Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУР АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА 13
2.2. РОЛЬ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ПРОВЕДЕНИИ СИГНАЛА И
РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ 15
БЕЛКИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ЯДРЕ 20
БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ СПЕКТРИНОВЫЕ ПОВТОРЫ, В ЯДРЕ 21
АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК - а-АКТИНИН 22
2.5.1. Фрагменты а-актинина .' 27
2.6. АДГЕЗИЯ КЛЕТОК К ВНЕКЛЕТОЧНОМУ МАТРИКСУ 28
Комплексы адгезии 28
Сигналы, активируемые клеточной адгезией 29
Изменение экспрессии генов в результате адгезии 31
2.7. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР NF-kB 33
2.7.1. Характеристика кВ-специфических ДНК-белковых комплексов 37
2.8. ЭПИДЕРМАЛЬНЫЙ ФАКТОР РОСТА (ЭФР) И ЕГО РЕЦЕПТОР 38
2.8.1. Сигнальные пути в клетке, активируемые ЭФР 39
2.9. ДАННЫЕ, ПОЛУЧЕННЫЕ В ПРЕДЫДУЩИХ РАБОТАХ ЛАБОРАТОРИИ
БИОЛОГИИ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ 41
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК А431 44
АДГЕЗИЯ КЛЕТОК НА ФИБРОНЕКТИНЕ 44
3.2.1. Обработка клеток ЭФР и цитохалазином Д 44
3.3. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ 45
3.4. АНТИТЕЛА, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ ДЛЯ НЕПРЯМОЙ
ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ИММУНОБЛОТИНГА 46
3.5. СУБКЛЕТОЧНОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ 47
3.5.1. Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков 47
3.5.2. Получение ядерных подфракций по методу Двайера и Блоубела с
модификациями 48
3.5.3. Фракционирование с помощью коммерческого набора 49
ИММУНОБЛОТИНГ БЕЛКОВЫХ ЭКСТРАКТОВ КЛЕТОК 49
ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕНЫХ ДВУЦЕПОЧЕЧНЫХ ДНК ЗОНДОВ 49
АНАЛИЗ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЯДЕРНЫХ ЭКСТРАКТОВ МЕТОДОМ ТОРМОЖЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В ГЕЛЕ 50
СОЧЕТАНИЕ МЕТОДОВ ТОРМОЖЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В ГЕЛЕ И ВЕСТЕРН-БЛОТ-АНАЛИЗА 51
МЕТОД GST-PULLDOWN 52
3.11. ПОЛУЧЕНИЕ СВОБОДНЫХ N-ИЛИ С- КОНЦЕВЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Р65 В РАСТВОРЕ ПОСЛЕ ПЕРЕВАРА ТРОМБИНОМ
СЕФАРОЗЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ N-ИЛИ С- КОНЦЕВЫМИ ДОМЕНАМИ
Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ 53
3.12. АНАЛИЗ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ БЕЛКОВ
МЕТОДОМ ТОРМОЖЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ ДНК В ГЕЛЕ (IN VITRO BAND-
SHIFT) 54
3.13. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ 55
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 56
4.1. РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ А431 ПОД
ВЛИЯНИЕМ ЭФР 56
4.2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ RELA/P65 В КЛЕТКАХ А431 57
Иммунофлуоресцентный анализ совместной локализации RelA/p65 и F-актина в клетках, распластанных на фибронектине, и после воздействии ЭФР 57
Влияние адгезии на распределение RelA/p65 в субклеточных фракциях 61
4.2.3. Влияние ЭФР на распределение RelA/p65 в клетках, культивируемых на
пластике и клетках, распластанных на фибронектине 63
4.3. ВЛИЯНИЕ ЦХ Д НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ RELA/P65 В КЛЕТКАХ А431 64
Реорганизация актинового цитоскелета после воздействия цитохалазина Д и последующего добавления ЭФР 64
Иммунофлуоресцентный анализ распределения RelA/p65 в клетках А431 под влиянием ЦХ Д 66
Вестерн-блот-анализ распределения RelA/p65 в субклеточных фракциях под
влиянием ЭФР в клетках, актиновый цитоскелет которых разрушен ЦХ Д 68
АНАЛИЗ АКТИН-СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЕЙ ДИСКРЕТНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ RELA/P65 В ЦИТОПЛАЗМЕ 69
а-АКТИНИНЫ В КЛЕТКАХ А431 72
Иммунофлуоресцентный анализ распределения а-актининов в клетках А431....72
Особенности распределения изоформ а-актинина в субклеточных фракциях....74
4.5.3. Сравнение методов субклеточного фракционирования для выявления а-
актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431 76
4.5.3.1. Оценка целостности ядер после клеточного лизиса 77
