Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
1.1. Актуальность проблемы 7
1.2. Цели и задачи исследования 9
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 10
1.4. Научная новизна полученных результатов 10
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 11
1.6. Апробация работы 11
2. Обзор литературы 12
2.1. Пострешшкативная репарация ДНК. Основные понятия и определения 12
2.2. Пострегатикативная репарация ДНК у дрожжей S.cerevisiae 16
2.2.1. Я/Шб-эпистатическая группа 16
2.2.2. Роль убиквитинирования в пострепликативной репарации ДНК 20
2.2.3. Srs2 и связь пострепликативной репарации ДНК с рекомбинацией 24
2.3. Пострепликативная репарация ДНК путем синтеза с обходом повреждений 26
2.3.1. Пигментная ксеродерма вариантной формы, XP-V 26
2.3.2. ДНК-полимераза л 28
2.3.2.1. Данные биохимического анализа 29
2.3.2.2. Данные структурного анализа 33
2.3.3. Другие ДНК-полимеразы, способные осуществлять синтез с обходом повреждений 35
2.3.3.1. ДНК-полимераза і 35
2.3.3.2. ДНК-полимераза к 37
2.3.3.3. ДНК-полимераза С 38
2.3.3.4. hRevl 38
2.3.4. Двухполимеразная модель синтеза с обходом повреждений 39
2.3.5. Внутриядерная локализация Роїп в клетках человека 41
2.4. Пострепликативная репарация ДНК путем генной конверсии 42
2.5. Белок hRadl8 43
2.6. Связь репликации поврежденной ДНК с контролем прохождения клеточного цикла 44
3. Материалы и методы 48
3.1. Клеточные линии 48
3.2. Пептиды 48
3.3. Клонирование 48
3.4. Трансформация бактериальных штаммов и выделение плазмидной ДНК 49
3.5. Трансфекция и отбор стабильных трансфектантов 50
3.6. Обработка клеток метилметансульфонатом, стауроспорином и вортманнином 51
3.7. Анализ пострепликативной репарации ДНК 51
3.8. Иммуноблоттинг 52
3.9. Приготовление ядерных экстрактов клеток HeLa 53
3.10. Фосфорилирование in vitro 54
З11. Фосфорилирование in vivo 55
3.12. Иммунофлуоресцентный анализ PCNA в фиксированных клетках 56
3.13. Микроскопия и анализ изображений 57
4. Результаты 58
4 1. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин подавляет пострепликативную репарацию ДНК в клетках ХР-А 58
4.2. Исследование фосфорилирования ДНК-полимеразы в ответ на повреждение ДНК 59
4.2.1. С - концевой пептид Роїл не фосфорилируется in vitro 61
4.2.2. Poln не фосфорилируется in vivo в ответ на повреждение ДНК 64
4.3. Исследование внутриядерной локализации белка пострепликашвной репарация ДНК hRadl 8 в клетках млекопитающих и характера ее изменения в ответ на повреждение ДНК 66
4.3.1. Создание вектора, кодирующего гибридный 6eflOKGFP-hRadl8 66
4.3.2. Экспрессия и визуализация белка GFP-hRadl8 в клетках китайского хомячка (линии V79-4) 68
4.3.3. После действия ДНК-повреждающего агента ММС наблюдается накопление белка hRadl 8 и его транслокация к местам заблокированных репликативных вилок 70
4.3.4. Стауроспорин ингибирует ММС-индуцированное накопление и транслокацию hRad 18 74
4.3.5. Вортманнин ингибирует ММС-индуцированное накопление и транслокацию hRadl 8 77
4.4. Исследование фосфорилирования hRad 18 in vivo 80
Обсуждение 82
Выводы 90
- Цели и задачи исследования
- Пострепликативная репарация ДНК путем синтеза с обходом повреждений
- Пептиды
- Исследование внутриядерной локализации белка пострепликашвной репарация ДНК hRadl 8 в клетках млекопитающих и характера ее изменения в ответ на повреждение ДНК
Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния фосфорилирования белков Роїл и hRadl 8 на пострепликативную репарацию ДНК, а также в исследовании внутриядерной локализации белка ПРР hRadl8 в клетках млекопитающих и характера ее изменения в ответ на повреждение ДНК. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Изучить влияние стауроспорина, ингибитора протеинкиназ, на ПРР. Исследовать методом седиментации ДНК в градиенте плотности щелочной сахарозы восстановление размеров вновь синтезированных фрагментов ДНК в УФ-облученных и обработанных стауроспорином клетках человека линии ХР-А, дефектных по эксцизионной репарации нуклеотидов. 