Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Макро- и микроскопическое строение коры мозжечка
1.2. Онтогенез клеток пуркинье и зернистых клеток мозжечка 29
1.3. Мшистые волокна 40
1.4. Лазящие волокна
Глава 2. Материал и методика 49
Глава 3. Результаты исследования 56
3.1. Морфометрические и функциональные данные по клеткам пуркинье морских свинок 57
3.2. Морфометрические и функциональные данные по клеткам пуркинье котят 75
Глава 4.Обсуждение результатов
Выводы 104
Список литературы 106
- Онтогенез клеток пуркинье и зернистых клеток мозжечка
- Лазящие волокна
- Морфометрические и функциональные данные по клеткам пуркинье морских свинок
- Морфометрические и функциональные данные по клеткам пуркинье котят
Введение к работе
Одной из фундаментальных проблем современной эволюционной нейрофизиологии является изучение закономерностей морфофункционального созревания мозга в ходе онтогенеза. Среди структур мозга важную роль в контроле и координации движений играет мозжечок (Dow R.S., Moruzzi G., 1958; Орбели Л.А!, 1962; Ito М., 1984; Козловская И.Б., 1976; Разумеев А.Н., Григорьян Р.А. 1976). Морфологическая и функциональная зрелость клеточных элементов мозжечка является одним из важных критериев его вовлечения в контроль стато-кинетических рефлексов при выполнении рефлекторных и сложных произвольных движений (Airman J.and Sudarshan К., 1975; Thach, 1978; Фанарджян В.В., Григорьян Р.А., 1983; Григорьян Р.А., Пригарина Э.И., 1988).
Для успешного выполнения функций быстрого и точного контроля движений мозжечок обладает богато развитой системой афферентной иннервации, ключевым элементом которой является клетка Пуркинье - единственный эфферентный нейрон мозжечка, идущий к его ядрам (Eccles J.С, Ito М. and Szentagothai J., 1967; Фанарджян В.В,, 1975; Григорьян Р.А., Тарасова Э.И., 1979; Тарасова Э.И., Григорьян Р.А., 1984; Фанарджян В.В., Григорьян Р.А., 1983; Фанарджян В.В., 2000).
С анатомической точки зрения клетка Пуркинье (КП) представляет весьма удобный объект для изучения цитоархитектоники мозжечковой коры благодаря своей упорядоченной сравнительно однообразной, монослойной организации у всех позвоночных, своеобразию дендритной арборизации с обилием шипиков и уникальным в пределах ЦНС двойственным типом афферентной иннервации - системами мшистых и лазящих волокон (Cajal R., 1911; Eccles J.C.et al, 1967; Mugnaini E., 1972; Ito M., 1984; Voogd J., 1992, Llinas R., Sugimori M, 1992; Braitenberg V., 2002).
В пределах класса млекопитающих размеры сомы КП заметно варьируют, но в большинстве случаев вертикальная ось КП всегда меньше горизонтальной ее оси (Mugnaini Е., 1972). Сома клеток Пуркинье содержит ядро, тельце Ниссля, агранулярный ретикулум, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы, микротрубочки и нейрофиламенты (Palay S.L., Chan-Palay V., 1974). В ряде работ показано, что с возрастом происходят инволюционные изменения в дендритной арборизации и размерах сомы КП, которые, в конечном счете, сопровождаются гибелью клеток, и нарушение афферентной иннервации (Sturrock R.R., 1989а, 1989b, 1990; Bertoni-Freddari C.et al., 1991). В результате гибели эффективность синаптического действия КП в контроле движений ослабевает, движения становятся некоординированными, возникает шаткость в походке, теряется плавность, быстрота и точность движений.
