Агонист-индуцированный и депо-управляемый вход кальция в клетки А431 Гусев Константин Олегович

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Гусев Константин Олегович. Агонист-индуцированный и депо-управляемый вход кальция в клетки А431 : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.25 : Санкт-Петербург, 2003 94 c. РГБ ОД, 61:04-3/384

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Регуляция концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме . 7

Поддержание [Ca2+J,- на низком уровне. 8

Агонист-чувствительные Са +-депо . 11

Кальций и митохондрии 15

Кальций и ядро 16

Глава 2. Р1Р2 как модулятор активности ионных каналов и переносчиков. Метаболизм ГР3. Рецептор 1Р3. 16

Наработка PIP2 и его роль в регуляции ионных каналов и переносчиков. 17

Метаболизм 1Рз - 20

Рецептор IP І эндоплазматического ретикулума. 21

Глава 3. Вход Са2+ из внеклеточной среды в ответ на опустошение внутриклеточных Са2+-депо . 24

CRAC-каналы 25

Другие SOC-каналы 29

Регуляция SOC-каналов 30

Глава 4. Семейство TRP-каналов . 34

TRP- и TRPL-каналы Drosophila melanogaster. 34

TRP-семейство каналов в клетках млекопитающих . 36

Глава 5. Механизмы активации SOC-каналов . 42

Глава 6. Миниатюрные кальциевые каналы клеток А431. 48

Заключение 50

Агонист-чувствительные Са +-депо
Метаболизм 1Рз
Другие SOC-каналы
TRP-семейство каналов в клетках млекопитающих

Введение к работе

ВВЕДЕНИЕ

Одним из основных способов передачи сигнала от рецепторов плазматической мембраны к внутриклеточным структурам является повышение концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме ([Ca²⁺]j). За счет регулируемых изменений [Са ]{ клетки способны контролировать различные процессы, такие как секреция, сокращение, пролиферация и регуляция экспрессии генов. В невозбудимых клетках рецептор-индуцированные изменения [Са²⁺], обычно включают две составляющие: быстрое, кратковременное высвобождение Са²⁺ из Са²⁺-депо (представленных, по-видимому, эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или его субкомпартментами) и последующий медленный, но продолжительный вход внеклеточного Са²⁺. Стимуляция рецепторов, сопряженных с G-белками или тирозиновыми киназами приводит к активации PLC и гидролизу фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (Р1Р₂) до инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Р₃) и диацилглицерина (DAG). Связывание 1Р₃ со своим рецептором (IP3R), являющимся катионным каналом эндоплазматического ретикулума, приводит к высвобождению Са²⁺ из внутриклеточных депо. В результате опустошения Са -депо, начинают активироваться депо-управляемые катионные (SOC) каналы, обеспечивающие вход Са²⁺ в клетку. Благодаря входу Са²⁺, его концентрация в цитоплазме поддерживается длительное время на высоком уровне, что приводит к запуску Са²⁺-зависимых сигнальных каскадов и к восстановлению запасов Са²⁺ в депо.

На текущий момент, наиболее исследованным депо-управляемым путем входа Са²⁺ является высокоселективный для Са²⁺ ток через CRAC-каналы. Многочисленные данные говорят и о наличии в клетках менее селективных для

7-А-

Са SOC-каналов. Однако депо-управляемые каналы до сих пор не определены на молекулярном уровне, а также не выявлено их специфического ингибитора, что затрудняет их исследования.

В данной работе мы исследовали депо-управляемый вход Са²⁺ в клетки А431. Мы показали, что как при действии ..агониста, функционально сопряженного с фосфолипазой С, так и при пассивном опустошении Са²⁺ депо в клетках А431 развивается два типа токов - первый имеет характерную для CRAC-каналов форму вольтамперной кривой и высоко селективен для Са²⁺, в то

Введение

время как второй, менее селективный ток, был нами сопоставлен с активацией Imin-каналов, описанных нами ранее. Также был зарегистрирован ток, не зависящий от опустошения Са²⁺-депо, опосредованный, по-видимому, активацией М1С-каналов.

Также мы показали, что РІР2 модулирует активность І_тіп-каналов в физиологических условиях. При этом активация PLC и гидролиз Р1Р₂ приводит к синергичному эффекту - повышению чувствительности комплекса IP₃R-I_min-канал к 1Р₃, и одновременному увеличению концентрации ІР₃ в цитоплазме. Пассивное опустошение Са²⁺-депо вызывает активность І_тіп-каналов, несмотря на переход комплексов ІР₃К-І_тіп-канал в связанное с РГР₂ состояние, в котором они не чувствительны к 1Р₃.

Обзор Литературных Данных

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ Глава 1. Регуляция концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме.

Одним из основных внутриклеточных посредников, способствующих передаче сигнала является кальций. При этом главную роль играет концентрация свободных ионов Са²⁺ в цитоплазме ([Ca²⁺]j). Участие Са²⁺ в регуляции множества процессов, обеспечивающих жизнедеятельность клетки, таких как транскрипция генов, мышечное сокращение, пролиферация, заключается в способности клетки формировать разные типы кальциевого сигнала, вызывающие определенный ответ клетки. Различие кальциевых сигналов определяется различиями в амплитуде, длительности и локализации изменений [Ca²⁺]j. Увеличение [Ca²⁺]j может быть длительным, удерживающимся на стабильном уровне в течение нескольких минут, или кратковременным, заканчивающемся через несколько секунд, может охватывать всю цитоплазму или ограничиваться, например, примембранной областью. Временное увеличение [Са ]j может распространяться через цитоплазму клетки в виде волны или ряда повторяющихся волн (как синхронных, так и асинхронных) [70]. В развитии различных типов кальциевых ответов клетки участвуют многочисленные взаимопересекающиеся процессы, способствующие как увеличению, так и уменьшению концентрации Са²⁺ в цитоплазме.

В норме, или состоянии покоя, [Ca²⁺]j составляет 50-200 нМ, что на четыре порядка ниже концентрации Са во внеклеточной среде [81]. При стимуляции клетки (деполяризацией мембраны, механически или гормонально) [Са²⁺]_;увеличивается до 1 мкМ и выше (в некоторых случаях, при секреции в синаптических окончаниях нейронов, [Ca²⁺]j достигает 200 мкМ) [113]. Однако даже в состоянии покоя поддерживается циркуляция Са²⁺ в клетку и во внутриклеточные органнелы. Так, базальная скорость входа Са²⁺ в клетки гладких мышц оценена в 32 мкМ Са²⁺/л-мин. Следовательно, за минуту концентрация Са²⁺ могла бы более чем в 300 раз превысить [Са²⁺]; в покоящейся клетке [70]. Вход Са осуществляется преимущественно за счет базальной

Обзор Литературных

активности проницаемых для Са²⁺ каналов (лиганд-управляемых, депо-управляемых, потенциал-управляемых каналов).