4.5.3.2. Выявление а-актинина-1 и а-актинина-4 в субклеточных фракциях,
выделенных из предварительно замороженных клеток и клеток без предварительного
замораживания 78
4.5.3.3. Распределение а-актининов в ядерных подфракциях 80
4.6. СОВМЕСТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ а-АКТИНИНА-1, а-АКТИНИНА-4 И Р65
СУБЪЕДИНИЦЫ NF-кВ В КЛЕТКАХ А431 82
4.6.1. Иммунофлуоресцентный анализ областей солокализации RelA/p65 с а-
актинином-1 или а-актиниыом-4 в клетках А431, распластанных на фибронектине 82
4.6.2. RelA/p65, а-актинин-1 и а-актинин-4 в субклеточных фракциях 83
4.7. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРЯМОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ RELA/P65
И а-АКТИНИНОВ МЕТОДОМ GST PULL-DOWN 85
Характеристика а-актинина, очищенного из желудков цыпленка, и а-актинина, очищенного из почек свиньи при окрашивании антителами к а-актинину-1 и а-актинину-4 85
Исследование возможности прямого взаимодействия р65 и а-актининов 88
4.8. ВОЗМОЖНОСТЬ УЧАСТИЯ а-АКТИНИНА-4 В РЕАКЦИИ ДНК-СВЯЗЫВАНИЯ
NF-кВ С КОНСЕНСУСНЫМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ кВ 89
Конкурентный анализ с антителами к RelA/p65, р50 или а-актинину-4 89
Анализ состава комплексов при использовании сочетания вестерн-блот-анализа и торможения ДНК-белковых комплексов в геле (shift-western) 90
4.8.2.1. Подвижность белков в нативном геле 91
4.8.2.2. Анализ состава кВ-специфичных комплексов при сочетании методов
торможения ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блотинга 92
4.8.3. Возможность участия а-актинина-4 в реакции ДНК-связывания NF-кВ с
консенсусными последовательностями кВ 93
5. ОБСУЖДЕНИЕ 96
5.1. Реорганизация актинового цитоскелета сопровождает ядерную транслокацию и
перераспределение в цитоплазме р65 субъединицы NF-кВ и активацию NF-кВ 96
Особенности распределения RelA/p65, а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431 при распластывании на фибронектине и под влиянием ЭФР 100
Сравнение субклеточного распределения изоформ а-актинина 104
Взаимодействие изоформ а-актинина и р65 и участие а-актинина-4 в образовании кВ-специфичных ДНК-белковых комплексов 109
ВЫВОДЫ 114
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 115
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 117
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АА - акриламид
AT - антитела
АТФ - аденозинтрифостат
ДМЕМ - модифицированная среда Дальбекко
ДТТ- 1,4-дитиотреитол
ПААГ - полиакриламидный гель
Пл - пластик
Фн - фибронектин
ЦХ Д - цитохалазин Д
ЭДТА - этилендиаминтетрацетат динатрия
ЭФР - эпидермальный фактор роста
А2А-рецептор — аденозиновый рецептор
CDK - циклин-зависимая киназа
CREB - фактор транскрипции, активность которого зависит от сигнала ц-АМФ
ErbB - семейство рецепторов эпидермального фактора роста
ERK - внеклеточная сигнал-регулирующая киназа
GST - глютатион S -трансфераза
ІСАМ-1 - молекулой межклеточной адгезии-1
IL - интерлейкин
MAP- киназы - митоген-активирующие киназы
МСС -цитоплазматический белок, блокирующий клеточный цикл
NLS - сигнал ядерной локализации
NMDA-рецептор - ионотропный рецептор глутамата, связывающий К-метил-О-аспартат
PBS - Na-фосфатный буфер
РКА - протеин киназа А
SRF - фактор, активируемый сывороткой TAF - фактор, ассоциированный с ТВР ТВР - белок, связывающий TATA TNF-a — фактор некроза опухоли-альфа
Введение к работе
Актиновые филаменты вместе с микротрубочками и промежуточными филаментами образуют динамическую сеть в цитоплазме клеток, называемую цитоскелет, которая определяет форму клетки и лежит в основе клеточной миграции, участвует в межклеточной адгезии и адгезии клеток с матриксом (Bershadsky, Vasiliev, 1988; Hynes, 1999; Clark et al., 2002). Последнее время появились работы, подтверждающие возможность участия актинового цитоскелета в регуляции активности генов (Sotiropoulos et al., 1999, Fazal et al., 2007; Kustermans et al., 2008). Сигнальные процессы в клетке запускаются под влиянием внеклеточных сигналов, таких как адгезия к белкам внеклеточного матрикса, межклеточная адгезия и воздействие ростовых факторов. Влияние этих факторов сопровождаются пространственной реорганизацией актиновых филаментов (Karin et al., 1997; May, Gosh, 1998; Schoenwaelder, Burridge, 1999).