Общеизвестно, что двойственный характер иннервации КП выражается в неодинаковом синаптическом возбуждающем действии на дендриты КП двух афферентных входов - систем лазящих и мшистых волокон. Лазящие волокна устанавливают прямой, моносинаптической контакт с проксимальной частью дендритов, оказывая на КП самое сильное синаптической действие в пределах ЦНС, которое завершается сложным спайком (Eccles J.C.et al, 1967; Brooks V.B., Thach W.T., 1992; Brooks V., Kozlovskaja Let al., 1973; Llinas R., Sugimori M., 1992). В отличие от лазящих волокон терминали мшистых волокон вступают в контакт с апикальной частью дендритов КП, и тем самым оказывают слабое синаптическое действие, завершающееся простым спайком. Приведенные данные позволяют сделать заключение, что морфологическая и функциональная зрелость клетки Пуркинье имеет критическое значение для эффективности синаптического действия афферентных входов на возбудимость КП, и по мере ее структурно-функционального оформления в ходе онтогенеза оказывает более эффективный контроль координации движений.
Сочетание морфометрического исследования с изучением активности идентифицированных клеток Пуркинье у животных с разным уровнем развития двигательной деятельности в постнатальном периоде жизни является адекватным и актуальным и будет способствовать более углубленному пониманию тонких механизмов контроля движений и стато-кинетических рефлексов в период их формирования.
Цели и задачи работы
Цель настоящей работы заключалась в морфометрическом и электрофизиологическом изучении клеток Пуркинье мозжечка у зрело- и незрелорождающихся животных по мере их роста и развития в ходе онтогенеза. В задачи работы входило:
1. Изучить морфометрически изменение горизонтальных, вертикальных диаметров и объема клеток Пуркинье у зрелорождающихся морских свинок в ходе их постнатального развития.
2. Провести сравнительное морфометрическое исследование тех же параметров формы и объема клеток Пуркинье у незрелорождающихся — котят в ходе их постнатального онтогенеза.
3. Сопоставить морфометрические данные роста и развития клеток Пуркинье у изученных зрело- и незрелорождающихся животных с созреванием электрической активности идентифицированных клеток Пуркинье. 4. Сравнить скорость и темпы изменения диаметров клетки и созревания ее до дефинитивной формы со становлением поведенческих и стато-кинетических рефлексов (стояние, опорная реакция и переворачивания, ходьба и бег) у зрело- и незрелорождающихся животных: морских свинок и кошек. Научная новизна работы
Новизна работы состоит в том, что в ней впервые морфометрически изучены изменения горизонтальных и вертикальных размеров и объема КП и ядра у представителей зрело-и незрелорождающихся животных в постнатальном периоде, начиная с новорожденных и вплоть до достижения сомы КП дефинитивной формы.
В работе впервые установлены сроки и темпы развития формы и размеров КП, а также показаны критические периоды наиболее быстрого роста вертикальных и горизонтальных диаметров КП, в ходе постнатального развития зрело- и незрелорождающихся животных.
Наконец, новым в работе является сопоставление полученных изменений морфометрических параметров клетки Пуркинье у зрело-и незрелорождающихся животных с функциональной активностью идентифицированных клеток Пуркинье и поведенческим проявлением стато-кинетичесих рефлексов в соответствующих возрастных группах исследованных животных.
Научная и практическая значимость работы Экспериментальные данные, полученные в работе, могут быть использованы в , практике для более точной диагностики двигательных расстройств мозжечковой этиологии, как у детей различного возраста, так и у взрослых. А также в качестве теоретического обоснования тактики хирургических операций на мозжечке в условиях патологии (статический и интенциональный тремор, расстройство походки, гематомы мозжечка) с учетом соматотопической локализации в мозжечке. Помимо этого результаты данного исследования могут быть использованы при чтении курса по физиологии ЦНС в вузах биологического и медицинского профиля. Данные этой работы, как и предыдущих, выполненных в лаборатории, могут войти в руководства по физиологии. В целом полученный экспериментальный материал углубляет теоретические представления о механизмах восприятия мозжечком афферентной "информации, поступающей к его ключевой структуре - клеткам Пуркинье, которые осуществляют контроль и регуляцию быстроты, точности и плавности двигательного акта. Основные положения, выносимые на защиту
1. У зрелорождающихся морских свинок процесс формирования дефинитивной формы клетки Пуркинье мозжечка занимает 4 недели постнатальной жизни. К этому сроку функционально созревают электрическая активность идентифицированных клеток Пуркинье и все стато-кинетические рефлексы.