Поддержание fCa²⁺Ji на низком уровне.

Критическим изменениям [Са²⁺]; препятствует наличие в цитоплазме Са²⁺-

связывающих белков, работа Са -АТФаз и ионообменников. Достаточно много

белков способно взаимодействовать с Са или Са -связывающими белками

[79]. Связывание кальция белками может осуществляться за счет наличия EF-

. м-мотивов, высокоаффинных для Са . На данный момент известно около 600

белков, несущих EF-мотивы. Кроме забуферивания Са²⁺, они способствуют

дальнейшей передаче сигнала. Для связывания Са²⁺ могут служить и, отличные

от EF-мотивов, последовательности, например, С2-типа. Недавно было показано,

что кроме аллостерического влияния на взаимодействие доменов, Са²⁺ может

иметь и другие функции. Так в диизопропилфлуорофосфатазе Loligo vulgaris,

связывающей два атома Са²⁺, один из атомов крепко связан с активным сайтом

фермента и может напрямую участвовать в каталитическом процессе [19].

Следует отметить, что различие в скорости связывания и диссоциации

кальция, позволяет некоторым белкам реагировать на изменения частоты

осцилляции Са , и эффективно функционировать даже когда усредненная [Са ]j

в клетке остается на низком уровне. Последнее позволяет клетке избегать

высоких [Ca²⁺]i, которые могут быть губительны [70].

Основной вклад в поддержании низкой [Ca²⁺]j. вносят кальциевые АТФазы плазматической мембраны клеток и внутриклеточных мембран (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума, так называемых кальциосом и некоторых других внутриклеточных органелл). В эукариотических клетках Са²⁺-АТФазы как плазматической мембраны (РМСА), так и внутриклеточных органелл (SERCA) принадлежат к Р-типу (или Е_ь Е₂-классу) транспортных АТФаз. Для этой группы ферментов характерно образование в ходе реакции фосфорилированного интермедиата (по аспартатному остатку). Са²⁺ связывается с цитоплазматическим доменом фермента, находящемся в высоко-аффинной конформации (Ei), что сопровождается фосфорилированием аспартата с

Обзор Литературных Данных

помощью АТФ. Это приводит к изменению конформации АТФазы (EiP -> Е2Р) и переносу Са²⁺ на внеклеточную (РМСА) или люменальную (SERCA) сторону мембраны. Из-за низкой аффинности фермента к Са²⁺ в конформации Е₂Р происходит высвобождение Са²⁺, что сопровождается гидролитическим отщеплением фосфатной группы и возвращением фермента в исходную конформацию Ej [1,20].

Среди РМСА выделяют 4 основные изоформы и около 30 изоформ,
образованных в результате сплайсинга. Что же касается SERCA, то среди них
выделяют 3 основные изоформы и их сплайсинговые варианты. Основные
свойства РМСА и SERCA, такие как высокая аффиность к Са²⁺, мембранная
топография и организация каталитического домена, схожи. Оба фермента имеют
10 трансмембранных доменов и функционируют как Са²⁺/Н⁺-обменники. При
этом за цикл осуществляется перенос одного иона Са²⁺ и одного иона Н⁺, т.е.
процесс не является электронейтральным. Однако существуют и различия в
структуре и регуляции ферментов, отражающие различия в функциях.
Отличается, в частности, стехиометрия в отношении Са':АТФ, равная 2:1 и 1:1,
соответственно для SERCA и для РМСА. В отличие от РМСА в
цитоплазматических доменах SERCA отсутствует позитивно заряженная
последовательность аминокислот, ответственная за связывание фосфолипидов
(т.о. SERCA не чувствительна к ним), укорочен С-концевой домен, несущий в
РМСА кальмодулин-связывающий домен. Кальмодулин-связывающий домен
белка в отсутствии кальмодулина способствует ингибированию активности
РМСА. Интересно, что в SERCA аналогичную функцию выполняет отдельный
белок - фосфоламбан (для снятия ингибиторного влияния требуется его
фосфорилирование) [20]. .,-.

Как и все члены АТФаз Р-типа, РМСА и SERCA ингибируются ортованадатом и La³⁺. Связывание ионов La³⁺ приводит к стабилизации фосфорилированного аспартата в РМСА, а в SERCA к его дефосфорилированию. Для SERCA были найдены еще и специфические ингибиторы: тапсигаргин (Tg), циклопиазоновая кислота и 2,5-ди(1-бутил)гидроквинон. Наиболее специфичным из них является тапсигаргин, действие которого основано на связывании вблизи

Обзор Литературных Данных

3-го трансмембранного сегмента и необратимой инактивации всех изоформ фермента [20].

Еще одной системой выведения Са²⁺ из цитоплазмы является Na⁺/Ca²⁺-обменник плазматической мембраны. Этот механизм наиболее активен в мембранах электровозбудимых клеток. При натрий-кальциевом обмене три иона Na обмениваются на один ион Са'. Эта система работает обратимо: при искусственном понижении внеклеточной концентрации Na⁺ либо при повышении концентрации этого иона в цитоплазме может происходить вход Са²⁺ снаружи в обмен на внутриклеточный натрий. Поскольку этот процесс является электрогенным, он в большой степени , зависит от потенциала на мембране: деполяризация мембраны наряду с уменьшением трансмембранного градиента ионов натрия способствует входу Са²⁺ в клетку. Селективные ингибиторы Na⁺/Ca²⁺-o6MeHa не описаны. Для подавления транспорта Са²⁺ по этому пути чаще всего используют амилорид и его производные, а также хелаторы кальция (EGTA и ВАРТА). Другим ингибитором является доксорубицин [1]. Работа натрий-кальциевого обменника может значительно способствовать как высвобождению Са²⁺ из*; эндо(сарко)плазматического ретикулума и понижению люменальной концентрации Са²⁺ в депо, так и поддержанию входа Са в клетку [3,70].

Не менее важной системой, регулирующей концентрацию Са в цитоплазме, являются митохондрии. Митохондрии захватывают Са²⁺ с помощью одноионного переносчика, истинная молекулярная природа которого еще неизвестна. Входу Са в митохондрии способствует электрохимический градиент кальция, определяемый электрическим потенциалом на мембране митохондрий (» -150 - 200 мВ) и концентрацией Са внутри митохондрий (в нестимулированных клетках эта концентрация невысока и составляет ж 200 нМ [50]). Поддержанию низкой концентрации Са в митохондриях способствует, в первую очередь, работа натрий-кальциевого обменника. Последний отличается от Ка⁺/Са²⁺-обменника плазматической мембраны тем, что после Na⁺/Ca²⁺-обмена происходит быстрый обмен ионов Na⁺ на ионы Н⁺ [27]. В целом

Обзор Литературных Данных

у,

митохондрии проявляют низкоаффинную (константа диссоциации для Са «10 - 20 мкМ), но высокоемкостную (в том числе, благодаря образованию Са -

у, 'у,

содержащего осадка) систему захвата Са , мало активную при [Са ]_; меньше 1 мкМ [70]. Однако это не мешает митохондриям принимать активное участие в формировании агонист-индуцированного кальциевого ответа клетки (см. ниже).