2. Выяснить, происходит ли фосфорилирование ДНК-полимеразы п, индуцированное повреждениями ДНК. 3. Сконструировать вектор, кодирующий гибридный белок GFP-hRadl 8 и выделить клеточный клон, стабильно экспрессирующий GFP-hRadl 8. 4. Методами иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентного анализа изучить характер накопления и внутриядерной локализации белка GFP-hRadl 8 до и после обработки клеток ММС. Исследовать влияние стауроспорина на характер локализации GFP-hRadl 8 в этих клетках. 5. При помощи экспериментов по включению [ Р]-ортофосфата in vivo выяснить, происходит ли ММС-индуцированное фосфорилирование белка GFP-hRadl8. 1.3. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин подавляет ПРР в клетках человека. 2. ДНК-полимераза л не фосфорилируется в ответ на повреждение ДНК. 3. Белок ПРР hRadl8 в ответ на повреждение ДНК ММС накапливается в клетках и рекрутируется к местам заблокированных репликативных вилок. 4. ММС-индуцированное накопление hRadl8 в заблокированных фокусах репликации подавляется стауроспорином. 1.4. Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые показано, что белок ЇЇРР hRadl8 накапливается в клетках после обработки ДНК-повреждающим агентом метилметансульфонатом и рекрутируется к местам заблокированных репликативных вилок. Было показано, что данное накопление hRadl8 в заблокированных фокусах репликации подавляется ингибитором протеинкиназ стауроспорином. При помощи метода седиментации ДНК в градиенте плотности щелочной сахарозы впервые показано, что стауроспорин ингибирует ПРР в клетках человека. Впервые проверялась, но не подтвердилась гипотеза о том, что ДНК-полимераза ц фосфорилируется в ответ на повреждение ДНК. 1.5. Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные данные вносят существенный вклад в понимание механизмов контроля пострепликативной репарации ДНК и имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения свойств белков Ро1т и hRadl8 и их роли в пострепликативной репарации ДНК в клетках млекопитающих. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций по молекулярной и клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений. 1.6. Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ (из них 4 статьи). Материалы диссертации были представлены на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002 г.), а также на научных семинарах Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН. ДНК всех организмов постоянно подвергается действию повреждающих агентов, как внутренних, например, продуктов гидролиза и окисления, так и внешних, таких как, УФ-свет, ионизирующее облучение (ИО) и химические канцерогены различной природы. Поддержание целостности структуры ДНК - одно из необходимых условий нормального роста и деления клеток. В клетках эукариот существует четыре основных защитных механизма ответа на повреждения ДНК: 1) репарация ДНК; 2) контроль прохождения временных точек клеточного цикла (чекпоЙнты, checkpoints); 3) апоптоз и 4) процессы, обеспечивающие толерантность клетки к повреждениям ДНК (damage tolerance). Репарация ДНК, в процессе которой происходит удаление повреждений и восстановление первоначальной структуры ДНК, является наиболее эффективной системой защиты клетки от повреждений. Можно выделить, как минимум четыре механизма репарации ДНК: а) эксцизионная репарация оснований (ЭРО); б) эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН); в) репарация неправильно спаренных оснований (mismatch repair) и г) рекомбинационная репарация. Внутренние (или "спонтанные") повреждения ДНК удаляются при помощи ЭРО. ЭРН отвечает за удаление широкого спектра повреждений ДНК, в особенности тех, которые вносят в структуру ДНК значительные искажения, например, УФ-повреждений. Репарация неправильно спаренных оснований корректирует ошибочно вставленные (некомплементарные) основания, небольшие делеции и вставки, образовавшиеся