2. В отличие от зрелорождающихся у незрелорождающихся котят сроки формирования дефинитивной формы и темпы возрастания объема клеток Пуркинье мозжечка заметно затягиваются до 6 - 7 недель постнатальной жизни. Соответственно изменению сомы клеток Пуркинье у котят повышается электрофизиологическая активность клеток Пуркинье и расширяется ассортимент позно-моторных реакций от простого стояния к быстрой ходьбе и бегу.
3. При формировании дефинитивного строения сомы клетки Пуркинье мозжечка у зрелорождающихся животных наибольшие изменения размеры клеток Пуркинье претерпевают в первую и четвертую неделю постнатальной жизни, тогда как у незрелорождающихся животных котят- в третью и четвертую. Апробация работы
Материалы диссертационной работы докладывались в 1994 году на международном симпозиуме в Японии, посвященном позе и походке (Матсумото), на XXXIII международном Конгрессе физиологических наук (С-Петербург, 1997), на заседаниях Санкт-Петербургского общества физиологов в 2000, 2001, 2002 годах, на ежегодных собраниях Американского общества нейронаук: 30 Annua] Meeting of American Society for Neuroscience (New Orleans, 2000), 31st Annual Meeting of American Society for Neuroscience (San Diego, 2001), 32nd American Society for Neuroscience (Orlando, 2002), на заседании лаборатории физиологии движений Рокфеллеровского университета США (1996) и на семинаре лаборатории физиологии ЦНС неврологического института Р.С.Дау в Портленде (США) в 1996 году.
Публикации
Основное содержание диссертации отражено в 12 публикациях, из них 4 статьи и 8 тезисов.
Онтогенез клеток пуркинье и зернистых клеток мозжечка
У зародыша крысы клетки Пуркинье возникают на 14 - 17 днях эмбрионального развития (Das G.D., Nornes Н.О., 1972; Goldowitz D., Hamre К., 1998). Синаптическое созревание клеток Пуркинье у крыс очень подробно описано Альтманом (Altman J., 1972b). Он выделил пять фаз созревания клеток Пуркинье. В течение первой фазы, которая продолжается до четвертого дня постнатальной жизни, клетки Пуркинье распределяются и выстраиваются в монослой, но пока еще синапсы либо не сформированы, либо их очень мало. Далее, в промежутке между пятым и седьмым днем (вторая фаза), появляются две временные структуры: гипертрофированный апикальный конус, состоящий из «ретикулярной» цитоплазмы и латеральные перисоматические отростки, которые создают заметно асимметричные синапсы с лазящими волокнами. В течение третьей фазы (8-15 день постнатальной жизни) перисоматические отростки исчезают, «ретикулярная» цитоплазма устремляется вверх внутрь растущих дендритов;. сома охватывается незаметными симметричными синапсами корзинчатых клеток, и, наконец, окружаются глиальными отростками, что обозначает конец синаптического созревания сомы клеток Пуркинье. Во время четвертой фазы на пятнадцатый день параллельные волокна формируют синапсы с шипиками дендритов в нижней половине молекулярного слоя. Пятая фаза начинается после исчезновения внешнего зернистого слоя, которое происходит к 21 дню. Параллельные волокна устанавливают синапсы с дендритическими шипиками вверху молекулярного слоя. Таким образом, синаптогенез клетки Пуркинье характеризуется тремя следующими событиями, происходящими с определенным градиентом снизу вверх по отношению к молекулярному слою: возникновением и исчезновением везикул, предвещающих синаптогенез; формирование синапсов и взаимодействием тела клетки Пуркинье и ее дендритов с глиальными отростками, Интересно, что удлинение периода внутриутробного развития с помощью инъекций прогестерона не изменяет длительность и порядок синаптозенеза, таким образом, был сделан вывод, что эта временная последовательность не запускается рождением (Zagon, 1 975).