Агонист-чувствительные Са²⁺-депо.

Повышение [Ca²⁺]j и генерация кальциевого сигнала клетки осуществляется не только за счет входа Са²⁺ из внеклеточной среды, но и за счет высвобождения Са²⁺ из внутриклеточных хранилищ.

Говоря о Са²⁺-сигнализации в качестве Са²⁺-депо, в первую очередь, рассматривают эндо(сарко)плазматический ретикулум (ЭР), либо его специализированные субкомпартменты (так называемые кальциосомы), поскольку именно они ответственны за динамические изменения [Ca²⁺]i при ответе клетки на внеклеточные стимулы [82]. Абсолютная концентрация Са в люмене ЭР для различных клеток была оценена в 5т50 мМ, а значения свободной концентрации Са варьирует в пределах 1-3 мМ. Такая высокая абсолютная концентрация Са²⁺ поддерживается за счет люминальных Са²⁺-связывающих белков. В первую очередь это кальсеквестрин (характерный для мышечных клеток) и кальретикулин (преобладающий в большинстве немышечных клеток). Кальсеквестрин содержит большое количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков на С-конце молекулы, образующих Са²⁺-связывающий домен с низкой аффинностью (средняя К_д = 1мМ) и высокой емкостью (« 50 Са -связывающих сайтов на молекулу). У кальретикулина, кроме множества (20-50) низкоаффинных сайтов связывания Са²⁺, имеется еще и высокоаффинный сайт связывания, расположенный вблизи центра молекулы. Другие многочисленные белки ЭР, в частности ВІР, р94 (эндоплазмин), Егр72, PDI и мембранный белок кальнексин, также могут связывать Са²⁺, проявляя низкую аффинность. Считается, что они связывают Са²⁺ за счет последовательностей двух-трех отрицательно заряженных аминокислотных остатков на N-конце. Также могут встречаться и белки (например,

Обзор Литературных Данных

ретикулокальбин и р55/кальсторин), несущие EF-мотивы и способные связывать Са с более высокой аффинностью. В целом, забуферивание Са в люмене ЭР зависит от набора Са -связывающих белков в конкретной клетке [82].

Основным посредником, способствующим высвобождению Са из агонист-чувствительных Са -депо в невозбудимых клетках, является 1Р₃. Связывание многочисленных гормонов и факторов роста с рецепторами плазматической мембраны приводит к активации фосфолипазы С (PLC), которая гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (РІРг) до инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Р₃) и диацилглицерина. Являясь водорастворимым, 1Рз диффундирует в цитоплазме клетки, где связывается со своими рецепторами (IP3R), расположенными на мембранах ЭР. Рецепторы 1Р₃ являются лиганд-управляемыми катионными каналами, которые при связывании с 1Р₃, изменяют свою конформацию, переходя в открытое состояние и высвобождая запасенный Са [8]. Рецепторы 1Р₃ образованы 4 субъединицами (общей массой порядка 1200 кДа). Известно 3 типа IP3R, различающихся по своим характеристикам (аффинность к 1Р₃, чувствительность к Са²⁺). Регуляция активности IP3R изменениями концентраций цитоплазматического Са²⁺ (увеличение активности при [Са²⁺]; « 0.5-1 мкМ, и ингибирование при [Са²⁺]; > 1 мкМ) во многом определяет развитие кальциевого сигнала в клетке [12, 83]. Раньше считалось, что для работы IP3R как канала абсолютно необходим 1Р₃, однако выяснилось, что кальций-связывающий белок СаВР способен активировать IP3R в отсутствии 1Р₃ [14]. СаВР принадлежит к субсемейству белков, содержащих EF-мотивы, имеющих высокое родство к кальмодулину и известных как нейрональные сенсоры кальция (NCS, "neuronal calcium sensors"). Это семейство состоит из группы небольших белков (« 20 кДа), которые экспрессируются исключительно в нейронах, а также в фоторецепторах сетчатки глаза. Одной из особенностей этого семейства является то, что они содержат консенсусную последовательность для миристилирования. Взаимодействие СаВР с IP₃R происходит на N-конце IP₃R (в пределах 600 аминокислотных остатков), где содержится и сайт связывания для 1Р₃. Взаимодействие между СаВР и IP3R значительно потенцируется при физиологических [Ca²⁺]j (0.1-1 мкМ). Взаимодействие СаВР с IP₃R при низких [Са²⁺]₍, предполагает, что свободный от

Обзор Литературных Данных

Са белок СаВР может быть связан с IP₃R и влияет на скорость активации IP3R. Существует, по крайней мере, 5 изоформ (со множеством вариантов сплайсинга) СаВР, экспрессия которых тканеспецифична. Более того, СаВР может участвовать и в других процессах. Так было показано, что in vitro СаВР активирует кальмодулин-зависимую киназу II и рецепторные киназы, сопряженные с G-белком.

Кроме IP₃R, высвобождению Са из ЭР способствуют рианодиновые рецепторы (RyR), структурно и функционально сходные с IP3R. Приблизительно в 2 раза превышая IP₃R по молекулярной массе и проводимости, RyR проявляют еще и отличную от IP₃R чувствительность к [Са ]; (активация при 1-Ю мкМ, ингибирование при > 10 мкМ). RyR не так широко распространены, как IP₃R и, в первую очередь, характерны для возбудимых клеток (таких как нейроны, клетки мышц). Свое название они получили из-за высокой аффинности к рианодину (алкалоиду растений). Рианодин связывается с каналом, когда тот находится в открытом состоянии. При низких концентрациях рианодина (1 - 10 мкМ) происходит стабилизация RyR в открытом состоянии, в то время высокие концентрации рианодина (« 100 мкМ) необратимо ингибируют RyR [15]. Активация RyR наблюдается при связывании циклической АДФ рибозы (цАДФР) и при связывании кофеина, которые приводят к увеличению чувствительности RyR к Са²⁺ настолько, что для активации канала оказывается достаточно базального уровня [Са²⁺], [69,15].

Многие сигнальные пути затрагивают активацию IP₃R и RyR. Активность этих каналов регулируется множеством факторов, включая фосфорилирование, адениновые нуклеотиды, рН, концентрацию Са²⁺ в цитоплазме и в люмене ЭР. Чувствительность обоих рецепторов к [Са ]; позволяет клетке осуществлять более тонкую регуляцию процесса формирования кальциевого сигнала.

