Введение к работе
Изучение механизмов репарации ДНК является одной из важнейших областей клеточной биологии. Только нормальное функционирование этих репарирующих систем обеспечивает устойчивость клеток к облучению и действию химических агентов (Жестяников, 1979), стабилизирует генетический аппарат клетки при его нормальном функционировании - репликации и рекомбинации, то есть способствует поддержанию генетической стабильности клетки и обеспечению ее жизнедеятельности. Повреждения, возникшие в структуре ДНК и не подвергшиеся процессу репарации, неизбежно приводят к нарушению в других системах клетки, для которых ДНК служит источником и хранителем информации.
Одним из перспективных подходов к изучению репарационных процессов в ДНК является исследование мутантов с нарушениями тех или иных этапов репарации - процесса достаточно сложного и многообразного, к тому же неравномерно изученного. Если основные генетические механизмы эксцизионной репарации ДНК уже поняты, то процессы восстановления двунитевых разрывов и шире - репарации повреждений после гамма-облучения остаются недостаточно ясными. Таким образом, изучение мутантов с нарушениями процессов репарации ДНК от повреждений после гамма-облучения, особенно у человека, открывает перспективы не только для расшифровки механизмов репарации ДНК в клетках человека, что является главной задачей этого исследования, но и помогает пониманию генетических основ канцерогенеза и старения. Это также важно для выяснения роли репарации ДНК в нормальной жизнедеятельности клетки.
Сейчас существует достаточно большое количество клеточных штаммов человека, для которых описана их повышенная чувствительность к ионизирующему облучению и радиомиметикам (Lehmann, 1996; Zdzienicka, 1995). Именно сравнительное их изучение позволило в последнее время достичь значительного прогресса в этой области. В коллекции нашей лаборатории имеется ряд подобных штаммов, и подробное их описание и введение в международный научный обиход представляется нам необходимым.
Актуальность проблемы.
Все изученные нами клеточные линии имеют несколько повышенную чувствительность к гамма-облучению и действию таких радиомиметиков как алкилирующие агенты - эпоксиды.
Для двух из четырех изучавшихся болезней - синдрома Вернера и атаксии-телеангиэктазии - характерно то, что белок, кодируемый геном, с которым связывают данное заболевание, имеет геликазный домен. В случае исследованной нами пигментной ксеродермы, относящейся к группе С, белок, отвечающий за это заболевание, имеет убихитин-подобный N-терминальный домен и является аналогом дрожжевого белка RAD23, который облегчает связывание белка RAD14 с комплексом TFIIH. При этом во всех клеточных линиях от больных ХРС наблюдается измененная Q1 АТФаза, которая имеет невысокую, но явную геликазную активность. При введении "нормальной" Q1 АТФазы в клетки ХРС дефект эксцизионной репарации не корректируется (Masutani et al., 1994). Каким образом происходит изменение этой АТФазы и может ли ее геликазная активность быть связана с чувствительностью наших клеток к ионизирующей радиации и эпоксидам, остается неясным. К тому же, в данном конкретном случае, мы, вероятнее всего, имеем дело еще с одной мутацией, кроме ХРС, с которой и связана повышенная чувствительность к ионизирующей радиации у данной больной. При этом надо заметить, что другие больные пигментной ксеродермой, у которых описана повышенная радиочувствительность, относятся к другой группе комплементации - G, при которой иногда наблюдается фенотип, характерный для синдрома Коккейна Нужно учесть и то, что синдром Коккейна связан с комплексом TFIIH, и оба эти заболевания имеют дефект в репарации, связанной с транскрипцией
Синдром Коккейна, изученный нами, относится к группе комплементации А, и белок CSA, показывающий крайнюю эволюционную консервативность, вероятно, является белком-переносчиком внутриклеточных сигналов, способный связывать различные белки между собой с образованием крупных мультибелковых комплексов (Henning et al., 1995). При этом белок CSA всегда участвует в репарационных процессах, объединившись с белком CSB, который имеет геликазный домен (Troelstra et al., 1992). Белок CSB оказался функциональным гомологом белкового фактора, связывающего транскрипцию и репарацию у E.coli (Selby and Sancar, 1993), и вместе с белком CSA играет
-.1-
особую роль в привлечении белков эксцизионнои репарации в район остановившейся транскрипции (Hanavalt, 1992).
Таким образом, все изученные нами клеточные линии либо сами несу г измененные белки, имеющие геликаэную активность, которые или являются продуктом гена, ответственного за данное заболевание (AT, WS), или каким-то образом обязательно меняются именно при данной форме заболевания (01 АТФаза в клетках ХРС), либо дефектный в данной клеточной пинии белок прочно связывается с другим, имеющим геликазную активность (CSB/CSA комплекс), причем повреждение любого из этих белков приводит к одному и тому же заболеванию - CS.