Показано, что размер сомы (средний диаметр) клеток Пуркинье увеличивался наиболее быстро между 6 (в среднем 10 микрон) и 18 (примерно 17 микрон) днями постнатальной жизни, не изменялся между 18 и 25 днями, но умеренно увеличивался снова между 25 и 48 днями (22-23 микрона), стабилизируясь на этой величине (Takacs J., Hamori J., 1994). Показано, что у крыс размер клеток Пуркинье значительно уменьшается в возрасте 18, 24 и 30 месяцев по сравнению с 3-х месячными крысами (Ogata R.et al., 1984).
Интересно, что в процессе онтогенетического развития происходит изменения в клетках Пуркинье и на уровне клеточных органелл. У 3-х, 12-ти и 24-х месячных крыс изучались следующие ультраструктурные параметры: количество органелл на мкм3 цитоплазмы КП (численная плотность - Nv), средний объем митохондрий (V) и объемная фракция митохондрий (объемная плотность - Vv). Nv была значительно выше в 12 месяцев, чем в 3 и 24. V уменьшалась к 12-ти и 24-х месячному возрастам. Vv значительно уменьшалась у старых животных. У молодых и старых крыс процентное отношении органелл крупнее чем 0,32 мкм было 13,5 и 11% соответственно, в то время как во взрослой группе доля увеличенных митохондрий составляла менее 1%. Так как митохондрии имеют решающее значение, когда потребности в энергии велики, заметное уменьшение Vv ведет к ослаблению способности клеток Пуркинье у старых животных поддерживать уровень энергии, достаточный для трансмиссии нервного импульса. Однако, высокий процент увеличенных органелл, найденный у старых животных, может свидетельствовать о морфофункциональной компенсаторной реакции (Fattoretti P.et al., 1998).
Как уже упоминалось, рост дендритов клеток Пуркинье в разных отделах мозжечка неодинаков. Так, у крыс Спрейг-Доули в возрасте 1 - 25 дней после рождения исследовали развитие дендритов клеток Пуркинье мозжечка. Применяли иммуноцитохимический метод выявления белка, связанного с микротрубочками (МАР2). Найдены различия во времени первоначального роста дендритов клеток Пуркинье для разных долек развивающегося червя мозжечка. Более рано дендритный рост обнаруживается в дольках I, II, IX, X и вдоль первичной щели, позднее - в дистальной части дольки VI, дольке VII и дорсальной части дольки VIII (Goodlett C.R., Hamre К.М., West J.R., 1990).
Дендритное дерево клетки Пуркинье в онтогенезе человека изучалось по методике, профильных полей. Было показано, что площадь профильных полей клеток Пуркинье увеличивается на 1 -м году жизни через каждые 3-4 месяца. Далее значимое увеличение площади КП наблюдается к 2-м и 8-ми годам постнатальной жизни. В некоторых отделах мозжечка происходят изменения и в возрасте от 14 до 20 лет. Автор делает вывод о периодичности (цикличности) структурных преобразований, наличии нескольких этапов в развитии коры мозжечка (Цехмистренко Т.А., 1998). При микроэлектродных исследованиях клеток Пуркинье мозжечка на переживающих срезах мозга были сделаны выводы, что рост клеточных отростков сопровождается увеличением плотности кальциевых каналов в клеточной мембране. Исследования зависимости потенциалов действия от ионного состава омывающей среды показали, что в соме этих клеток они состоят из «натриевого» и «кальциевого» компонентов. В дендритах же пик носит чисто «кальцевую» природу: его кинетика отличается при этом характерной замедленностью (Llinas R., Sugimori М, 1980). При изучении срезов, взятых на различных стадиях отногенеза было показано, что кальциевая проводимость у клеток Пуркинье оказывается наиболее выраженной именно впериод роста дендритов (Traub R.D., Llinas R., 1979; Костюк П.Г., 1986).