Сфинголипиды (такие как сфингозилфосфорилхолин и сфингозин-1-фосфат) также могут приводить к опустошению Са²⁺-депо, без вовлечения в процесс высвобождения Са²⁺ рецепторов 1Р₃ или рианодина [13,43,128]. Механизм их действия, по-видимому, основан на активации Са²⁺-канала ЭР - SCaMPER ("sphingolipid Са -release mediating protein of endoplasmic reticulum"). Структурно данный белок отличается от IP₃R и RyR и гораздо меньше размером

Обзор Литературных Данных

(« 20 кДа). Но хотя его экспрессия наблюдается во многих типах тканей, свойства и физиологическая функция этого канала до сих пор неизвестны [15].

Са²⁺ -депо, чувствительные к NAADP были .обнаружены в трех видах яйцеклеток беспозвоночных (морского ежа, морской звезды и асцидий), в гроздевидных клетках поджелудочной железы .млекопитающих и в клетках мозга [69]. Будучи нечувствительными к ингибиторам рецепторов цАДФР (8-№і₂-цАДФР), 1Р₃ (гепарин) и рианодинового . (Mg , рианодин, прокаин), рецепторы NAADP чувствительны к высоким концентрациям блокаторов Са²⁺-каналов L-типа (например, верапамилу). Более того, в отличие от Са²⁺-депо, представленных ЭР, данные депо нечувствительны к тапсигаргину (блокатору SERCA). Опустошение данного типа Са²⁺-депо может выполнять как отдельную функцию, так и индуцировать изменения ..[Са²⁺]_;, способствующему последующему развитию Са²⁺-индуцированного высвобождения ионов Са²⁺ из Са -депо, представленных ЭР [69].

Обзор Литературных Данных

Кальций и митохондрии.

В течении длительного времени в качестве важного, если не основного компартмента, обеспечивающего поддержание низкого уровня [Са ];, рассматривали митохондрии. Позже из-за низкой концентрации Са²⁺ в митохондриях в нестимулированных клетках и низкоаффинной системы захвата Са²⁺, мало активной при субмикромолярных [Са²⁺]ь предположили, что митохондрии не играют существенной роли в поддержании кальциевого гомеостаза в обычных, непатологических условиях [1,19]. Однако оказалось, что при высвобождении Са²⁺ из ЭР (или саркоплазматического ретикулума) через IP₃R или RyR наблюдается значительное увеличение концентрации Са²⁺ в митохондриях (вплоть до 100 мкМ), несмотря на слабое увеличение [Ca²⁺]j, наблюдаемое в экспериментах [70]. Данная ситуация возможна за счет локального расположения мембран ЭР с IP₃R/RyR и мембран митохондрий с образованием микродоменов, в которых происходит большое увеличение [Са ]j [118,70,110]. Подобным образом митохондрии могут располагаться и вблизи каналов, определяющих вход Са²⁺ в клетку. В результате кратковременное повышение [Са ]j (« 10-20 сек), вызванное, например, Независимым высвобождением Са²⁺ из ЭР либо входом Са²⁺ через потенциал-управляемые каналы, может привести к длительному повышению концентрации Са²⁺ в митохондриях, длящемуся 5-10 мин [27,110]. Так'как часть Са²⁺, входящего в митохондрии связывается с фосфатом или фосфолипидами, то оценки концентрации ионизированного свободного Са²⁺ в митохондриях могут быть занижены.

Поскольку митохондрии содержат Са -зависимые дегидрогеназы, участвующие в цикле Кребса, то повышение концентрации Са²⁺ в митохондриях приводит к активации данных ферментов, возрастанию мембранного потенциала митохондрий и увеличению синтеза АТФ [57,27,113,70]. Благодаря своей способности захватывать Са , митохондрии влияют на пространственно-временные характеристики изменений [Са²⁺]_;. В частности, они предотвращают Са²⁺-зависимую инактивацию Са²⁺-каналов ЭР и плазматической мембраны, а

Обзор Литературных Данных

также могут определять степень опустошения агонист-чувствительных Са²⁺-депо, влияя на активацию депо-управляемых каналов (см. ниже) [113,70].

Кальций и ядро.

Поскольку ядро полностью окружено ядерной оболочкой, то концентрация Са²⁺ в ядре может изменяться несколько иначе, чем в цитоплазме [70,113]. Считается, что различие между концентрациями Са²⁺ в ядре и цитоплазме в нестимулированных клетках незначительны, так как ядерная оболочка содержит большие поры, которые неселективно проницаемы, при нормальных условиях, для молекул меньше 75 кДа. Возникновению градиента концентраций Са между ядром и цитоплазмой может способствовать то, что внутренняя мембрана ядра содержит мало SERCA, но содержит фосфолипазу С [113]. Также есть вероятность, что в ядре могут возникать локальные микродомены с высокой концентрацией Са²⁺, способные координировать локализацию ключевых факторов транскрипции и определять транскрипционную активность в этих доменах. Вероятно, слабо влияя на сами изменения [Са ]; в цитоплазме, возникновение градиента концентраций Са²⁺ между ядром и цитоплазмой может определять характер развития кальциевого , ответа клетки, за счет последовательного включения цитозольных/ядерных протеинкиназ, транслокации транскрипционных факторов и, соответствующего, изменения транскрипционной активности клетки [113].

Агонист-чувствительные Са +-депо

Повышение [Ca2+]j и генерация кальциевого сигнала клетки осуществляется не только за счет входа Са2+ из внеклеточной среды, но и за счет высвобождения Са2+ из внутриклеточных хранилищ.Говоря о Са2+-сигнализации в качестве Са2+-депо, в первую очередь, рассматривают эндо(сарко)плазматический ретикулум (ЭР), либо его специализированные субкомпартменты (так называемые кальциосомы), поскольку именно они ответственны за динамические изменения [Ca2+]i при ответе клетки на внеклеточные стимулы [82]. Абсолютная концентрация Са в люмене ЭР для различных клеток была оценена в 5т50 мМ, а значения свободной концентрации Са варьирует в пределах 1-3 мМ. Такая высокая абсолютная концентрация Са2+ поддерживается за счет люминальных Са2+-связывающих белков. В первую очередь это кальсеквестрин (характерный для мышечных клеток) и кальретикулин (преобладающий в большинстве немышечных клеток). Кальсеквестрин содержит большое количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков на С-конце молекулы, образующих Са2+-связывающий домен с низкой аффинностью (средняя Кд = 1мМ) и высокой емкостью (« 50 Са -связывающих сайтов на молекулу). У кальретикулина, кроме множества (20-50) низкоаффинных сайтов связывания Са2+, имеется еще и высокоаффинный сайт связывания, расположенный вблизи центра молекулы. Другие многочисленные белки ЭР, в частности ВІР, р94 (эндоплазмин), Егр72, PDI и мембранный белок кальнексин, также могут связывать Са2+, проявляя низкую аффинность. Считается, что они связывают Са2+ за счет последовательностей двух-трех отрицательно заряженных аминокислотных остатков на N-конце. Также могут встречаться и белки (например,ретикулокальбин и р55/кальсторин), несущие EF-мотивы и способные связывать Са с боее высокой аффинностью. В целом, забуферивание Са в люмене ЭР зависит от набора Са -связывающих белков в конкретной клетке [82].