Изучение целой панели клеточных линий от больных с дефектами репарации может служить моделью для исследования путей, которыми реализуется действие мутантных белков в клетке.
Так как почти все эти болезни связаны с преждевременным старением и ранней смертью, подробное исследование репарации в них представляет интерес и для понимания механизмов старения. Сопоставление данных по репарации в неимморталиэованных диплоидных фибробластах и лимфобластоидных(иммортализованных)клеточных линиях,полученных от одних и тех же больных,может прояснить вопрос о том, какие именно признаки кроме ограничения числа делений, зависят от иммортализации.
Эпоксиды являются алкилирующими агентами прямого действия, мутагенный эффект которых сильно варьирует в зависимости от объекта. Обширная сводка сравнительной токсичности различных эпоксидов была сделана Эренбергом и Хусейном еще в 1981 году (Ehrenberg and Hussain, 1981) и Гири в 1992 (Giri, 1992). Наиболее изученным из эпоксидов является этиленоксид (ЕЮ), его действие подробно описано а обзоре Деларко (Dellarco et al., 1990) Этиленоксид широко используется в химической промышленности и известен как агент, активно загрязняющий окружающую среду и возможный канцероген (см. обзоры у Kolman et al,, 1986, Florak and Zielhius, 1990). В статье Нигрена с соавторами (Nygren et <->)., 1994) детально описано образование разрывов под действием этиленоксида в нормальных человеческих диплоидных фибробластах при использовании различных методов. Пропиленоксид (РО) и эпихлорогидрин (ЕСН) являются производными этиленоксида и. как и этиленоксид, широко используются в химической промышлености (подробный обзор см, Kolman and Dusinska, 1995). Известно, чго ВО способен вызывать мутации в ГГФРТ-локусе в нормальных фибробластах человека при небольших
дозах 2.5-10 мМ/час (Kolman et al., 1992). Изучение действия эпоксидов на большой панели клеточных линий, как диплоидных неиммортализованных фибробластов, так и лимфобластоидных, имеет принципиальное значение для углубленного исследования механизмов их действия на клеточном уровне.
Для более глубокого изучения механизмов и белков, вовлеченных в репарацию ДНК после гамма-облучения были предприняты попытки влиять на репарационный ответ с помощью введения экзогенной рекомбиназы и предварительного изменения конформации хроматина облучением в малой дозе (1-5сГр).
Цели и задачи исследования.
Итак, целью исследования является изучение действия алкилирующих агентов и гамма-лучей на клетки больных с наследственными дефектами репарации ДНК. При этом ставятся следующие задачи:
1. Дальнейшее изучение линии XP2SP, двойная чувствительность которой
к УФ- и гамма-облучению была описана Михельсоном (Михельсон, 1981) для
уточнения ее чувствительности не только к гамма-облучению, но и к
радиомиметикам.
-
Исследование репарации после гамма-облучения и действия гаммамиметиков в клетках CS1SP, взятых от больной с синдромом Коккейна, так как данные о радиочувствительности на клеточном уровне при этом заболевании достаточно противоречивы.
-
Атаксия-телеангиэктазия - заболевание достаточно изученное и характеризующееся на клеточном уровне повышенной радиочувствительностью (Jorgensen and Shiloh, 1996). Интересным является каждый отдельный описанный случай, так как клетки могут различаться по своей чувствительности. Таким образом, для уточнения особенностей именно нашего случая - AT2SP -было необходимо провести исследование чувствительности клеток этого штамма не только к гамма-облучению, но и к различным гаммамиметикам.
-
Подробное изучение чувствительности клеточного штамма PR3SP к гамма-облучению и действию радиомиметиков, так как влияние подобных агентов на репарцию в клетках больных прогерией изучено недостаточно. Было бы интересно уточнить, относится ли наша больная прогерией к синдрому Вернера или это какая-либо другая форма лрогерии взрослых.
-
Изучение влияние иммортализации на репарацию ДНК от однонитевых разрывов, так как для двух больных - пигментной ксеродермой и прогериеи взрослых - нами были получены лимфобластоидные клеточные линии, иммортализованные вирусом Эпштейн-Барра (Михельсон и др., 1993; Наседкина и др., 1997), которые мы использовали для сравнительного изучения репарации в "смертных" и "бессмертных" клеточных линиях.
-
Изучение возможности влиять на репарацию в клетках человека после гамма-облучения с помощью введения в облученные клетки экзогенной рекомбиназы - RecA белка Е.соїі для исследования участия рекомбинации в ликвидации однонитевых и даунитевых разрывов ДНК.
-
Исследование роли информационного состояния ДНК для репарации повреждений, то есть возможную вовлеченность в этот процесс геликазной активности в клетках, на модели, разработанной совместно с Беляевым (Belyaev et al., 1996), включающей предварительное гамма-облучение диплоидных фибробластов человека малой дозой.