Значительную роль в функционировании клетки Пуркинье играет ее синаптический контакт с параллельными волокнами. В этой связи представляет ценность работа, посвященная динамике дендритных шипиков в коре мозжечка крысы. Было установлено, что площадь молекулярного слоя, соответствующая одной клетке Пуркинье, наиболее интенсивно увеличивается с 6 по 25 постнатальный день (от 370 до 6,200 дм2), наименее интенсивно - с 30 по 48 день (примерно 9,300 дм ) и немного уменьшается в 90 дней (--6,600 дм2), Объем, соответствующий одной клетке Пуркинье с ее дендритным деревом, составлял 5,500 дм3 в 6-й день постнатальной жизни, 93,000 дм в 25-й день, 100,000 дм в 90-й день. Числовая плотность дендритных шипиков в молекулярном слое описывает бифазная кривая; скоростное увеличение от 6 до 21 дня, следующее за ним значительное, но непродолжительное уменьшение до 25-го дня, умеренное увеличение с 25 по 48-й день, с последующим падением между 48 и 90 днями. Количество шипиков одной КП имеет два развивающихся пика: первый умеренный пик на 21 день
Лазящие волокна
Светооптические исследования давно показали, что в любой ткани имеется определенное ядерно-плазменное отношения, закономерно меняющееся в онтофилогенезе (Блинков СМ., Глезер И.И., 1964). Это отношение для нервной ткани резко увеличено по сравнению с другими тканями организма. Например, объем тела и отростков нейрона примерно в 125 раз превышает объем ядра. Таким образом, по объему ядра, а также по объему перикариона клетки можно косвенно судить о росте и длине дендритов. А по установлению дефинитивной формы клетки можно примерно определить сроки окончания синаптогенеза.
Фотографирование полученных морфологических препаратов производилось с помощью фотоаппарата «Зенит-Е» с микрофотонасадкой МФН12, так, что увеличение на снимке размером 9 X 13 см составляло 630 раз, при этом использовалась пленка с высоким разрешением «Konica monochrome VX400».
В физиологическом разделе работы будут представлены наиболее типичные функциональные корреляты активности клеток Пуркинье и морфологических картин одних и тех же возрастных групп у зрело- (морские свинки) и не зрелорождающихся (котята) животных. Это позволяет сравнить степень функциональной связи морфологической картины формирования дефинитивной формы клеток Пуркинье с электрической активностью и зрелостью моторных рефлексов. С этой целью были избраны три наиболее типичных критических периода в морфо-функциональном развитии клеток Пуркинье у представителей зрелорождающихся - морских свинок: первый день постнатальной жизни, четырнадцатый и тридцатый. Эти возрастные группы служили для сравнения с темпом становления функциональной зрелости клеток Пуркинье и моторного поведения у котят. Мы основывались на том, что в нашей лаборатории проблемы функционального созревания клеток Пуркинье у морских были хорошо изучены, и было показано, что полное функциональное созревание мозжечка у морских свинок происходит к 4-й . неделе постнатальной жизни (Тарасова Э.И., Григорьян Р;А., 1984).
Опыты на морских свинках (18 особей) и котятах (18 особей) проводились под глубоким уретановым наркозом из расчета 1200 мг на кг веса животного. Хирургическая процедура открытия поверхности мозжечка делалась путем разреза кожи головы в области затылочного бугра, затем иссекались и частично удалялись мышцы с поверхности черепа в области пересечения сагиттального и ламбдовидного швов. С помощью бормашины просверливалось отверстие в теменной кости справа и слева от сагиттального шва, и костными щипцами удалялась черепная кость над мозжечком. Твердая мозговая оболочка удалялась тонкой крючковидной иглой непосредственно перед введением микроэлектрода. Получившееся при этом трепанационное отверстие находилось справа и слева от срединной линии над областью червя мозжечка - HIV - HVI долек по Ларселлу (Larsell О., 1934). Обнаженная поверхность коры мозжечка постоянно орошалась теплым физиологическим раствором (0,9% раствор NaCl), а затем заливалась 6% раствором агар-агара, приготовленным на физиологическом растворе. Это делалось для предотвращения высыхания поверхности мозжечка и сглаживания