Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Определение, классификация и функции дендритных клеток 12
1.1.1. Типы дендритных клеток 15
1.1.2. Фенотип 18
1.1.2.1. Морфология 18
1.1.2.2 Поверхностные антигены 19
1.1.3. Функции дендритных клеток 23
1.1.3.1. Иммунный ответ 23
1.1.3.2. Толерантность к собственным антигенам
1.2. Дендритные клетки в клинической иммунологии 28
1.3. Дендритные клетки и В-лимфоциты 31
1.4. Созревание дендритных клеток 32
1.5. Методы изучения дендритных клеток
1.5.1. История 36
1.5.2. Получение дендритных клеток in vitro 38
1.5.3. Методы изучения экспрессии генов в дендритных клетках
1.5.3.1. Секвенирование библиотек кДНК 41 .
1.5.3.2. SAGE метод 43
1.5.3.3. Дифференциальный дисплей мРНК 46
1.5.3.4. Гибридизация на кДНК матрицу 48
ГЛАВА 2. Материалы и методы 56
2.1. Получение дендритных клеток in vitro 56
2.2. Фенотигшрование дендритных клеток моноклональными антителами 57
2.3. Выделение суммарной РНК и обработка ДНКазой 1 58
2.4. Обратная транскрипция и амплификация мишеней для макроматриц 59
2.5. Мечение кДНК мишеней для анализа на макроматрице 61
2.6. Гибридизация, детекция и количественный анализ макроматриц 62
2.7. Мечение кДНК мишеней для микроматриц 63
2.8. Гибридизация на микроматрицу и количественный анализ 65
2.9. Полуколичественная полимеразная цепная реакция на матрице кДНК 67
2.10. Прямое секвенирование нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК и поиск гомологии 70
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 72
3.1. Получение in vitro незрелых и зрелых дендритных клеток человека. Фенотипирование поверхностных маркеров 73
3.2. Мониторинг экспрессии генов в моноцитах и незрелых дендритных клетках методом гибридизации на макроматрице 78
3.3. Подтверждение профилей гибридизации на кДНК макроматрицу методом полуколичественной ПЦР на матрице кДНК 97
3.4. Мониторинг экспрессии генов в незрелых и зрелых дендритных клетках методом гибридизации на микроматрицу 99
3.5. Подтверждение профилей гибридизации на кДНК микроматрице методом полуколичественной ПІ (Р на матрице кДНК 115
3.6. Экспрессия генов ренин-ангиотензиновой системы 119
Заключение 125
Выводы 129
Список литературы
- Поверхностные антигены
- Фенотигшрование дендритных клеток моноклональными антителами
- Прямое секвенирование нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК и поиск гомологии
- Подтверждение профилей гибридизации на кДНК макроматрицу методом полуколичественной ПЦР на матрице кДНК
Поверхностные антигены
Презентация антигена посредством ГКГС класса I. Через ГКГС класса I реализуется путь презентации эндогенного антигена, который состоит в деградации цитозольных белков (собой комплекс из 28 белков в форме полого цилиндра. В центр цилиндра поступает антиген, который подвергается протеолизу. Далее вирусных или дефектных белков клетки) и связывании их с вновь-синтезированными молекулами ГКГС класса I внутри эндоплазмаческого ретикулума [1]. Процессинг антигена происходит в цитозоле посредством АТФ-зависимой протеолитической системы, которая связывает убиквитин с антигеном. "Убиквитированный" белок направляется в протеосомы, которые нарезают его на короткие пептиды [82, 83]. Протеосома представляет пептиды транслоцируются в эндоплазматический ретикулум с помощью ТАР 1/2 трансмембранного транспортера и нарезаются на короткие (8-Ю аминокислот) пептиды, которые связываются с ГКГС класса I [84]. Комплексы пептид - ГКГС класса I направляются в везикулах из эндоплазматического ретикулума на поверхность клетки, где они узнаются Т-клеточными рецепторами цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов [19, 20, 47]. Активировавшись, цитотоксические Т-лимфоциты убивают клетки-мишени, несущие на своей поверхности антигены в составе ГКГС I.