Основным посредником, способствующим высвобождению Са из агонист-чувствительных Са -депо в невозбудимых клетках, является 1Р3. Связывание многочисленных гормонов и факторов роста с рецепторами плазматической мембраны приводит к активации фосфолипазы С (PLC), которая гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (РІРг) до инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Р3) и диацилглицерина. Являясь водорастворимым, 1Рз диффундирует в цитоплазме клетки, где связывается со своими рецепторами (IP3R), расположенными на мембранах ЭР. Рецепторы 1Р3 являются лиганд-управляемыми катионными каналами, которые при связывании с 1Р3, изменяют свою конформацию, переходя в открытое состояние и высвобождая запасенный Са [8]. Рецепторы 1Р3 образованы 4 субъединицами (общей массой порядка 1200 кДа). Известно 3 типа IP3R, различающихся по своим характеристикам (аффинность к 1Р3, чувствительность к Са2+). Регуляция активности IP3R изменениями концентраций цитоплазматического Са2+ (увеличение активности при [Са2+]; « 0.5-1 мкМ, и ингибирование при [Са2+]; 1 мкМ) во многом определяет развитие кальциевого сигнала в клетке [12, 83]. Раньше считалось, что для работы IP3R как канала абсолютно необходим 1Р3, однако выяснилось, что кальций-связывающий белок СаВР способен активировать IP3R в отсутствии 1Р3 [14]. СаВР принадлежит к субсемейству белков, содержащих EF-мотивы, имеющих высокое родство к кальмодулину и известных как нейрональные сенсоры кальция (NCS, "neuronal calcium sensors"). Это семейство состоит из группы небольших белков (« 20 кДа), которые экспрессируются исключительно в нейронах, а также в фоторецепторах сетчатки глаза. Одной из особенностей этого семейства является то, что они содержат консенсусную последовательность для миристилирования. Взаимодействие СаВР с IP3R происходит на N-конце IP3R (в пределах 600 аминокислотных остатков), где содержится и сайт связывания для 1Р3. Взаимодействие между СаВР и IP3R значительно потенцируется при физиологических [Ca2+]j (0.1-1 мкМ). Взаимодействие СаВР с IP3R при низких [Са2+](, предполагает, что свободный от

Са белок СаВР может быть связан с IP3R и влияет на скорость активации IP3R. Существует, по крайней мере, 5 изоформ (со множеством вариантов сплайсинга) СаВР, экспрессия которых тканеспецифична. Более того, СаВР может участвовать и в других процессах. Так было показано, что in vitro СаВР активирует кальмодулин-зависимую киназу II и рецепторные киназы, сопряженные с G-белком.

Кроме IP3R, высвобождению Са из ЭР способствуют рианодиновые рецепторы (RyR), структурно и функционально сходные с IP3R. Приблизительно в 2 раза превышая IP3R по молекулярной массе и проводимости, RyR проявляют еще и отличную от IP3R чувствительность к [Са ]; (активация при 1-Ю мкМ, ингибирование при 10 мкМ). RyR не так широко распространены, как IP3R и, в первую очередь, характерны для возбудимых клеток (таких как нейроны, клетки мышц). Свое название они получили из-за высокой аффинности к рианодину (алкалоиду растений). Рианодин связывается с каналом, когда тот находится в открытом состоянии. При низких концентрациях рианодина (1 - 10 мкМ) происходит стабилизация RyR в открытом состоянии, в то время высокие концентрации рианодина (« 100 мкМ) необратимо ингибируют RyR [15]. Активация RyR наблюдается при связывании циклической АДФ рибозы (цАДФР) и при связывании кофеина, которые приводят к увеличению чувствительности RyR к Са2+ настолько, что для активации канала оказывается достаточно базального уровня [Са2+], [69,15].

Многие сигнальные пути затрагивают активацию IP3R и RyR. Активность этих каналов регулируется множеством факторов, включая фосфорилирование, адениновые нуклеотиды, рН, концентрацию Са2+ в цитоплазме и в люмене ЭР. Чувствительность обоих рецепторов к [Са ]; позволяет клетке осуществлять более тонкую регуляцию процесса формирования кальциевого сигнала.Сфинголипиды (такие как сфингозилфосфорилхолин и сфингозин-1-фосфат) также могут приводить к опустошению Са2+-депо, без вовлечения в процесс высвобождения Са2+ рецепторов 1Р3 или рианодина [13,43,128]. Механизм их действия, по-видимому, основан на активации Са2+-канала ЭР - SCaMPER ("sphingolipid Са -release mediating protein of endoplasmic reticulum"). Структурно данный белок отличается от IP3R и RyR и гораздо меньше размером (« 20 кДа). Но хотя его экспрессия наблюдается во многих типах тканей, свойства и физиологическая функция этого канала до сих пор неизвестны [15].

Кроме Са -депо, представленных ЭР и освобождающих Са через IP3R или RyR, существуют и другие депо Са . Одновременно с Са -мобилизующей активностью цАДФР, такая же способность была показана и для аденин динуклеотид фосфата никотиновой кислоты (NAADP) [15, 69]. В отличии от цАДФР, которая является метаболитом никотинамид аденин динуклеотида (NAD), NAADP представляет собой метаболит никотинамид аденин динуклеотид фосфата (NADP). Хотя цАДФР и NAADP структурно и функционально различаются, они синтезируются одними ферментами - АДФ-рибозил циклазой и ее гомологом CD38. Данные ферменты не только катализируют образование кольца у NAD с образованием цАДФР, но и обмен никотинамидной группы NADP на никотиновую кислоту с образованием NAADP. Активность циклазы регулируется фосфорилированием и зависит от циклических нуклеотидов. Так увеличение циклического ГМФ под действием оксида азота активирует циклазу и ведет к образованию цАДФР и последующему высвобождению Са2+. С другой стороны, активация циклазы с помощью циклического АМФ ведет к увеличению активности обмена оснований и образованию NAADP.Са2+ -депо, чувствительные к NAADP были .обнаружены в трех видах яйцеклеток беспозвоночных (морского ежа, морской звезды и асцидий), в гроздевидных клетках поджелудочной железы .млекопитающих и в клетках мозга [69]. Будучи нечувствительными к ингибиторам рецепторов цАДФР (8-№і2-цАДФР), 1Р3 (гепарин) и рианодинового . (Mg , рианодин, прокаин), рецепторы NAADP чувствительны к высоким концентрациям блокаторов Са2+-каналов L-типа (например, верапамилу). Более того, в отличие от Са2+-депо, представленных ЭР, данные депо нечувствительны к тапсигаргину (блокатору SERCA). Опустошение данного типа Са2+-депо может выполнять как отдельную функцию, так и индуцировать изменения ..[Са2+];, способствующему последующему развитию Са2+-индуцированного высвобождения ионов Са2+ из Са -депо, представленных ЭР [69].