его пульсации, Во время оперативных процедур и в ходе опыта животные находились на обогреваемым водой столике с температурой 38С. Далее животное помещалось в стереотаксический аппарат и голова фиксировалась с помощью ушных держателей. Внеклеточное отведение импульсной активности клеток Пуркинье осуществлялось с помощью стандартных стеклянных микроэлектродов, заполненных 2,5 М раствором NaCl, с сопротивлением кончика от 4 до 6 мОм. Индифферентный электрод вкалывался в мышцы черепа. Сигнал от микроэлектрода подавался на усилитель биопотенциалов и на экран осциллографа и записывался на магнитофон «Юпитер». Записанная на магнитную ленту частота разрядов клетки Пуркинье в дальнейшем, после преобразования временной последовательности импульсов в амплитудную, вводилась в ПК. Здесь оценивалась частота и величина межимпульсных интервалов разряда клетки Пуркинье. Поиск фоновоактивных клеток Пуркинье осуществлялся с помощью микропогружателя дозированными толчками; шаг погружения составлял 5 мкм. Место погружения микроэлектрода - область интермедиальной зоны передней долей червя мозжечка, дольки HIV - HVI. Угол погружения рассчитывался таким образом, чтобы его кончик пересекал как можно больше складчатых слоев клеток Пуркинье мозжечка под прямым углом, т.е. 30 - 45 по отношению к нулевой плоскости стереотаксических координат. В ходе опыта глубина погружения кончика микроэлектрода определялась по шкале погружателя. Электрическая активность клеток Пуркинье регистрировалась по пути прохождения кончиком микроэлектрода складок коры мозжечка вплоть до I - II долек, зон представительства задних конечностей (Brodal, 1987). В ходе опыта проводилась идентификация клеток Пуркинье по электрофизиологической картине разряда - наличию одновременно простых и сложных спайков, соответственно отражающих активацию клетки Пуркинье по двум афферентным входам - системам мшистых и лазящих волокон. А также по тормозной паузе, возникающей после активации клеток Пуркинье лазящим входом и возникновением сложного спайка. На рисунке 3 показаны примеры фоновой активности клетки Пуркинье.
Морфометрические и функциональные данные по клеткам пуркинье морских свинок
Буквально через несколько часов после рождения у морских свинок регистрировалась фоновая электрическая активность клеток Пуркинье, которая демонстрировала все составляющие разряда КП: простой и сложный спайки, а также тормозную паузу. Причем такая активность была характерна для всех зарегистрированных клеток Пуркинье без исключения.
Средняя частота простых спайков у новорожденных была равна 11,4 ± 1,1 имп/с, сложных спайков - 0,44 ± 0,05 и длительность тормозной паузы 381 ± 54 мс (см. таблицу 6). Активность клеток Пуркинье в этот период онтогенеза имела незрелый характер. Прежде всего это проявлялось в большом разбросе частот простых и сложных спайков. Наиболее низкая частота для простых спайков составляла 0,6 имп/с, а наиболее высокая - 29 имп/с. Частота сложных спайков колебалась от одного спайка в 2 - 3 секунды, до 1,36 имп/с. Интересным нам представляется и тот- факт, что в отдельных случаях у новорожденных морских свинок наблюдались клетки Пуркинье с частотой простых спайков, близкой по своему значению к частоте у взрослых морских свинок (до 30 имп/с).
Таким образом, судя по электрофизиологической активности клеток Пуркинье, эти данные позволяют заключить, что уже вскоре после рождения морских свинок их основные афферентные системы волокон являются функционально включенными в активацию клеток Пуркинье, хотя, безусловно, в значительно меньшей степени, чем у взрослых животных.
Ко второй неделе постнатального развития частоты как простых, так и сложных спайков возрастали, в то время как длительность тормозной паузы существенно сокращалась. В этот период можно было зарегистрировать значительно больше фоновоактивлых клеток Пуркинье в одном треке микроэлектрода. Так же следует отметить, что колебания средней частоты простых спайков были гораздо меньше, чем в новорожденной группе. То же самое можно сказать и о сложных спайках, так как самая низкая частота равнялась 0,95 ±0,4 имп/с, а самая высокая 1,0 ± 0,2 имп/с.