Кросс-презеитаиия или презентация ГКГС I экзогенных антигенов. Существует также явление кросс-презентации антигена (презентация экстраклеточных пептидов посредством ГКГС I) дендритными клетками, что чрезвычайно редко встречается у макрофагов [37]. На сегодняшний день точный молекулярный механизм кросс-презентации не известен. Считается, что кросс-презентация проходит ТАР-независимо. и антиген деградируется в эндосомах. Возможно, что эндосомы затем сливаются с эндоплазматическим ретикулумом, где процессированный антиген связывается с ГКГС Г Комплексы антиген-ГКГС I выставляются на поверхность клетки и также узнаются Т-клеточными рецепторами цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов. Презентация липидов посредством. CD1.
CD1 - семейство неклассических антиген-представляющих молекул, вовлеченных в регуляцию Т-клеточного ответа на липидные и гликолипидиые антигены микробов [85, 86]. CD1 молекулы являются маркерами ДК. CD1 - семейство (32-микроглобулин-ассоциированных неполиморфных гликопротендов, которые собираются с непроцессированным антигеном в эндосомальных/.тизосомальных компартментах и представляют антигены ТАР-независимо [86]. Как эндогенные, так и экзогенные липиды могут представляться в составе комплексов с CD1 молекулами.
В функции иммунной системы входит не только атака чужеродных или отклоняющихся от нормы молекул, но и сохранение собственных молекул хозяина. В последней функции интердигитатные ДК мозгового слоя тимуса играют ключевую роль.
Предшественники Т-клеток, тимоциты, приносятся в тимус кровотоком и мигрируют в субкапсулярную зону. Там они начинают экспрессировать CD4 и CD8 молекулы, и проходит перестройка генов Т-клеточного рецептора. Далее CD4+CD8+ клетки, имеющие на своей поверхности сер1 Т-клеточный рецептор, переходят в корковое вещество. В корковом веществе тимоциты взаимодействуют Т-клеточными рецепторами с комплексами пептид: Г КГС I или II, представленными на поверхности эпителиальных клеток тимуса. В случае позитивной селекции тимоцит, Т-клеточный рецептор которого способен узнать пептидТКГС I. получает сигнал к выживанию и созреванию. Такие тимоциты начинают экспрессировать гены CD8 цитотоксических Т-клеток, при этом подавляется экспрессия CD4. Тимоцит, узнавший комплекс пептид:ГКГС II, получает сигнал к выживанию. При этом экспрессия CD8 прекращается и экспрессируются гены, характерные для Txl и Тх2. Тимоциты, Т-клеточные рецепторы которых не провзаимодействовали с ГКГС I или П элиминируются апоптозом. В мозговом веществе тимуса проходит негативная селекция Т-клеток антиген-представляющими ДК и макрофагами. ДК представляют собственные антигены в комплексе с ГКГС. Тимоциты, имеющие чрезмерно высокую аффинность Т-клеточных рецепторов к собственным антигенам, элиминируются апоптозом. Для этого в коре тимуса находятся макрофаги, которые уничтожают останки погибших Т-клеток.
По последним данным, ДК также могут индуцировать периферическую толерантность. Так, ДК могут захватывать и представлять антиген, который присущ только определенной ткани. Например, ДК могут представлять в лимфоузлах пептиды апоптотических клеток, а также белки, специфически экспрессирующиеся в инсулин-продуцирующих (З-клетках поджелудочной железы. В целом, ДК могут представлять Т-клеткам огромное разнообразие антигенов "хозяина" и таким образом индуцировать толерантность к собственным белкам, которые не имеют доступ к тимусу [87, 88J. Как ДК включают или выключают иммунную систему На этот счет существует гипотеза, основанная на гетерогенности ДК [1]. Возможно, что определенные типы ДК ответственны за разные функции. Более оседлые лимфоидные ДК индуцируют толерантность к собственным белкам. Мобильные миелоидные ДК активируются чужеродными антигенами в периферических тканях и двигаются к лимфоидным органам чтобы инициировать иммунный ответ.