Метаболизм 1Рз

Хоть 1Рз и способен легко диффундировать в цитоплазме клетки, его действие является кратковременным в результате работы ферментов, приводящих к его метаболизму. Метаболизм ІР3 в клетках млекопитающих инициируется двумя ферментами: 5-фосфатазой, отщепляющей фосфатную группу, и 3-киназой, катализирующей АТФ-зависимое фосфорилирование 1Р3 [103] (см. рис. 1). Основную роль в метаболизме 1Р3, по-видимому, играет 3-киназа. Этот фермент имеет очень высокое сродство по отношению к 1Р3 (значение Км = 0.2-1.5 нМ, что значительно превосходит Км для 5-фосфатазы, равное 10 мкМ) [1,92]. Кроме того, активность 3-киназы благодаря взаимодействию с кальмодулином повышается при увеличении уровня [Ca2+]j [1]. Учитывая данные о возможности обратного превращения инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфата в 1Р3 под влиянием 3-фосфомоноэстеразы инозитолтетракисфосфата, можно предполагать, что последний выполняет роль буфера, из которого пополняются запасы 1Р3. По некоторым данным это соединение активирует вход Са2+ (возможно напрямую через специфические каналы в плазматической мембране) Иноїитол [76]. В других случаях активация входа Са2+ с помощью 1Р3 требовала также и присутствия инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфата [8]. Существуют также предположения, что данное соединение контролирует перенос Са2+ между внутриклеточными пулами [10]. Хотя в экспериментах с инозитол-2,4,5-трисфосфатом показано, что для рецепторной активации входа Са необходимо и достаточно только 1Р3 [103]. С реакции, катализируемой 3-киназой начинается образование других высших фосфатов инозитола, которые, возможно, выполняют важные биологические функции [1]. В целом, физиологическая роль производных инозитола исследована все еще недостаточно. В конце концов, основная часть этих веществ дефосфорилируется до инозитола, который используется для ресинтеза Р1Р2.

Изменения концентрации 1Р3 преобразуются в концентрационные флуктуации Са2+ в цитоплазме благодаря работе рецептора 1Р3, который представляет собой трансмембранный белок, являющийся каналом, и ответственен за высвобождение Са2+ из депо. Молекулярное клонирование выявило существование, по крайней мере, трех типов рецептора IP3 (IP3RI, IP3R2 и IP3R3), экспрессируемых с разных генов. Для каждого из них существуют дополнительные варианты, обусловленные альтернативным сплайсингом. В клетках одного типа могут присутствовать различные изоформы IP3R. На данный момент, наиболее изученным типом IP3R является IP3RI, для которого получено изображение трехмерной структуры. Основное различие между изоформами IP3R заключается в их аффинности к IP3: IP3R2 IP3R1 IP3R3 [95]. Все известные варианты IP3R имеют довольно высокое сходство между собой., Так у крысы рецепторы 1Р3 разных типов гомологичны между собой на 62-68 % [127]. Анализ аминокислотной последовательности обнаружил сходства первичной структуры IP3R с рианодиновым рецептором (RyR) [28,32]. Так же, как и RyR, IP3R образует тетрамерную структуру, с молекулярной массой отдельных субъединиц порядка 260 кДа (2600-2800 аминокислот) [32].

Шесть трансмембранных доменов IP3R, образующих проницаемую для Са пору, расположены ближе к С-концу рецептора, при этом С- и N-концы молекулы обращены в цитоплазму. Узнавание и связывание 1Р3 осуществляется на N-конце белка, на расстоянии более чем 1400 аминокислот от трансмембранных доменов. Связывающий (или модуляторный) домен представляет собой мишень для физиологической регуляции IP3R - здесь расположены сайты связывания АТФ, кальция, кальмодулина, сайты фосфорилирования цАМФ-зависимой и цГМФ-зависимой протеинкиназой, протеинкиназой С,. Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназой [32,79,83]. Исследование IP3R с помощью встраивания его в бислойные липидные мембраны [12] показало, что при использовании в качестве носителя тока 50 мМ Са ионный канал, образуемый рецептором, v .имеет 4 кратных уровня проводимости - 20, 40, 60 и 80 пСм. Наибольшее время открытого состояния наблюдалось на третьем уровне проводимости (2-7 мсек, а для остальных уровней менее 1.5 мсек). Ионный канал рецептора 1Р3 слабо селективен для двухвалентных катионов относительно ионов калия (Рва/Рк = 6.3), а ряд селективности для двухвалентных катионов выглядит следующим образом: Ва2+ у, 7+ 7-і Sr Са Mg [11]. Коэффициент Хилла для концентрационной зависимости IP3R от 1Р3 оказался равным 1. Полученные данные позволили авторам предположить, что для открывания канала достаточно связывания одной молекулы 1Р3 на любой из 4 субъединиц тетрамерного комплекса. IP3R специфично узнает ГР3 среди других инозитолфосфатов. Однако нужно отметить, что физиологические метаболиты 1Р3, не вызывая ток Са2+ через IP3R, способны значительно ингибировать связывание ГР3 [28,83]. Ингибирование IP3R наблюдается и при использовании гепарина -сульфатированного мукополисахарида, структура мономеров которого очень похожа на структуру 1Р3 [1] Особый интерес представляют данные о функциональном связывании IP3R с предшественником 1Рз - с фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатом (РІРг) [77]. В работе с бислойными мембранами было показано, что Р1Р2 образует стабильные комплексы с IP3R, приводящие к ингибированию активности IP3R. В то же время разрушение комплекса IP3R-PIP2 с помощью специфических моноклональных антител к Р1Р2, приводило к увеличению активности IP3R в 3-4 раза и изменению кажущейся аффинности к 1Р3 в 10 раз.

Данное обстоятельство играет, очевидно, важную роль в генерации 1Р3-индуцированного высвобождения Са2+ и в развитии кальциевого ответа клетки. Не менее важным свойством IP3R, определяющим кинетику развития кальциевого сигнала, является его зависимость от концентрации Са2+ в цитоплазме и в люмене ЭР. Зависимость активности каналов от [Са ]; представляет собой колоколообразную кривую, с максимумом активности в пределах 200-ЗООнМ и с резким спадом активности по обе стороны от максимума (при использовании в качестве агониста 5 мкМ 1Р3) [12,54]. Зависимость активности IP3R от [Са2+]; может отражать функционирование механизма обратной связи в ходе 1Р3-индуцированного высвобождения Са из депо. В дальнейшем было показано, что положение максимума этой кривой смещается в зависимости от используемой концентрации 1Р3 [86]. В нативных клетках эта зависимость может резко меняться за счет взаимодействия с другими белками, как в случае с ингибированием кальмедином связывания 1Р3 с IP3R мозжечка крысы при [Са2+]; равной 100-300нМ [32]. Концентрация Са2+ в люмене ЭР влияет как на 1Р3-индуцированное высвобождение Са2+, так и на связывание ГР3 в различных типах клеток (гепатоцитах, эпителиальных клетках, фибробластах, клетках гладких мышц) и в различных экспериментальных условиях [84]. Депо с низким содержанием Са2+ слабее отвечают на 1Р3. Увеличение содержания Са на 30 % от минимального уровня загруженности ("steady-state"), значительно увеличивало способность 1Р3 высвобождать Са2+. Однако при дальнейшем повышении концентрации Са2+ в люмене ЭР процесс выходил на плато [94]. Кроме того, в пермеабилизованных клетках А7г5, активность каналов в слабо загруженном депо (34 пМ Са2+/106 клеток) зависела от одновременного присутствия Са2+ в цитозоле в субмикромолярных концентрациях. Напротив, в полностью загруженном Са2+