в результате ошибок репликативных ДНК-полимераз. Рекомбинационная репарация отвечает за удаление двунитевых разрывов ДНК и поэтому особенно необходима при ответе клетки на ионизирующее облучение. Помимо репарации ДНК в клетке существуют сложные регуляторные механизмы, которые в ответ на повреждения ДНК предотвращают вхождение клеток в фазы S и М клеточного цикла. Такое индуцированное затягивание G1- и G2- фаз клеточного цикла необходимо для удаления имеющихся в ДНК повреждений и избежания синтеза ДНК и деления клеток в присутствии этих повреждений. Помимо этого существует стратегия уничтожения клеток, ДНК которых получила значительные повреждения. Этот механизм, называемый апоптозом, направлен на поддержание целостности генома многоклеточных организмов. Несмотря на эффективную работу систем репарации ДНК и контроля прохождения временных точек клеточного цикла, некоторые повреждения могут оставаться в ДНК к моменту вхождения клетки в S-фазу клеточного цикла. Основные репликативные ДНК-полимеразы не способны осуществлять синтез на поврежденной матрице, поэтому при прохождении репликативной вилки через поврежденный участок происходит ее блокировка. Существуют механизмы, обеспечивающие толерантность клетки к повреждениям, находящимся в реплицирующейся ДНК. Данная защитная система, в отличие от репарации ДНК, не удаляет повреждения, но позволяет клетке завершить раунд репликации, несмотря на их присутствие.
Пострепликативная репарация ДНК путем синтеза с обходом повреждений
Пострепликативную репарацию ДНК у высших эукариот обнаружили в начале 70-х годов. Несколькими группами исследователей было показано, что в клетках млекопитающих происходит восстановление размеров коротких, вновь синтезируемых фрагментов ДНК в течение 2-3 часов после УФ-облучения (Buhl et al., 1972; Lehmann, 1972). 2.3.1. Пигментная ксеродерма вариантной формы, XP-V. Леман с сотр. с помощью импульсного мечения и определения молекулярного веса синтезируемых в процессе репликации фрагментов ДНК в градиентах щелочной сахарозы обнаружил явный дефект ПРР в клетках больных пигментной ксеродермой вариантной формы (XP-V) (Lehmann et al., 1975). Пигментная ксеродерма - это наследственное заболевание, характеризующееся высокой частотой появления различных кожных изменений, таких как веснушки, изменения пигментации, сухость под действием солнечного света, и увеличением (примерно в 2000 раз) случаев возникновения рака кожи (Bootsma et al., 1998). У большинства пациентов клинические проявления вызваны дефектами в генах, контролирующих ЭРН УФ-индуцированных провреждений ДНК. В зависимости от поврежденного гена различают 7 групп комплементации (ХР-А - XP-G). Однако около 20% всех больных, которых отнесли к восьмой (вариантной) группе XP-V, имели нормальную ЭРН и на клеточном уровне, по признаку выживаемости клеток после УФ-облучения, не отличались от нормы (Cordonnier, Fuchs, 1999). XP-V клетки способны осуществлять синтез интактных дочерних нитей ДНК после облучения УФ-светом, но это занимает значительно большее время, чем в нормальных клетках и практически полностью подавляется кофеином (Lehmann et al., 1975). Помимо этого кофеин делает XP-V клетки, в отличие от нормальных клеток, гиперчувствительными к УФ-облучению (Arlett et al., 1975). Так же как на клетки ХР-А - XP-G, имеющие дефект ЭРН, УФ-облучение оказывает гипермутагенное действие и на клетки ХР-V. Эта схожая гипермутагенность двух типов ХР-клеток, обладающих различными молекулярными дефектами, возможно, и объясняет сходство в характере кожных патологий и в частоте случаев рака кожи у пациентов. 2.3.2. ДНК-лолимераза ц. Около 25 лет исследователи не могли обнаружить ген, поврежденный в клетках XP-V. Выявлению этого гена предшествовали и во многом способствовали исследования молекулярного механизма ПРР in vitro, с использованием плазмидных ДНК, содержащих УФ-фотопродукты или другие повреждения ДНК, и экстрактов клеток человека.
