Введение к работе
Актуальность темы
Перспективной областью развития медицинской биотехнологии является «клеточная» биотехнология, использующая в заместительной терапии . (регенеративной медицине) стволовые клетки. Стволовые клетки - это недифференцированные или малодифференцированные клетки, которые способны поддерживать собственную популяцию и генерировать как минимум один тип коммитированных клеток-предшественниц (КП). Существование стволовых/прогениторных клеток во многих органах и тканях на сегодняшний день не вызывает сомнений. Однако до сих пор основной проблемой, затрудняющей выделение этих клеток и разработку методов их практического применения, является проблема их идентификации. В настоящее время в основе идентификации стволовых клеток взрослого организма лежит оценка их морфологии и поверхностных маркеров. Одним из многообещающих и широко используемых маркеров стволовых клеток является C-kit (CD 117), который представляет собой рецептор к фактору стволовых клеток (Stem Cells Factor -SCF). Последний стимулирует гемопоэз [Anderson, 1990, Zsebo, 1990], гаметогенез [Martin, 1990, Dolci, 1991, Godin, 1991], нейрогенез [Мао, 2002], развитие меланоцитов [Funasaka, 1992] и вызывает ряд других биологических эффектов в ходе развития млекопитающих [Blume-Jensen, 1992, Keshet, 1994, Yee, 1994]. Рецептор к SCF имеется у 1-5 % кроветворных стволовых клеток [Papayanopoulou, 1991] и обнаружен в стволовых клетках других органов и тканей взрослого организма [Orr-Urtreger, 1990, Keshet,1991, Motro, 1991, Beltrami, 2003, Urbanek, 2005, Linke, 2005, Li, 2006]. Однако сегодня неизвестны ни клеточные источники, из которых изначально, в ходе гисто- и органогенеза, развиваются C-kit-позитивные (C-kit+) КП, ни закономерности их последующей дифференцировки в каждом органе. Детальный анализ экспрессии данного маркера в ходе пренатального онтогенеза человека позволит приблизиться к
2 решению данного вопроса и установить возможность и целесообразность
использования C-kit в качестве маркера стволовых или прогениторных клеток.
C-kit, по-видимому, не является уникальным маркером только стволовых клеток или КП. Именно с помощью C-kit был идентифицирован особый тип возбудимых клеток, локализованных в стенке трубчатых и полых внутренних органов, которые обладают пейс-мейкерной активностью и названы в честь патриарха нейрогистологии клетками Кахаля [Maeda, 1992, Torihashi, 1997, Der-Silaphet, 1998, Thomsen, 1998]. Происхождение этих клеток тоже до сих пор остается спорным. Согласно одной из теорий, клетки Кахаля являются производными мезенхимы [Lecoin, 1996, Wallace, 2005]. С другой стороны, существует точка зрения, рассматривающая данные клетки как производные вентральной части нервной трубки [Sohal, 2002]. Комплексное изучение экспрессии C-kit в нервной трубке, мезенхиме и внутренних трубчатых органах в динамике эмбрионального развития человека позволит установить источники развития данной клеточной популяции.
В последние годы появились научные публикации, где сообщается об обнаружении клеток Кахаля, а точнее C-kit+ клеток, которые авторы называют клетками Кахаля, не только в полых, но и в паренхиматозных органах и, в частности, в поджелудочной железе [Popescu, 2005]. С другой стороны, именно C-kit+ клетки рассматриваются в качестве основного кандидата на роль региональной стволовой клетки поджелудочной железы и, в частности, инсулоцитов [Li, 2006]. Похожая ситуация складывается с C-kit+ клетками, описанными в сердце человека. Согласно одним данным, это - C-kit+ клетки Кахаля [Hinescu, 2006, Popescu, 2006], другие авторы утверждают, что это региональные стволовые клетки сердца [Beltrami, 2003, Linke, 2005, Urbanek, 2005]. Причем все авторы описывают C-kit+ клетки в составе миокарда. Очевидно, возникшие противоречия связаны с тем, что до сих пор неизвестны ни источники развития, ни сроки появления C-kit+ клеток в этих органах у человека. Также нет никаких данных о путях их дальнейшей дифференцировки в ходе
онтогенеза, пространственных и функциональных взаимоотношениях C-kit+ клеток с зкзокринной и эндокринной частями поджелудочной железы и участии в формировании её островкового аппарата. Изучение динамики экспрессии C-kit й закономерностей дифференцировки C-kit+ клеток поджелудочной железы и сердца с помощью специфических маркеров в процессе пренатального и раннего постнатального развития позволит установить их происхождение и значение для этих органов: являются они региональными прогениторными клетками, или же клетки, экспрессирующие C-kit в поджелудочной железе и сердце, - это все-таки клетки Кахаля.