К месячному возрасту частота простых спайков увеличивалась до 30,3 ± 2,9 имп/с, т.е. почти в 3 раза по сравнению с новорожденными животными. В то же время увеличение частоты разряда сложных спайков было гораздо меньшим - до 0,69 ± 0,06 имп/с. Одним из важных показателей онтогенетического созревания систем афферентной иннервации клетки Пуркинье и других клеток коры мозжечка является изменение длительности тормозной паузы, возникающей после ее активации входом лазящих волокон. Было показано, что у морских свинок в ходе онтогенеза происходит довольно быстрое укорочение тормозной паузы, которое начинается уже со второй недели после рождения. Причем у 30-ти дневных животных она уменьшается до 152 ± 25 мс, т.е. в 2,5 раза по сравнению с новорожденными животными и приобретает большую стабильность по сравнению с начальными этапами постнатального онтогенеза.
Кроме того, было показано, что временной разброс величины тормозной паузы с возрастом заметно снижался. Так если у новорожденных морских свинок длительность тормозной паузы часто превышала 300 — 500 мс, а ошибка средней превышала 50 мс, то у взрослых животных эти показатели снижались до 150 - 200 мс и 26 мс соответственно. Примерно такие же данные были получены в работе Григорьяна Р.А. и Тарасовой Э.И. (1979).
Таким образом, было показано, что с возрастом увеличивалась средняя частота простых и сложных спайков, и уменьшалась их вариабельность, т.е. клетки Пуркинье проявляли более однородные спектры частот спайков, а также происходило укорочение длительности тормозной паузы. То есть наблюдалась тесная взаимосвязь между длительностью тормозной паузы и частотой простых спайков, чем чаще следовали простые спайки, отражающие активацию клетки Пуркинье по входу мшистых волокон, тем короче становилась тормозная пауза после сложного спайка, который отражает активацию клетки Пуркинье по входу лазящих волокон.
Экспериментально было также показано, что между частотой разряда мшистого и лазящего входов на всех этапах постнатального развития наблюдались, как правило, реципрокные взаимоотношения, которые лучше выражены на более поздних стадиях онтогенеза. Кроме того, было замечено, что у морских свинок можно отметить, что помимо начальной, имеются два фазы ускоренного развития афферентных входов к клеткам Пуркинье, которые приходились на начало второй и конец третьей недели постнатальной жизни. Эти изменения в периодах ускоренного развития отражались на характере рисунка разряда клеток Пуркинье, также проходя две фазы - от нерегулярного в первые дни после рождения, до относительно регулярного - к концу третьей недели постнатальной жизни.
В нашей работе мы также рассмотрели изменения в ходе онтогенеза отношения частоты простых спайков к частоте сложных спайков разряда клетки Пуркинье. У новорожденных морских свинок это отношение составляло 24,44, у 14-ти дневных - 18,85 и у 30-ти дневных - 43,91. Это может говорить о том, что на ранних стадиях онтогенеза наблюдается процесс недостаточного синаптического возбуждающего действия параллельных волокон на КП, т.е. аксонов зернистых клеток, тогда как с возрастом функциональная способность входа параллельных волокон активировать КП повышается. Надо заметить, что на разных этапах онтогенеза различался характер активности клеток Пуркинье. Наиболее часто встречались три типа активности КП: регулярный, нерегулярный (периодический) и смешанный. К нерегулярному типу относились клетки Пуркинье, разряд которых прерывался длительными периодами молчания, во время которых изредка могли возникать сложные спайки. Для новорожденных морских свинок было зафиксировано явное преобладание нерегулярного типа активности клеток Пуркинье. В ходе онтогенеза преобладающим становился регулярный тип активности КП, достигая к 30-ти дневному возрасту характеристик взрослых животных.
Морфометрические и функциональные данные по клеткам пуркинье котят
Домашние кошки (Felis catus) относятся к отряду Хищных (Carnivora), семейству кошачьих (Felidae), подсемейству Felinae. Кошачьи - наиболее специализированные из всех хищных, всецело приспособленные к добыванию животной пищи преимущественно путем скрадывания, подкарауливания, реже - преследования. Подобный плотоядный образ лсизни наложил глубокий отпечаток на все строение тела и многие другие морфологические особенности кошачьих. Они прекрасно лазают по деревьям, способны делать огромные прыжки, при необходимости могут плавать, хорошо бегают, обладают особенно тонким слухом.