Имеются данные, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета в процессах проведения внутриклеточного сигнала. В частности, некоторые сигнальные молекулы способны непосредственно взаимодействовать с белками актинового цитоскелета на определенных этапах передачи сигнала от клеточной мембраны к ядру (Yamada, Geiger, 1997; Otey, Carpen, 2004; Legrand-Poels et al., 2007). Однако, по-прежнему, остаются невыясненными точные механизмы, с помощью которых актиновый цитоскелет принимает участие в сигнальных каскадах и регуляции экспрессии генов.
Ряд данных говорит о том, что реорганизация актинового цитоскелета может приводить к изменению активности транскрипционных факторов (Sotiropoulos et al., 1999, Posern et al., 2002; Hofmann et al., 2004; Kustermans et al., 2008). Реорганизация актинового цитоскелета происходит под влиянием ростовых факторов, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами. В то же самое время, факторы, вызывающие реорганизацию актинового цитоскелета, регулируют также активность транскрипционных факторов (Karin et al.,
1997; May, Gosh, 1998). Вероятно, реорганизация актинового цитоскелета сопровождается перегруппировкой белков актинового цитоскелета, входящих в состав сигнальных комплексов и взаимодействующих с транскрипционными факторами. Таким транскрипционным фактором, регуляция которого может осуществляться в связи с реорганизацией актинового цитоскелета, является NF-кВ (Fazal et al., 2007, Nemeth et al., 2004). Показано также, что актиновый цитоскелет важен на постгранскрипционном уровне регуляции, обеспечивая позиционирование РНК в цитоплазме (Ornelles et al.,1986; Hesketh, 1996).
Дополнительными фактами, указывающими на участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов, является открытие внутриядерных функций актина и актинсвязывающих белков. Однако эти вопросы остаются, по-прежнему мало изученными. Одним из таких белков, способных взаимодействовать с транскрипционными факторами, является а-актинин (Poch et al., 2004; Chakraborty et al., 2006; Goffart et al., 2006).
К семейству а-актининов принадлежат четыре генных продукта, описанные впервые как актинсвязывающие белки. а-Актинин-1 и 4 характерны для немышечных клеток, а а-актинип-2 и 3 - для мышечных. Функция немышечного а-актинина заключается в сшивании актиновых филаментов. Позднее было показано, что а-актинин взаимодействует не только с актином, но и с большим числом молекулярных партнеров (Otey, Carpen, 2004). а-Актинин работает как скаффолд, связывая цитоскелет с различными трансмембранными белками в контактах разного типа, и соединяет цитоскелет с разнообразными сигнальными молекулами (Otey, Carpen, 2004). Поскольку а-актинин локализуется вблизи трансмембранных белков и актиновых филаментов, он является одной из основных мишеней регуляции сигнальных путей, особенно тех, что связаны с интегринами.
Аминокислотная последовательность а-актинина-1 и а-актинина-4 гомологична на 86 %, однако функции их в клетках различаются. В отличие от а-актинина-1, а-актинин-4 способен транслоцироваться в ядро и взаимодействовать с факторами транскрипции (Poch et al., 2004; Chakraborty et al., 2006; Goffart et al., 2006). Партнерами а-актинина-4 в ядре являются р-катенин и NF-Y факторы транскрипции, DEAD box содержащий белок Bat 1 и гистондеацетилазы (HDAC). а-Актинин является одним из кандидатов на роль партнера транскрипционного фактора NF-kB.