Фенотигшрование дендритных клеток моноклональными антителами
Десятки генов, продукты которых играют ключевую роль во многих биологических процессах, были выявлены посредством этого метода [157-159]. К недостаткам метода относят большое число "ложных" фрагментов, которые образуются при низкотемпературных (в случае коротких праймеров) условиях ПЦР, одна полоса в геле, как правило, представляет собой десяток различных нуклеотидных последовательностей. Для выяснения, какая из них дифференциально экспрессируется, требуется дальнейшее длительное исследование. Метод дифференциального дисплея применялся и для анализа мРНК в ДК в работе Marland et al. 1997 [8]. Было проведено сравнение экспрессии генов между ДК трех различных доноров и трех Т-клеточных линий (Jurkat, СЕМ и Peer), трех EBV - трансформированных В-клеточных линий (JY, BR и SR) и трех моноцитарных клеточных линий (U937, ТНР-1 и МопоМас 6). Три донора и три клеточные линии использовались, чтобы исключить из анализа индивидуальные специфические фрагменты, характерные для одного донора или линии. Была протестирована комбинация 17 праймеров и было выделено 8 ДК-специфичных полос. В результате последующего клонирования (ДК-специфических полос) было получено 23 различных клона. Из них 14 последовательностей не проявило гомологии ни с какими ранее описанными генами, 4 были гомологичны к EST и 3 - представляли собой известные гены (хлоридный канал, oriP-связывающий белок, митохондриальный убиквитин-связывающий белок и рибосомный белок L3). Это исследование было первым и единственным по применению дифференциального дисплея на ДК. Надо заметить что, так как в работе использовался дифференциальный дисплей, то необходимо проведение подтверждения дифференциальной экспрессии другими количественными методами (нозерн-гибридизацией или полуколичественной полимеразной цепной реакцией на матрице кДНК). До этого преждевременно делать заключения о дифференциальной экспрессии вышеописанных генов в ДК.
Известно, что тысячи генов и их продукты функционирую) в живом организме сложным и упорядоченным образом. Однако традиционные методы молекулярной биологии по оценке количества мРНК (нозерн-гибридизация и полуколичественная ПЦР на кДНК) позволяют детектировать один ген в одном эксперименте, что дает очень узкий взгляд на экспрессию генов. Одним из новейших и стремительно развивающихся методов в молекулярной биологии является гибридизация на кДНК макро- и микроматрицу. Также кДНК микроматрицы в англоязычной литературе называют: biochip, DNA chip, DNA microarray, gene array, gene chip, genome chip. Основа метода известна в молекулярной биологии уже 25 лет, с момента открытия Саузерном гибридизации меченых молекул нуклеиновых кислот с комлементарными, иммобилизованным на твердой поверхности [160]. Саузерн-блот был по существу первой матрицей [161]. Следующим шагом в развитии матриц было скринирование библиотек ДНК или кДНК, нанесенных вручную на фильтры. Другим достижением было создание кДНК макроматриц, которые представляли собой капроновые мембраны с упорядоченно расположенными кДНК молекулами. Клоны кДНК, как правило, хорошо охарактеризованы (их последовательности известны) и перенесены на фильтры робото-автоматически с микротитровальных плашек.
Взрыв интереса к матричным технологиям породил два новшества. Первое, использование стекла как твердой поверхности, не имеющей пор для иммобилизации нуклеиновых кислот, что дает возможность миниатюризации и флуоресцентной детекции (капроновые мембраны имеют поры и собственный относительно высокий флуоресцентный фон). Если зонды пометить двумя разными флуорофорами (например, опытный образец - СуЗ и контрольный - Су5, рисунок 6), то их можно гибридизовать на одну матрицу одновременно, что также понижает артефакты, связанные с не 100% совпадающими условиями двух разных гибридизаций.
Разница между микро- и макро матрицами заключается в размере пятна образца. Размер пятна на макроматрицах составляет 300 и более мкм в диаметре и гибридизационный сигнал может быть легко детектирован сканером для гелей и блотов. Размер пятиа на микроматрицах - менее 200 мкм в диаметре, такие матрицы обычно состоят из нескольких тысяч пятен образцов. Для производства и детекции сигнала на микроматрицах обычно необходимы робот (для нанесения образцов) и сканер с высокой разрешающей способностью.
