анализ актинового цитоскелета проводили через 1, 3, 5, 24 ч после помещения клеток на лиганд.
Для изучения структуры актинового цитоскелета использовали метод флуоресцентного анализа (метод прямой флуоресценции). Покровные стёкла с культивированными на них, как было описано выше, клетками промывали один раз тёплым ФБ для удаления неприкрепившихся клеток. Прикрепившиеся клетки фиксировали 3.3%-м формальдегидом (10мин при комнатной температуре), пермеабилизировали 0.1%-м Тритоном Х-100 (20 мин) и окрашивали родамин-фаллоидином (Molecula Probes, USA) 10 мин. Препараты анализировали с помощью микроскопа Axioskop (Zeiss), и фотографировали с помощью CD камеры. Изображение записывалось на жёсткий диск с помощью программы КС 100.
В зависимости от структуры и формы актинового цитоскелета выделяли несколько типов клеток. Для определения долевого соотношения выделенных клеточных типов подсчитывали клеточные типы в трёх областях препарата по 100 клеток в каждой (Петухова и др., 2004). Подсчитывали средние значения долей клеток, принадлежащих к разным морфологическим типам, определяли доверительные интервалы с уровнем значимости а = 0.05.
При изучении перераспределений субъединицы NFKB р65 или винкулина для окраски клеток использовали метод двойной флуоресценции. Для этого после фиксирования и пермеабилизации клеток, как было описано выше, клетки инкубировали с первыми антителами в течение 30 мин при комнатной температуре и трижды промывали раствором 0.1 % Tween на ФБ. Затем клетки обрабатывали вторыми антителами в течение 30 мин в тех же условиях, промывали раствором 0.1 % Tween на ФБ и окрашивали актиновый цитоскелет раствором родамин 54 фаллоидина, как было описано выше. Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica (Zeiss).
Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм для FITC и HeNe лазер с длиной волны 543 нм для родамин-фаллоидина. Применяли раздельное сканирование для сигнала FITC (флуоресценция в области 500-530 нм) и родамин-фаллоидина (флуоресценция в области 580-640 нм). Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software.
Взаимодействие транскрипционных факторов с консенсутными последовательностями днк
NFKB : Как было показано выше, клетки, распластанные на иммобилизованных лигандах в течение 1 ч, характеризуются активным состоянием исследуемых ТФ. Добавление после 1 ч культивирования клеток на ФН в инкубационную среду ЭФР приводит в течение первой фазы его действия (5 мин) к неоднозначной реакции разных ДНК-белковых комплексов NFKB. ДНК-связывающая активность комплекса 1 увеличивается, а активности комплексов 2 и 3 снижаются (сравни рис. 10, //, А, в, 60 и рис. 10, II, А, в, 5е). Дальнейшие изменения ДНК-связывающей активности NFKB ПОД действием ЭФР на диаграммах, построенных непосредственно по данным денситометрии, имеют незначительные колебания, значения которых в разных повторах опытов различаются. Данное обстоятельство не позволяло нам оценить ход изменений ДНК-связывающей активности NFKB на сроках больших 5 мин после добавления к клеткам ЭФР.
В предыдущих экспериментах было установлено, что ДНК-связывающая активность ТФ после 1 ч распластывания клеток на иммобилизованных лигандах продолжает циклически изменяться с определённой периодичностью. Эти изменения могут интерферировать с изменениями ДНК-связывающей активности ТФ под действием ЭФР. Для того, чтобы выявить специфичность влияния ЭФР на ДНК-связывающую активность ТФ, из значений активности полученных как результат действия ЭФР (рис. 10, II, А, в) были вычтены значения активности для тех же временных интервалов, полученные в контроле без действия ЭФР (рис. 10, II, А, б). Полученные кривые оказались кривыми с ясно выраженными циклическими изменениями значений и высоким уровнем повторяемости (рис. 11; приложение рис. 15, А). Данные кривые отражают действие ЭФР на ДНК-связывающую активность ТФ, поэтому, в дальнейшем, мы будем называть их «кривыми специфического действия ЭФР». По ним можно оценивать действие именно ЭФР на ДНК-связывающую активность ТФ, т.к. оценивается разница уровня ДНК-связывающей активности, причиной которой явилось воздействие на клетки ЭФР.