Семейство транскрипционных факторов NF-KB/Rel принимает участие в регуляции экспрессии большого числа генов, среди которых гены, ответственные за иммунный ответ, противовоспалительные реакции, организацию цитоскелета и другие гены (Tian et al., 2005). Транскрипционные факторы семейства NF-kB регулируются большим числом внеклеточных сигналов, среди которых ультрафиолет, факторы роста, фактор некроза опухолей, вирусы, при действии которых NF-kB активируется в цитоплазме, после чего транспортируется в ядро (May, Ghosh, 1998). Эпидермальный фактор роста (ЭФР) также является одним из регуляторов NF-кВ (Sun, Carpenter, 1998). Одним из малоизученных вопросов остаются механизмы его перераспределения в цитоплазме и пути транспорта в ядро.
Данные об участии актинового цитоскелета в регуляции NF-кВ, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что NF-кВ солокализуется в цитоплазме нормальных фибробластов вдоль стресс-фибрилл и в фокальных контактах. Методом аффинной хроматографии на колонках было подтверждено, что NF-кВ может связываться с иммобилизованным F-актином и высказано предположение, что распределение NF-кВ в цитоплазме происходит в зависимости от состояния актина (Are et al., 2000). Поиск белков, которые могут взаимодействовать как с актином, так и с р65 субъединицей NF-кВ указал на а-актинин, поскольку имеются данные о том, что киназа МЕКК1, которая является одним из активаторов NF-кВ, способна напрямую
взаимодействовать с а-актинином in vitro (Christerson et al., 1999). Исследования нашей лаборатории показали солокализацию р65 субъединицы NF-kB и а-актининов в цитоплазме клеток А431, в особенности в области дорзальных раффлов, кроме того, а-актинин-4 был обнаружен в ядре. Несмотря на солокализацию обоих а-актининов и р65 в цитоплазме, в мультибелковых комплексах ядерных и цитоплазматических экстрактов после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 субъединице NF-kB выявлялся только а-актинин-4 (Бабаков, 2004). Поэтому возникла необходимость детального сравнения областей солокализации, а также сравнения распределения в субклеточных фракциях а-актинина-1, а-актинина-4 и р65. Кроме того, обнаружение а-актининов и р65 в одних и тех же белковых комплексах не является доказательством того, что это взаимодействие прямое.
Работа была проведена на клетках А431, распластанных на фибронектине, для которых хорошо охарактеризованы структуры актинового цитоскелета и реорганизация под влиянием ЭФР (Are et al., 2001; Петухова и др., 2005). Эти морфологические особенности создают удобную модель для исследования перераспределения факторов, связанных с F-актином, при различных способах стимуляции клеток. Одним из стимулов, воздействие которого связано с реорганизацией актинового цитоскелета, является ЭФР.
Каким образом происходит перераспределение р65 в связи с реорганизацией актинового цитоскелета и важны ли актиновые структуры для транслокации р65 в ядро, до сих пор исследовано не было.
Цель настоящей работы заключалась в выяснении участия актинового цитоскелета в перераспределении р65 субъединицы NF-kB, а также в сравнительной оценке участия а-актинина-1 и а-актинина-4 в событиях, связанных с активацией NF-kB.
В работе были сформулированы следующие задачи:
1. Исследовать возможность транслокации р65 в ядро в условиях разрушения актинового цитоскелета после обработки клеток цитохалазином Д (ЦХ Д).
2. Исследовать влияние ЭФР, вызывающее реорганизацию актинового цитоскелета,
на распределение р65, F-актина, а-актинина-1 и а-актинина-4 в цитоплазме и
охарактеризовать области солокализации.
3. Определить совместное присутствие р65, а-актинина-1 и а-актинина-4 в
различных субклеточных фракциях, соответствующих разным компартментам.
Исследовать возможность прямого взаимодействия а-актининов и NF-кВ in vitro с использованием метода аффинной хроматографии (GST-pull-down).
Исследовать возможность участия а-актинина-4 в реакции связывания NF-кВ с консенсусними последовательностями кВ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