Другие SOC-каналы

Одной из основных проблем при исследовании депо-управляемых Са каналов, и в частности CRAC-каналов, состоит в отсутствии селективного ингибитора. Так было показано, что эконазол .и SKF96365 при сходных концентрациях блокируют не только CRAC-каналы, но также хлорные и неселективные каналы [93]. Хотя ICRAC был зарегистрирован во многих типах клетках, при опустошении Са2+-хранилищ могут активироваться и другие, проницаемые для Са , SOC-каналы, отличающиеся ионной селективностью. Активация различных видов SOC-каналов наблюдалась, например, в ооцитах Xenopus [126], в гроздевидных клетках поджелудочной железы [67], в клетках гладких мышц [117], в эпителиальных клетках [89]. В гроздевидных клетках поджелудочной железы опустошение Са2+ хранилищ (вызванное добавлением ацетилхолина, 1Р3, тапсигаргина, иономицина) приводило к развитию неселективного катионного тока (ICRANC) [67], переносящего также ионы Са . В отличии от CRAC-каналов, проводимость Обзор Литеуатурн ых Дани ых CRANC-каналов составила 40-45 пСм. Каналы оказались слабо селективеными для двухвалентных катионов и не ингибировались La3+, Gd3+, Со2+, Cd2+. Кроме того выяснилось, что флюфенамная кислота (ингибитор неселективных катионных каналов) и генестеин (но не лавендустин А или тирфостин В56 -другие ингибиторы тирозин киназ) ингибировали ICRANC В клетках гладких мышц были зарегистрированы катионные каналы, также активируемые в ответ на опустошение Са2+-хранилищ [117], с приблизительно одинаковой селективностью для Са2+, Ва2+, Sr2+, Na+, К+, Cs+. Авторы показали активацию каналов, проводимостью около 3 пСм и с потенциалом реверсии 0 мВ, в ответ на действие тапсигаргина и ВАРТА-АМ.

Данные каналы блокировались Ni2+ (5мМ) .и La3+ (2мМ). Кроме того, вероятность открытого состояния этих каналов возрастала при положительных потенциалах, а интегральный ток имел выходящее выпрямление, что резко отличает его от описанного выше ICRAC Неселективные S ОС-каналы, проницаемые для Са , были зарегистрированы и в клетках околочелюстных желез [73]. Токи через данные каналы также имели нулевой потенциал реверсии, но проводимость каналов составила порядка 20 пСм. Они ингибировались 2-АРВ, ксестопонджином С, Gd3+,La3+. Различные виды депо-управляемых Са2+-каналов, с отличными от CRAC-каналов характеристиками (селективность, проводимость) были описаны и для эпителиальных клеток (см. обзор Hunuyca иДругмэнса [89]). Рассмотрим некоторые механизмы регуляции входа Са2+. Речь, в первую очередь, пойдет о CRAC-каналах, поскольку, как уже упоминалось, они являются наиболее хорошо исследованными среди SOC-каналов. Вызывая Са -зависимую потенциацию с внешней стороны мембраны, кальций, оказавшийся в цитоплазме, приводит к ингибированию ICRAC [51,134]. При этом быстрая Са -инактивация каналов осуществляется за несколько миллисекунд, и хорошо видна при подаче импульсов потенциала ступенеобразной формы [51,52]. Так при скачке потенциала с 0 мВ на -100 мВ через 50 мс наблюдался спад тока на 64 % (при 10 мМ EGTA во внутриклеточном растворе) и на 30 % (при 10 мМ ВАРТА - более быстрого хелатора Са ) [52]. Цвейфах и Льюис на клетках линии Jurkat показали, что ингибиторное влияние Са на CRAC-каналы локализовано в пределах 3-4 нм от поры каналов.

Они предположили, что сайт связывания Са должен быть расположен на самом Са -канале [134]. Следует отметить, что при регистрации одновалентных токов Na+ через CRAC-каналы в DVF-условиях, быстрая инактивация не наблюдается [71]. Кроме быстрой Са -инактивации при развитии ICRAC наблюдается и более медленная инактивация CRAC-каналов, вызванная повышением концентрации Са2+ в цитоплазме - это может быть инактивация, как за счет перезаполнения Са2+-депо [4,30,31,36,47,135], так и непосредственно за счет влияния цитоплазматического Са2+ [91,135]. По-видимому, наличие такого механизма обратной связи, как Са2+-инактивация, играет важную роль в определении пространственно-временнго характера развития кальциевого ответа. Как показано в работе Парекха [91] медленная Са2+-инактивация приводит к значительной потери активности ICRAC (50-70 % через 300 с) при у, умеренном забуферивании внутриклеточного Са (1.4 мМ EGTA). Медленная Са -инкативация приводит к тому, что CRAC-каналы остаются в инактивированном состоянии даже спустя несколько минут после понижения [Ca2+]i. При этом ингибирование Са2+-АТФаз, протеинкиназ, G-белков, Са2+-зависимых протеаз слабо влияло на развитие данной инактивации. Из этого был сделан вывод, что медленная Са2+-инактивация является основным механизмом ингибирования ICRAC В клетках RBL, определяя продолжительность входа Са2+, вызванного опустошением Са2+-депо. В отличии от работы Парекха [91], Цвейфах и Льюис [135] также показали наличие медленной Са -инактивации на Т-лимфоцитах, но частично она объяснялась перезаполнением Са2+-депо (поскольку блокирование Са2+-АТФаз снижало величину Са -инактивации на 50 %). Некоторые ингибиторы фосфатаз (окадаиковая кислота и 1-норакодаон, но не каликулин А, циклоспорин А и FK506) значительно снижали Са2+-инактивацию. А выдерживание клеток в бескальциевых условиях приводило к восстановлению активности ICRAC» то есть к обратимости медленной Са -инактивации.