Эти исследования позволили сделать вывод о том, что в экстрактах клеток XP-V, в отличие от экстрактов, полученных из нормальных клеток, не происходит СОП (Cordeiro-Stone et al., 1997; Ensch-Simon et al., 1998; Svoboda et at., 1998; Cordonnier et al., 1999). Hanaoka с сотр. использовали такую in vitro систему, позволяющую осуществлять СОП, для очистки белка, дефектного в клетках XP-V. Комплементируя молекулярный дефект СОП in vitro различными белковыми фракциями, полученными из экстрактов нормальных клеток, исследователям удалось выделить белок, обладающий ДНК-полимеразной активностью (Masutani et al., 1999а). После клонирования гена, кодирующего данный белок, выяснилось, что это гомолог S. cerevisiae RAD30 (Роїт)) (Masutani et al., 1999b). Одновременно другой группе исследователей при помощи сканирования электронной базы данных EST (Expressed Sequence Tag) удалось обнаружить, а затем клонировать тот же самый ген (Johnson et al., 1999а). Обе группы обнаружили мутации гена hRad30 у нескольких больных XP-V. Таким образом, ген XPV является гомологом дрожжевого гена RAD30 и кодирует принадлежащую к Y-семейству ДНК-полимеразу ц человека. 2.3,2.1. Данные биохимического анализа. Ро1т является дистрибутивной ДНК-полимеразой и, в отличие от процессивных репликативных полимераз, способна вставлять лишь от 1 до 8 остатков нуклеотидов при копировании неповрежденной матрицы (Masutani et al., 2000). Обладая невысокой точностью копирования ДНК, Poln встраивает неправильные основания с частотой порядка 10 (Matsuda et al., 2000; Johnson et al., 20006; Bebenek et al., 2001). Полноразмерный фермент Poln, белок с молекулярным весом около 78,4 Ша (713 аа), так же как и протеолитическии фрагмент белка, у которого отсутствует С-концевоЙ участок из 200 аминокислот, способен in vitro осуществлять с одинаковой эффективностью синтез неповрежденной матрицы и матрицы, содержащей циклобутановые пиримидиновые димеры (ЦПД), (Masutani et al., 2000; Johnson et al., 20006). Было показано, что рекомбинантные Роїт] человека и мыши комплементируют УФ-чувствительность клеток XP-V, а также неспособность осуществления СОП in vitro в экстрактах, полученных из этих клеток. (Yamada et al., 2000). В результате интенсивного изучения способности реплицировать in vitro ДНК, содержащую различные повреждения, было установлено, что помимо ЦПД Poln осуществляет эффективный СОП на матрицах, содержащих 8-оксогуанин и О-6-метилгуанин, но не способна обходить, другой основной УФ-фотопродукт, пиримидин (6-4) пиримидон (6-4 ФП) (табл. 2). Напомним, что синтез с обходом повреждения в матричной нити ДНК можно разделить на две стадии: встраивание нуклеотида напротив поврежденного основания и последующее удлинение цепи за повреждением. POITJ обладает способностью встраивать нуклеотиды с различной эффективностью напротив повреждений ДНК разных типов. В случае ЦПД (Masutani et al., 2000; Johnson et al, 20006) и 8-оксогуанина (Haracska et al., 2000; Zhang et al., 2000a) эффективность встраивания сравнима с оной напротив неповрежденного основания, тогда как с другими типами повреждений эта эффективность значительно меньше. Несмотря на то, что Poln встраивает преимущественно "правильные" ігуклеотидьі, например дАМФ напротив обоих тиминов ЦПД, цитозин напротив AAF-G и цитозин напротив 8-оксогуанина, правильность и эффективность встраивания варьируют в зависимости от типа повреждения. Вторая стадия СОП, удлинение цепи, является не менее критичной для общей эффективности и точности синтеза на поврежденной матрице. Оказалось, что POITJ способна удлинять цепь ДНК за повреждением с гораздо большей эффективностью в случае, когда напротив двух тиминов ЦПД были встроены два аденина (Masutani et al., 2000). Аналогично, лишь за дЦМФ, встроенным напротив AAF-G, синтез элонгируется эффективно (Masutani et а!., 2000). Таким образом, подобная избирательность на обеих стадиях встраивания и элонгации позволяет ДНК-полимеразе т осуществлять обход ЦПД и AAF-G в матричной нити с высокой степенью точности. Для некоторых типов повреждений ДНК Polrj способна вставлять нуклеотид напротив повреждения, но не способна удлинять вновь синтезированную нить ДНК. Примером таких повреждений являются 6-4 ФП.