Анализ кривых специфического действия ЭФР имеет особенности. Оценка уровня ДНК-связывающей активности ТФ в точке 5 мин после добавления к клеткам ЭФР по этим кривым принципиально отличается от оценки ДНК-связывающей активности ТФ в точках 30, 60 и 120 мин. Значение в точке 5 мин отражает действительное изменение уровня ДНК-связывающей активности ТФ относительно исходного (точка 60 мин культивирования клеток на лиганде). Поэтому положительное значение в этой точке означает повышение ДНК-связывающей активности ТФ, а отрицательное - понижение. Значения в точках 30, 60 и 120 мин оцениваются только относительно предшествующих, т. е. значения в точке 30 мин - относительно значений в точке 5 мин, в точке 60 мин -относительно 30 мин и т. д. Таким образом, при оценке ДНК-связывающей активности в этих точках можно говорить только о процессе повышения или понижения уровня ДНК-связывающей активности ТФ, но нельзя сказать, будет ли этот уровень ниже или выше исходного (значения уровня ДНК-связывающей активности в точке 60 мин после нанесения клеток на лиганд).
Анализ кривых специфического действия ЭФР (рис.11, А) подтвердил, что ДНК-связывающая активность комплекса 1 NFKB через 5 мин после начала воздействия на клетки ЭФР повышается. Это видно из того, что значение разности в точке «5 мин» на диаграмме положительно (рис. 11, А, 1). ДНК-связывающая активность комплексов 2 и 3 через 5 мин после начала действия на клетки ЭФР снижается. Об этом свидетельствуют отрицательные значения в точке «5 мин» на диаграмме (рис. 11, А, 2 и 3). В дальнейшем, направление изменений ДНК-связывающей активности всех ДНК-белковых комплексов NFKB совпадает. В течение от 5 до 30 мин после добавления ЭФР оно имеет положительное значение, от 30 до 60 мин - отрицательное и от 60 до 120 мин -положительное (рис. 11, А).
Таким образом, относительный уровень ДНК-связывающей активности всех белковых комплексов, содержащих NFKB, через 30 мин после добавления к инкубационной среде ЭФР повышается, а через 60 мин независимо от изменений активности в контроле - снижается.
S R F : Для анализа ДНК-связывающей активности SRF под действием ЭФР был применён тот же подход к оценке результатов, т. е. анализировали диаграммы кривых специфического действия ЭФР. Анализ диаграммы, изображённой на рис.11, Б показал, что цикличность изменений ДНК-связывающей активности SRF под действием ЭФР сохраняется. Также как и при распластывании клеток, сохраняется противофазность изменений ДНК-связывающей активности белковых комплексов 1 и 3. Относительная ДНК-связывающая активность всех белковых комплексов, содержащих SRF, повышается в течение первой фазы действия ЭФР (рис. 11, Б, 5). В течение второй фазы действия ЭФР ДНК-связывающая активность белковых комплексов 1 и 2 снижается. В то же время, ДНК-связывающая активность комплекса 3 повышается, выходя в противофазу к изменениям уровня ДНК-связывающей активности комплексов 1 и 2 (рис.11, Б, 30). (Полную информацию смотри приложение рис. 15, Б)
API : При оценке кривых специфического действия ЭФР (рис.11, В) закономерных изменений ДНК-связывающей активности АРІ не наблюдалось. При анализе исходных кривых (приложение рис. 15, В, а; б) выявили, что ДНК-связывающая активность API после смены культуральной среды на среду с ЭФР в разных повторах опытов изменяется неодинаково. Однако, по форме кривые изменений уровня ДНК-связывающей активности разных белковых комплексов, особенно кривые активности ДНК-белкового комплекса 2, в разных повторах опытов сходны. Наблюдался подъём уровня ДНК-связывающей активности обоих белковых комплексов через 30 мин после добавления в инкубационную среду ЭФР и, затем, плавное уменьшение уровня ДНК-связывающей активности у комплекса 2 через 60 мин и у комплекса 1 через 120 мин