Одним из методических подходов, позволяющих установить, что представляют собой C-kit+ клетки взрослого организма, является изучение экспрессии в клетках этого маркера в ходе пренатального развития человека и выявление её динамики в ходе гисто- и органогенеза человека. Поскольку в качестве одного из основных возможных источников развития клеток Кахаля в кишке рассматривается нервная система [Sohal, 2002], необходимо провести изучение ранних этапов становления популяции C-kit+ клеток в первую очередь именно в тканях этой системы. Кроме изучения развития поджелудочной железы и сердца, необходимо изучение кишечной трубки в качестве органа, где впервые описаны клетки Кахаля. ті печени, развивающейся, как и поджелудочная железа, из эпителия передней кишки. На изучение временных и пространственных взаимоотношений популяций C-kit+ клеток во внутренних органах в ходе пренатального развития человека направлено наше исследование.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования было изучить, в каких клетках в ходе органогенеза у человека экспрессируется C-kit, и установить, могут ли C-kit+ клетки претендовать на роль стволовых клеток эндокринной части поджелудочной железы. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Изучить экспрессию C-kit в клетках и распределение C-kit+
клеток в ходе пренатального развития различных внутренних органов человека -в нервной системе, кишечной трубке, печени, сердце.
Определить клеточный источник, сроки появления и распределение C-kit+ клеток поджелудочной железы человека.
С помощью специфических маркеров (м-РНК проинсулина, инсулин, глюкагон) определить пути и этапы дальнейшей дифференцировки С-kit+ клеток эндокринной части поджелудочной железы человека.
Объект и методы исследования
Исследование проведено на целых эмбрионах, выделенных органах плодов человека, а также аутопсийном материале детской поджелудочной железы человека.
В работе были использованы два исследовательских подхода. Иммуногистохимический подход позволил изучить экспрессию C-kit в ходе пренатального развития нервной системы, кишечной трубки, печени, сердца, поджелудочной железе, а с помощью специфических маркеров (м-РНК проинсулина, инсулин, глюкагон) определить этапы дифференцировки C-kit+ клеток в А- и В- клетки эндокринной части поджелудочной железы человека. Морфометрический подход позволил количественно изучить развитие C-kit-, инсулин- и глюкагон-позитивных клеток островков поджелудочной железы путем измерения в ней площади C-kit-, инсулин- и глюкагон-позитивной части островков.
Достоверность полученных данных и их научная новизна
Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного количества образцов для исследования, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием статистического метода. Достоверность различий между результатами оценивали по /-критерию Стьюдента.
Автор видит новизну полученных результатов в том, что впервые:
Установлен иммуногистохимическими методами источник развития
популяций C-kit+ КП клеток Кахаля у человека из производных нейроэктодермы и C-kit+ предшественниц инсулоцигов поджелудочной железы человека из производных энтодермы, а также основные этапы их дальнейшей дифференцировки.
Обнаружено, что экспрессия C-kit в КП различных внутренних органов человека - печени, желез желудка, эпителия протоков поджелудочной железы, эндотелия сосудов сердца в ходе их пренатального развития наблюдается только на определенных сроках развития.