РЫц может вставлять гуанин напротив 3 -тимидина данного фотодимера, но не способна далее элонгировать синтез (Masutani et al., 2000; Zhang et al., 2000a; Johnson et al., 2001). Помимо описанных выше данных существуют работы, направленные на изучение свойств Роїп в живой клетке. Исследования с использованием нормальных дрожжевых линий, а также линий дефектных по Poln показали, что репликация in vivo матрицы, содержащей 6-4 ФП, проходит с ошибками и безошибочно в 60 и 40% случаев соответственно. В отсутствии Роїя мутагенный обход 6-4 ФП был значительно подавлен, тогда как уровень безошибочного СОП оставался прежним (Bresson, Fuchs, 2002). То есть, в отличие от ситуации с ЦПД, обход ДНК-полимеразой rj 6-4 ФП осуществляется исключительно с ошибками. Avkin с сотр. разработали метод количественной оценки эффективности синтеза с обходом АП-сайтов в клетках человека in vivo. В данных экспериментах проводили временную трансфекцию культивируемых клеток плазмидой, содержащей однонитевой участок и сайт-специфическое повреждение, находящееся в этом однонитевом участке. Об эффективности СОП судили по заполнению этих брешей, количественно оценивая способность плазмид, выделенных из клеток человека, к трансформации индикаторного штамма Е. coli. Сравнивая различные линии клеток и влияние ингибиторов, авторы показали, что ДНК-полимераза л не является необходимой для синтеза с обходом АП -сайтов in vivo (Avkin et al., 2002). Сопоставление аминокислотных последовательностей ДНК-полимераз Y-семейства выявляет высокую консервативность N-концевых областей (первых 350 аминокислот) этих ферментов и относительно невысокую степень гомологии их С-концевых доменов. Masutani с сотр. показали, что за каталитическую активность Polrj отвечают первые 520 N-концевых аминокислоты (Masutani et al., 19996). Дальнейший делеционный анализ показал, что каталитическая активность содержится в 513 аа N-концевом полипептиде дрожжевой Ро1г[ (Kondratick et al., 2001), который соответствует первым 437 аа фермента человека.
Пептиды
В работе были использованы следующие пептиды: PolN; TLESFFK-PLTH, PolM: TLEAFFKPLAH (Wita Proteomics AG, Германия) и CHKtide: KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR (Upstate, США). Нами была сконструирована плазмида, кодирующая гибридный белок GFP-hRadl8, Фрагмент ДНК, содержащий кодирующий участок гена hRadl8, был амплифицирован при помощи ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pcDNA3-hRadl8, любезно предоставленной нам д-ром. С. Татеиши (S. Tateishi, Университет Кумамото, Япония) (Tateishi S., et. al., 2000) и праймеров: hRAD18-Nl - GACTCCCTGGCCGA-GTCTC; hRAD18-N2 - CAAAGCTGGTACCTGTGTGAAATGTC. Реакцию проводили на амплификаторе PCR Sprint (Habaid Limited, Великобритания). Условия реакции; реакцию проводили в 50 мкл смеси, которая содержала: 10 нг матричной плазмиды pcDNA3-hRadl8, 170 нг каждого праймера, 2 мМ дАТФ, 2 мМ дЦТФ, 2 мМ дГТФ, 2 мМ дТТФ, 1,5 мМ MgCb, , їх ГЩР буферный раствор, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразьг (Boehringer, Германия). Условия проведения реакции; первый цикл: 94 С -5 мин; следующие 35 циклов: 94С - 1 мин, 64С - 1 мин, 72С - 2 мин; последний цикл: 72РС - 15 мин. Амплифицированный фрагмент был затем вставлен в вектор N-концевого слияния с GFP для ТОРО-клонирования pcDNA3.1/NT-GFPOPO (Invitrogen, США). Исходно линеаризованный вектор pcDNA3.1/NT-GFPOPO, содержащий одиночные выступающие остатки дезокситимидина (Т) с 3 -концов, лигировали с продуктом ІЩР-реакции, имеющим одиночные выступающие З -концевые остатки дезоксиаденозина (А). Условия реакции: К 4 мкл ПЦР-продукта, содержащего 100 нг кДНК добавляли 1 мкл «активированного» вектора, который содержал топоизомеразу I и инкубировали в течение 5 мин при КТ, мягко перемешивая. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл раствора: 0,3 М NaCl, 0,06 М MgCb- Полученной конструкцией трансформировали компетентные клетки ТОРЮ. 3.4. Трансформация бактериальных штаммов и выделение плазмидной ДНК. Введение плазмидной ДНК в клетки: 20 нг плазмидной ДНК добавляли к 200 мкл компетентных клеток ТОРЮ, инкубировали при 0С 30 мин, помещали в 42С на 1,5 мин, инкубировали при 0С 10 мин, переносили в 1 мл LB (37С) и выращивали в течение 1 ч при мягком шейкировании при 37С. Высевали клетки из расчета 0,3-0,5 мл на чашку Петри диаметром 90 мм на селективный агар с ампицилином (100 мкт/мл).