Прямое секвенирование нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК и поиск гомологии
Однако, экспрессия генов JNK активирующей киназы 1 и а субъединицы + рецептора интерлейкина-7 была повышена в CD 14 моноцитах и отсутствовала в нДК. Из девяти генов домашнего хозяйства, нанесенных в качестве позитивного контроля на мембрану, была детектирована экспрессия восьми (альфа-тубулина, рибосомный белок L13A, С-4 альфа субъединица ГКГС I, убиквитин С, рибосомный белок S9, гипоксантин-гуанин фосфориботрансфераза, цитоплазматический бэта актин, глицероальдегид-3-фосфатдегидрогеназа печени). Интенсивность сигналов генов домашнего хозяйства была одинаковой для образцов нДК и моноцитов двух доноров. Экспрессия гена домашнего хозяйства тирозин 3-монооксигеназы не детектирована в моноцитах и ДК. При этом экспрессия одного гена - альфа-тубулина была в 2 раза повышена в ДК, что было ранее показано методом SAGE [9]. Все девять пятен негативных контролем (вместо кДНК фрагментов на мембрану нанесена вода или фрагменты кДНК фага X) не проявили позитивного сигнала. В дополнение была проведена серия экспериментов по проверке воспроизводимости гибридизационных профилей экспрессии мРНК между образцами двух доноров. Среди позитивных сигналов моноцитов двух доноров 1 ( 1%) из 216 генов проявил различную экспрессию. Для нДК, 32 (15%) позитивных сигнала из 216 были не воспроизводимы. Последнее может объясняться индивидуальным генетическим фоном и относительной гетерогенностью дифференцированной популяции нДК. Повторная гибридизация одной и той же кДНК мишени нДК на новую мембрану показала воспроизводимость интенсивности 100% сигналов.
Чтобы проверить, не зависят ли полученные различия между ДК доноров от неэквивалентности мембран или от отличий кДНК мишеней, была проведена повторная гибридизация на отмытую мембрану (гибридизованную ранее с кДНК из нДК) первого донора кДНК мишени из нДК второго донора. Результаты показали, что позитивные сигналы второго донора были высоко воспроизводимы (97.4%). Это почти эквивалентно воспроизводимости гибридизации кДНК мишени одного и того же образца на две новые мембраны и показывает эквивалентность использованных мембран.
Методом гибридизации на макроматрицу была впервые детектирована повышенная экспрессия для следующих генов: кодирующих рецептор 1 эпителиального дискоидин домена, репликационный фактор С, предполагаемый транскрипционный фактор DB1, прохибитин, протоонкоген RhoA и пей фактор дифференцировки.
Первое масштабное исследование по экспрессии генов в ДК (полученных сходным способом из моноцитов) и сравнение профиля экспрессии с моноцитами было проведено Hashimoto et al. методом SAGE [9]. Одним из генов с повышенной экспрессией в ДК был ген матриксной металлопротеиназы-1. В нашей работе мы нашли повышенную в 5.2 раза экспрессию гена рецептора 1 эпителиального дискоидин домена в нДК по сравнению с моноцитами. Sakamoto et al, 2001 было показано, что в результате активации гена рецептора 1 эпителиального дискоидин домена коллагеном повышается экспрессия матриксной металлопротеиназы [178]. Таким образом, наши данные косвенно поддерживают показанную SAGE методом повышенную экспрессию металлопротеиназы в ДК [9]. Она может быть вызвано повышенной экспрессией рецептора 1 эпителиального дискоидин домена. Рецептор 1 эпителиального дискоидин домена (или тирозин-протеин киназа САК) является рецептором коллагена, способным регулировать клеточный ответ на изменения внеклеточного матрикса [178]. Так как металлопротеиназа вовлечена в патологии, связанные с нарушениями миграций клеток и экстраклеточного матрикса [179], то изменение ее экспрессии посредством повышенной экспрессии рецептора 1 эпителиального дискоидин домена может отражать изменение структуры и миграции нДК. В вышеприведенном исследовании ДК методом SAGE была детектирована повышенная экспрессия большого числа генов, белковые продукты которых вовлечены в формирование цитоскелета, например альфа и бета актины и др. [9]. В нашей работе мы детектировали повышенную экспрессию в нДК протоонкогена RhoA (в 2.8 раз повышена экспрессия в нДК по сравнению с моноцитами) и