Выявлено, что рецептор к фактору стволовых клеток является наиболее оптимальным маркером КП инсулоцитов, поскольку именно после начала экспрессии C-kit клетками эпителия протоков поджелудочной железы начинается развитие еб эндокринной части. Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенных иммуногистохимическими методами исследований демонстрируют происхождение C-kit+ КП клеток Кахаля из производных нервного гребня, а также этапы миграции и внедрения этих клеток в стенку кишечной трубки. Поскольку клетки Кахаля являются пейсмейкерами, то есть участвуют в контроле сокращения гладко-мышечных клеток, полученные данные об их развитии могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы нарушений перистальтики кишечной трубки, маточных труб и других трубчатых внутренних органов.
Установлено, что региональными стволовыми клетками эндокринной части поджелудочной железы являются клетки эпителия протоков, a C-kit может служить удобным и информативным маркером для выявления этих клеток.
Полученные данные исследования способствуют расширению представлений об этапах развития кишечной трубки и поджелудочной железы.
Результаты о развитии C-kit+ клеток поджелудочной железы могут быть использованы для дальнейшего изучения региональных стволовых клеток
поджелудочной железы. То, что C-kit является трансмембранным рецептором, позволяет разработать способы выделения этих клеток, что открывает перспективы для новых методов лечения сахарного диабета I типа путем трансплантации C-kit+ клеток поджелудочной железы.
Кроме того, с помощью иммуногистохимического исследования C-kit в кишке и поджелудочной железе можно оценивать регенеративную способность этих органов при различных патологиях, а также дифференцировать эти патологии с новообразованиями.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Экспрессия C-kit у человека является фенотипическим признаком ряда клеток нейроэктодермы и их предшественниц (клеток нервной системы, интерстициальных клеток Кахаля, меланоцитов), а в клетках печени, эпителия желудка, эпителия протоков поджелудочной железы, эндотелия сосудов сердца C-kit является маркером только коммитированных клеток-предшественниц на определенных сроках пренатального развития.
А- и В-клетки поджелудочной железы человека имеют общую коммитированную клетку-предшественницу, которая экспрессирует рецептор к фактору стволовых клеток.
Личный вклад соискателя
Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы. Соискателем составлен план, поставлены задачи, определены этапы исследования. Автор провел подбор и анализ литературы. Им лично проведены забор материала и его последующая заливка в парафин, нарезаны парафиновые срезы. В ходе исследования соискатель провел 368 иммуногистохимических окрашиваний срезов, с которых им было получено 576 фотографий, лично разработал экспериментальные подходы в проведении двойных иммуногистохимических исследований и реакции гибридизации in situ. Статистическая обработка, сопоставление полученных результатов с данными
7 литературы, оформление, публикации результатов исследования,
формулирование выводов и рекомендаций принадлежат автору.
Сведения об апробации результатов диссертации Основные результаты диссертационной работы доложены на XII, XIII и XIV Всероссийских научно-практических конференциях "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2007, 2008, 2009); Всероссийской конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию ЛИ.Фалина (Москва, 2007); международном симпозиуме "Future Perspectives in Gastroenterology" (Дрезден, Германия, 2007); III Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2008); Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); 14 Российской конференции «Гепатология сегодня», Москва, 2009.
Сведения о публикациях по теме диссертации
По теме диссертация опубликовано 10 научных работ, в том числе две статьи в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций - 1,4 у. п. л., в т.ч. авторский вклад — 0,7 у. п. л.
Внедрение результатов работы
Иммуногистохимическая оценка закономерностей экспрессии рецептора к фактору стволовых клеток в тканях кишечной трубки и инсулоцитах поджелудочной железы успешно внедрена в практику ГМУ «Детская республиканская клиническая больница» (г. Казань), МУЗ «Городская клиническая больница №7» (г. Казань) для оценки регенерации стенки кишечной трубки и эндокринной части поджелудочной железы, для дифференциальной
8 диагностики патологических изменений этих органов с новообразованиями,
выбора метода лечения и прогнозирования исхода заболеваний, а также в
учебный процесс на кафедре нормальной анатомии и гистологии Казанского
государственного медицинского университета.
Структура и объем диссертации