Клоны отбирались при помощи ГГЦР (условия описаны ранее). Плазмидная ДНК была выделена из лизатов E.coli с использованием набора фирмы QIAGEN (США). Правильную ориентацию встроенного гена hRadlS в плазмиде GFP-N-hRadl8 определяли методом рестриктазного анализа. Плазмидную ДНК GFP-N-hRadl8 расщепляли рестриктазой Kpnl при 37С в течение 1 ч и анализировали в 0.9%-ном агарозном геле. Наличие в полученной плазмиде последовательности, кодирующей гибридный белок GFP-hRadl8, было подтверждено секвенированием. 3.5. Трансфекция и отбор стабильных трансфектантов. Трансфекцию клеток линии V79-4 плазмидой GFP-N-hRadl8 проводили с использованием TransFast-реагента (Promega, США). Клетки высевали накануне (около 2x10 клеток на 35 мм чашку) с таким расчетом, чтобы плотность монослоя культуры на следующий день составляла 80%. Приготовление смеси ДНК с TransFast-реагентом из расчета на I чашку диаметром 35 мм: в пробирку помещали 800 мкл среды (RPMI - полной с сывороткой и антибиотиками, нагретой до +3?С), добавляли 3 мкг ДНК, 15 мкл TransFast-реагента, мягко перемешивали встряхиванием и оставляли при КТ на 15 мин. Потом удаляли среду с клеток, добавляли к клеткам смесь ДНК с TransFast-реагентом и помещали в СОг инкубатор на 1 ч. Через 1 час добавляли к клеткам полную среду. Отбор стабильных трансфектантов проводили в течение 1-2 недель в ростовой среде, содержащей селективный антибиотик G418 в концентрации 1 мг/мл. Клоны, экспрессирующие белок GFP-hRadl8, отбирали при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа, оценивая флуоресценцию GFP. Клетки, выращиваемые на предметных стеклах или чашках Петри, обрабатывали ДНК-ал килирующим агентом метилметансульфонатом (Aldrich, США) в концентрации 0,01 или 0,02% путем добавления его в ростовую среду на 1 ч с последующей двукратной отмывкой PBS. Для обработки клеток ингибитором широкого спектра протеинкиназ стауроспорином (Sigma, США) использовали концентрации 20 или 200 нМ. В экспериментах с обработкой клеток УФ-светом или ММС стауроспорин добавляли в ростовую среду за 30 мин до обработки ДНК-повреждающим агентом, после чего стауроспорин присутствовал до конца периода инкубации. Для обработки клеток ингибитором протеинкиназ PI3-семейства вортманнином (Sigma, США) использовали концентрации 20 или 200 мкМ. В экспериментах с обработкой клеток ММС вортманнин добавляли в ростовую среду одновременно с ДНК-повреждающим агентом, после чего вортманнин присутствовал до конца периода инкубации. 3.7. Анализ пострепликативной репарации ДНК. 8У40-трансформированные фибробласты больных пигментной ксеродермой группы комплементации А (линия XP12RO) выращивали в чашках Петри в среде DMEM, содержащей 10% (ФБС). После промывки в PBS и облучения УФ-светом (5 Дж/м2, 254 нм) клетки инкубировали при 37С 30 мин в ростовой среде, содержащей 5% ФБС и [ Н]-тимидин (20 мкКю/мл, 16 Кю/мМ) и затем еще 3 часа в DMEM, не содержащей метки. Клетки снимали с чашек резиновым шпателем, ресуспендировали в лизирующем растворе, содержащем 0,6 М NaOH, 0,2 М NaCl, 1% саркозила, 20 мМ EDTA, 0,5 мкг/мл протснкиназы К. Суспензию (0,1 мл/ 105 клеток) наслаивали на верх щелочных сахарозных градиентов (5-20% сахарозы в буферном растворе, содержащем 0,9 М NaCl, 0,3 М NaOH, 10 мМ EDTA), которые затем центрифугировали в ультрацентрифуге L2-65K Beckman (ротор SW-50.1) при 20С 90 мин при 30000 об/мин. Градиенты раскапывали по секундомеру на бумажные фильтры, которые затем промывали 5%-ной трихлоруксусной кислотой, этанолом и высушивали. Подсчет радиоактивности производили в толуольном сцинтилляторе в счетчике Beckman. 