Поскольку CRAC-каналы активируются при опустошении Са2+-депо, то не удивительно, что состояние Са2+-депо определяет активность каналов. В этом отношении, важным фактором в регуляции активности ICRAC служит перезаполнение Са -хранилищ. Считается, что высокие [Са \х блокируют развитие ICRAC» В первую очередь, за счет перезаполнения Са -депо, а не за счет прямого действия на CRAC-каналы или IP3R [17,36]. В этом отношении следует отметить особую роль Са -АТФаз ЭР (SERCA) в этом процессе, особенно в физиологических условиях [4,30,31,36]. Повышение [Ca2+]j усиливает активность SERCA, а модулирование функционального состояния SERCA может определять динамику развития Са2+ сигнала. Однако эффект высоких [Ca2+]j на активность ICRAC может быть и не связан с перезаполнением Са -депо [47]. Хофер и др. [47] показали, что после активации CRAC-каналов, за счет непосредственного понижения Са2+ внутри у, Са -депо (в работе использовался мембранно-проникающий низкоаффинный хелатор Са2+ - TPEN, быстрое восстановление концентрации Са2+ в депо не сразу блокировало ICRAC _ активность тока спадала достаточно медленно. Хотя гиперполяризация плазматической мембраны приводит к увеличению электрохимического градиента для Са2+, способствуя входу Са2+, а деполяризация приводит к обратному эффекту, существуют данные о том, что гиперполяризация мембраны приводит к частичной инактивации ICRAC [5]. При этом считается, что ни быстрая, ни медленная Са -инактивация не ответственны полностью за наблюдаемый эффект. Оказалось, что при регистрации интегральных токов при 0 мВ и при -60 мВ наблюдается значительная разница в развитии ICRAC (С большей амплитудой тока при меньших потенциалах). В последнее время все больше данных появляется об участии митохондрий в кальциевой сигнализации и, в частности, об их влиянии на вход Са . Так предобработка различных клеток различными ингибиторами, подавляющими нормальное функционирование митохондрий (олигомицином, ротеноном), значительно уменьшала вход Са , слабо влияя на высвобождение

TRP-семейство каналов в клетках млекопитающих

В клетках млекопитающих было обнаружено около 20 изоформ белков семейства TRP, разделенных на несколько подгрупп [23,40]. Они широко распространены в тканях млекопитающих, но их физиологические функции еще неизвестны. Каналы TRP-семейства вовлечены в ответ клетки на температуру, боль, окислительный стресс, изменение осмотического давления, гормоны, свет [38,87]. Общей основой TRP-каналов является их связь с фосфатидил-инозитольным каскадом передачи сигнала, который либо вовлечен в их активацию, либо оказывает модулирующее влияние. Однако активация TRP-каналов не обязательно связана с опустошением Са2+-депо. Роль TRP-каналов в депо-управляемом входе Са2+ достаточно противоречива. В большинстве клеток экспрессируются обычно несколько подтипов TRP-каналов. Одна из проблем анализа функций и свойств TRP-каналов заключатся в наличии базального уровня эндогенных депо-управляемых и TRP-каналов. Поэтому уменьшение уровня экспрессии одних каналов может восполняться за счет экспрессии других каналов подгруппы [120]. Кроме того, белки TRP-семейства могут образовывать гетеромерные комплексы [23,87,131], что также усложняет их исследование. Показано, что TRP-каналы состоят из субъединиц с шестью трансмембранными доменами (S1-S6) и с N- и С-концами, обращенными в цитоплазму. Предполагается, что эти субъединицы собранны в тетрамеры и образуют неселективные катионные каналы, обеспечивающие вход Са2+ в клетки. Большинство TRP-каналов относительно неселективны для катионов и их активация приводит к деполяризации мемраны [23,40]. TRP-семейство можно поделить по степени гомологии на три подгруппы, обозначенные Хартенеком и др. [40] как "short", "long" и "osm-9-like". Аналогичное деление встречается и у Клэпхэма и др. [23], использующих следующую номенклатуру: TRPCx ("short" или "canonical"), TRPVx ("osm-9-like" или "vanilloid") TRPMx ("long" или "melastatin").

Существуют еще три подгруппы TRP-семейства (TRPP, TRPML и TRPN), сильно отличающиеся по гомологии от TRP-каналов Drosophila [87]. Меньше всего гомологии наблюдается на С-конце белков TRP, тогда как домен S6 наиболее консервативен. TRPV- и TRPM-подгруппы имеют от двух до четырех анкириновых повтора на N-конце. А белки TRPC и TRPM содержат пролин-богатые участки вблизи С-конца [23]. TRPC-семейство, в свою очередь, можно поделить по гомологии и функциональным характеристикам, на четыре подгруппы: TRPC1, TRPC4,5, TRPC3,6,7 и TRPC2 [23,120]. Белки TRPC-семейства, аналогично TRP белкам Drosophila, имеют несколько анкириновых повторов на N-конце белка, которые могут участвовать в ассоциации с цитоскелетом клетки. Также TRPC на С-конце молекулы содержат высококонсервативную последовательность - «TRP-бокс» (EWKFAR) [120]. Кроме того, некоторые члены TRPC-семейства (белки TRPC 1,3 человека и белки TRPC4-7 мыши) содержат на С-конце сайты связывания с кальмодулином и IP3R, которые, вероятно, перекрываются. И если IP3R может участвовать в активации каналов [65,63,112], то кальмодулин, по-видимому, ингибирует активность каналов, влияя на время развития их активности [119].

Существуют противоречивые данные о депо-зависимости каналов данного семейства - имеются данные, говорящие как в пользу того, что TRPC-каналы являются депо-управляемыми, так и против этого. Предполагается, что механизм активации данных каналов зависит от типа клеток, от доступности остальных компонентов каскада, определяющего депо-зависимость, а также от образования мультимерных комплексов экспрессируемых белков TRPC с эндогенными каналами клетки [120]. Обзор Литературных Данных Не следует забывать, что активация токов под действием DAG (см. табл.) может быть обусловлена активацией фосфолипазы С [29]. Хотя каналы TRPC-семейства и были предложены в качестве возможных кандидатов на депо-управляемые каналы, по характеристикам токов через экспрессируемые каналы они отличаются от CRAC-каналов. С другой стороны, благодаря мультимеризации, не исключено, что они входят в состав поры, образующей CRAC-канал. TRPV-семейство делится на 3 подгруппы: TRPV1,2 (ванилоидные рецепторы - VR1 и VR2), TRPV4 и TRPV5,6 (известные также как ЕСаС1,2/СаТ2,1 - эпителиальные Са2+-каналы/транспортеры Са2+) [23,120]. Члены данного семейства тоже содержат несколько анкириновых повторов на N-конце белка. Однако у них отсутствует «TRP-бокс» [120], функциональную роль которого еще предстоит выяснить.

Агонист-индуцированный и депо-управляемый вход кальция в клетки А431 Гусев Константин Олегович

Агонист-чувствительные Са +-депо

Метаболизм 1Рз

Другие SOC-каналы

TRP-семейство каналов в клетках млекопитающих

Похожие диссертации на Агонист-индуцированный и депо-управляемый вход кальция в клетки А431