Научная новизна полученных результатов.
Полученные нами результаты окончательно подтвердили повышенную чувствительность к ионизирующей радиации клеток больной пигментной ксеродермой, как диплоидных фибробластов XP2SP, так и лимфобластоидных XP2SP(L). Причем показана повышенная чувствительность этих клеток как по критерию выживаемости (XP2SP), образования однонитевых разрывов (XP2SP{L)) и их ликвидации (и диплоидные фибробласты и лимфобластоидные клетки). Показано, что изученные нами дефекты репарации не связаны с иммортализацией клеток.
Новыми являются сведения о повышенной чувствительности клеток CSISPk ионизирующему облучению и действию эпоксидов. Особенно интересными оказались данные об их пониженной способности (по сравнению со всеми остальными изученными линиями) ликвидировать однонитевые разрывы ДНК, образующиеся после действия пропиленоксида, зпоксида, связывающегося с ДНК наименее прочно.
Подробно описана репарация в клеточной линии AT2SP, которая по своей чувствительности к гамма-облучению и действию эпоксидов с достаточными на то основаниями отнесена к группе АТ-вариант. Изучение репарации в клетках PR3SP впервые показало их повышенную чувствительность к гамма-облучению
и действию эпоксидов. Причем эта повышенная чувствительность была описана и в диплоидных фибробластах PR3SP и в лимфобластоидных иммортализованных клетках PR3SP(L). Повышенная чувствительность к гамма-облучению и двум из изученных эпоксидов мы наблюдали только по критерию выживаемости клеток. Но после действия этиленоксида ни те,ни другие клетки не способны ликвидировать однонитевые разрывы, образующиеся в ДНК, причем со временем количество разрывов может даже возрастать (в лимфобластоидных клетках), а не уменьшаться. То есть этот дефект репарации ДНК от разрывов не может быть скорректирован иммортализацией клеток.
Впервые было показано, что RecA белок бактерии E.coli способен при введении в клетки человека с помощью липосом участвовать в процессах репарации ДНК после гамма-облучения (Spivak et al., 1991; Спивак и др., 1991). Таким образом, была подтверждена роль рекомбинации в этих процессах - в ликвидации как однонитевых, так и двунитевых разрывов ДНК.
Показано, что изменение конформации хроматина при облучении клеток влияет на их выживаемость. Причем эта зависимость носит не однозначный характер, а является циклической и зависит как от типа клеток, так и'or дозы облучения (Belayev et al.,1996).
Практическая ценность рабощы.
Полученные в работе экспериментальные результаты расширяют и углубляют представления о характере и отчасти о механизмах действия ионизирующего облучения и радиомиметиков-эпоксидов на клетки человека и закономерностей репарации поврежденных клеток на уровне ДНК. Показана решающая роль процессов репарации в ликвидации разрывов ДНК после облучения и обработки эпоксидами.
Результаты работы существенны также для понимания генетических основ канцерогенеза и старения. В частности, полученные данные о том, что дефекты репарации ДНК в клетках от больной PR3SP, имеющей признаки преждевременного старения, не комплементируются иммортализацией этих клеток. При трансформации только снимается ограничение пролиферации (лимит Хейфлика), характерное для нетрансформированных клеток, но это происходит в любых клеточных штаммах, а не только прогерийных. Таким образом, можно предположить, что даже при снятии эффекта ограниченности
делений клеточной популяции мы не уберем другие признаки старения клеток и подобный путь не является панацеей для человечества.
Эпоксиды - опасные поллютанты и это еще раз подтверждено на клеточной модели, содержащей несколько разных штаммов клеток от больных с различными дефектами репарации ДНК. С методической точки зрения использование подобного набора клеточных штаммов может служить удобной и незаменимой моделью для испытания других химических агентов на канце-рогенность и мутагенность.
Подробное описание клеточных штаммов, полученных от больных в России, может быть в дальнейшем использовано для создания банка данных о мутациях, распространенных в нашей стране, и их сравнения с ранее описанными. Это важно для понимания этиологии данных заболеваний и возможных перспектив генной терапии.
Апробация работы.
Материалы работы были представлены на XVII Генетическом конгрессе в 1993 году в Бирмингеме (Англия), в 1994 году на I създе ВОГИС в Саратове и на 3-ей конференции Европейского общества аналитических исследований клеточной патологии в Гренобле (Франция), в 1995 году на ежегодной встрече токсикологов Северной Европы в 1995 году в Тампере (Финляндия), в 1996 году на 9-ом международном конгрессе по генетике человека в Рио-де-Жанейро (Бразилия), а также были неоднократно обсуждены на научных семинарах института цитологии РАН и департамента радиобиологии Стокгольмского университета.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на « страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего ?У/ публикаций. Диссертация иллюстрирована Зб рисунками и 1 таблицей.