предполагаемого транскрипционного фактора DB1 (в 4.3 раза по сравнению с моноцитами). Протоонкоген RhoA является членом Ras суперсемейства малых Г ГФ-связывающих белков [180]. В другой работе было показано, что RhoA, взаимодействуя с DB1, регулирует организацию цитоскелета в клетках различных организмов [181]. Повышенная экспрессия RhoA и DB1 при дифференцировке нДК из моноцитов периферической крови возможно свидетельствует об участии этих белков в построении клеточного скелета ДК, как, например, приобретении характерных древовидных отростков. В недавней работе Burns et al, 2001 была показана необходимость Rho молекул для формирования подосом, обеспечивающих подвижность и способность ДК к миграции[182]. Прохибитин является 30-кДа белком, кодируемым в 17 хромосоме человека (17q21). Прохибитин проявляет антипролиферативную активность, ингибируя клеточный цикл и синтез ДНК [183, 184]. В некоторых опухолях яичников, печени, легких и молочной железы человека были найдены мутации в гене прохибитина, вызывающие сдвиг рамки считывания и, как следствие, нарушения в белке [185]. Также было показано, что прохибитин может подавлять развитие опухолей [184]. Повышенная экспрессия гена прохибитина в ДК нами показана впервые (в 2.9 раз больше чем в моноцитах). Она может свидетельствовать об остановке пролиферационных процессов в нДК.
Репликационный фактор С является мультимерным праймер-узнающим белком, который необходим в процессе удлинения цепей ДНК, катализируемом ДНК-полимеразами дельта или элипсон человека. Более того, репликационный фактор С может быть вовлечен в другие процессы, такие как транскрипция, регуляция S-фазы клеточного цикла, апоптоз и дифференцировка [186]. Нами впервые показана экспрессия репликационного фактора С в ДК. Повышение экспрессии этого гена в 4.8 раза в нДК по сравнению с моноцитами периферической крови может свидетельствовать об участии репликационного фактора С в дифференцировке ДК.
Среди генов. пониженно экспрессирующихся в нДК (повышенно экспрессирующихся в моноцитах периферической крови), были детектированы гены, продукты которых регулируют клеточный цикл: JNK активирующая киназа 1. домен LIM киназы 1, активатор митотического роста и транскрипции, бэта субъединица рецептора тромбоцитарного фактора роста [187-190]. Это, возможно, свидетельствует о большей способности моноцитов к дифференцировке и пролиферации по сравнению с нДК.
Подтверждение профилей гибридизации на кДНК макроматрицу методом полуколичественной ПЦР на матрице кДНК
В настоящей работе мы использовали наиболее популярную модель ДК, полученную in vitro из моноцитов человека. При культивировании моноцитов периферической крови в среде с ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение семи дней дифференцировались нДК. Зрелые ДК были получены при индукции незрелых ДК ФНО-а в течение двух дней. Для подтверждения, что популяции клеток действительно являются моноцитами, нДК и зДК, мы провели анализ экспрессии известных поверхностных маркеров методом проточной цитометрии. На рисунке 9 представлены результаты анализа экспрессии ГКГС I. ГКГС И, CD 14, CD40, CD54, CD80, CD83 и CD86 на поверхности моноцитов, нДК и зДК трех различных доноров. Экспрессия поверхностных антигенов на нДК и зДК соответствует описанным ранее в литературе [47, 52, 57] и коррелирует с функциональными особенностями обоих типов ДК.
Метод гибридизации на кДНК макроматрицу был использован для изучения изменений экспрессии 588 генов при дифференцировке моноцитов в нДК. На рисунке 15 представлены гибридизационные профили моноцитов и нДК.
В Таблице 3 приведены 22 гена, повышенно экспрессирующиеся в нДК по сравнению с моноцитами, а также 9 генов, пониженно экспрессирующиеся в нДК после дифференцировки.
Нами впервые показана в нДК повышенная экспрессия генов, белковые продукты которых участвуют в процессах дифференцировки, пролиферации, формирования цитоскелета, миграции, например: ген рецептора 1 эпителиального дискоидин домена, ген репликационного фактора С, ген предполагаемого транскрипционного фактора DB1, ген протоонкогена RhoA, ген прохибитина и ген пей фактора дифференцировки.