В результате проведенных морфометрических измерений были получены следующие данные, характеризующие рост и развитие клеток Пуркинье мозжечка котят и их ядер как процесс, неравномерный во времени (таблица 7).
У котят клетки Пуркинье в первый день постнатальной жизни имеют овальную форму, ядро, также как и у морских свинок, несколько смещено к базальной части клетки и имеет интенсивно окрашенное ядрышко. Практически у всех исследованных новорожденных котят клетки Пуркинье в глубине борозд частично погружены в нижележащий слой мозжечка. Это хорошо видно на фотографии с препарата мозжечка новорожденного котенка, представленной на рисунке 11. На этом же рисунке можно видеть еще многоклеточный внешний зернистый слой.
По сравнению с новорожденными морскими свинками (рис. 4) молекулярный слой у котят того же возраста имел меньшую толщину, что также свидетельствует о большей незрелости мозжечка у последних. Внешний зернистый слой у новорожденных котят демонстрировал плотную упаковку клеток и значительную толщину, сравнимую с таковой молекулярного слоя.
Следует заметить, что как у новорожденных и так и у 7-ми дневных котят клетки Пуркинье при одинаковых условиях окрашивания имели более интенсивный цвет, чем у морских свинок того же возраста (рис.И, 12 и рис.4, 5). Тела клеток Пуркинье в эти периоды постнатальной жизни очень глубоко погружены в нижележащие слои коры мозжечка, хотя выстроены в четкую линию относительно друг друга:
Вертикальный и горизонтальный диаметры клеток Пуркинье у новорожденных котят значительно меньше, чем у морских свинок и составляли 15,5 ± 0,18 и 11,1 ± 0,15 мкм соответственно. Вертикальный диаметр ядра КП в этот постнатальный период был равен 9,6 ±0,18 мкм, горизонтальный - 8,1 ±0,16 мкм. В первую неделю клетки Пуркинье изменялись мало, прирост для вертикального диаметра составлял 0,6 мкм, для горизонтального -0,4 мкм, различия были достоверны. На парасагиттальных срезах мозжечка у котят в этом возрасте толщина слоев как внешнего зернистого, так и молекулярного, практически не изменялась. Сравнивая 7-ми дневных котят с новорожденными в процентном отношении, можно сказать, что вертикальный и горизонтальный диаметры клетки Пуркинье увеличивались примерно на одинаковую величину - 4%. Ядро претерпевало гораздо большие изменения: вертикальный диаметр прибавил 12%, а горизонтальный - 7%. У морских свинок в этот период наблюдались значительное нарастание вертикального диаметра клетки Пуркинье (12%) и увеличение горизонтального на 6%. То есть, на начальном этапе онтогенеза мозжечок котят не только являлся менее зрелым, но и темп роста размеров клеток Пуркинье в этот период был существенно меньше, чем у зрелорождающихся морских свинок.
Во вторую неделю увеличение для обоих диаметров клетки Пуркинье произошло в 1,2 раза по сравнению с новорожденными животными, в третью - в 1,45 раз. На рисунках 13 и 14 представлены фотографии с препаратов мозжечка в возрасте 14-ти и 21-го дня, которые наглядно показывают увеличение размеров клеток Пуркинье, получившее в численном выражении представление в таблице 7. Клетка Пуркинье у 14-ти дневного котенка имела вертикальный диаметр 18,6 ± 0,17 мкм, горизонтальный - 13,8 ± 0,18 мкм, ядро - 11,2 ± 0,15 мкм и 9,1 ± 0,11 мкм соответственно. Объем клетки Пуркинье составлял 2305 ± 63,4 мкм , ядра - 581 ± 18,6 мкм", т.е. объем КП увеличивался почти в 2 раза по сравнению с новорожденными животными, а объем ядра - в 1,5 раза.