В нашей работе впервые показана повышенная экспрессия как ФНО-а в нДК (в 40 раз в нДК но сравнению с моноцитами), так и его рецептора II (в 10.2 раза). Дифференциальная интенсивность сигналов, полученных гибридизацией на макроматрице, для ФНО-а была подтверждена методом полуколичественной ПЦР на матрице кДНК четырех доноров. Эти результаты интересны тем, что показывают "включение" генов системы ФНО в нДК после их дифференцировки из моноцитов периферической крови, что является аутостимуляцией созревания ДК. Среди пониженно экспрессирующихся в нДК были выявлены гены, кодирующие регуляторы и активаторы клеточного цикла: JNK активирующая киназа 1, LIM домен киназы 1 и др. Это, косвенно свидетельствует о меньшей потентности нДК к пролиферации по сравнению с моноцитами. Во избежание возможных гибридизационных артефактов мы подтвердили интенсивность гибридизационных сигналов, полученных на кДНК макроматрице, для всех шести выбранных генов другим методом (полуколичественная ПЦР на матрице кДНК) на образцах четырех доноров (рисунок 16). Для идентификации изменений экспрессии 1081 гена, происходящих при созревании нДК в зДК, использовался метод гибридизации на коммерческую кДНК микроматрицу. На рисунке 21 представлены гибридизационные профили нДК и зДК. В Таблице 4 приведен список генов, одинаково экспрессирующихся в нДК и зДК двух доноров, включающий гены иммунологически активных молекул, а также гены, транскрипты которых впервые идентифицированы в ДК. Особенный интерес представляют гены, транскрипты которых впервые детектированы в ДК: нейтрофин-3, предшественник носисептина, фактор 1 ответа EGF, белок В-клеточной лимфомы 3, белок нейросетчатко-специфичный, содержащий лейциновый зиппер, трофинин и факторы роста плаценты 1 и 2 (Таблица 4). Дополнительные исследования необходимы для установления функций продуктов этих генов в ДК.
Методом гибридизации на кДНК микроматрицу мы впервые детектировали повышенную экспрессию в зДК (по сравнению с нДК) генов, кодирующих транскрипционный фактор ZFM1 (участие в дифференцировке), Mos протоонкогена серин-трсониновую киназу (арест клеточного цикла), транскрипционный фактор, специфичный для В-клеток, фактор, стимулирующий рост предшественников В-клеток, ets транслокационный вариант 6 (функция не известна) и эпидермальный фактор роста CRIPTO (обеспечение миграции) (Таблица 5).
Полуколичественная ПЦР на матрице кДНК подтвердила повышенную экспрессию (в зДК четырех доноров) выбранных генов: трансформирующего фактора роста альфа, транскрипционного фактора ZFM1 и интегрина альфа 6 (рисунок 22). Методом полуколичественной ПЦР на матрице кДНК нами впервые была проанализирована экспрессия генов ренина, ренин-связывающего белка, ангиотензиногена. ангиотензин II / вазопрессин рецептора, рецепторов ангиотензииа 1 и 2 и ангиотензин-превращающего фермента в моноцитах, нДК, зДК и макрофагах (рисунок 23).
В последние годы тканевая ренин-ангиотензиновая система в клетках крови, как модулятор воспаления интенсивно изучается [215], [216, 217]. Различные клинические и экспериментальные данные продемонстрировали способность ренин-ангиотензиновой системы моноцитов человека активировать воспалительные процессы. В нашем исследовании мы нашли экспрессию в ДК ангиотензиногена, ангиотензин-превращающего фермента и рецептора ангиотензииа II/ вазопрессина. Это может указывать на возможный синтез в ДК активной формы ангиотензииа II, и влияние этого пептида на процесс воспаления посредством "включения" экспрессии провоспалительных цитокинов в дендритных клетках (рисунок 24).
Несомненно, что для установления роли ренин-ангиотензиновой системы в ДК и возможности применения полученных знаний в иммунотерапии необходимо дальнейшее изучение функций этой системы.