3.8. Иммуноблоттинг. Клетки, выращенные на чашках Петри, после удаления ростовой среды промывали два раза буферным раствором PBS, высушивали 5 мин на воздухе и проводили экстракцию, обрабатывая клетки 10 мин при комнатной температуре цитоскелетным буферным раствором CSK (Kamiuchi et al., 2002), содержащим 10 мМ Pipes, рН 6,8, 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1 мМ EGTA, 0,5% Triton Х-100, 1 мМ PMSF, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл леупептина.
После этого клетки промывали PBS и дополнительно экстрагировали 20 мин 100%-ным метанолом при -20UC. После промывки PBS клетки собирали резиновым шпателем и ресуспендировали в лизирующем буферном растворе RIPA, содержащем 50 мМ Tris, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% Na дезоксихолата, 0,1% SDS, 1мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл леупептина. Лизис проводили в течение 30-60 мин при +4С, периодически активно встряхивая суспензию клеток. После 10 мин центрифугирования при 9000 g, (+4С) отбирали надосадочную жидкость. Полученный клеточный экстракт разделяли на аликвоты и хранили при -70С. Концентрацию тотального белка в экстрактах измеряли при помощи ВСА Kit (Pierce, США) и уравнивали в каждом эксперименте. Клеточные экстракты смешивали с равными объемами 2-х кратного лизирующего буферного раствора Лэмли, содержащего 50 мМ Tris рН 6,8, 0,8 мМ EDTA, 4% SDS, 0,25% бромфенола, 20% глицерина и 200 мМ DTT. Пробы инкубировали 5 мин при 96 С, центруфугировали при 14000 g 1 мин. Далее белки из надосадочной жидкости разделяли в 7,5-10%-ном SDS-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные фильтры Hybond С (Amersham, Великобритания) в буферном растворе, содержащем 25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 20% метанола, в течение 16 ч при 30 В. Фильтры блокировали в течение ночи при +4С в растворе 5%-ного сухого молока в TBSw (20 мМ Tris, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20). Все антитела разводили в 1%-ном растворе сухого молока на TBSw, инкубации проводили при КТ и между инкубациями промывали 30 мин в TBSw. Фильтры инкубировали с моноклональными мышиными антителами к GFP (JL-8, 1:1000, Clontech, США), и к PCNA (РС-10, 1:1000, Santa Cruz, США), 1 ч при КТ и далее с овечьими антителами к мышиному IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2000, Amersham, Великобритания), 1 ч при КТ. Детекцию сигнала от вторичных антител проводили с помощью хемилюминесцентного метода (ECL, Amersham, Великобритания).
Исследование внутриядерной локализации белка пострепликашвной репарация ДНК hRadl 8 в клетках млекопитающих и характера ее изменения в ответ на повреждение ДНК
Нами была поставлена задача, исследовать характер внутриядерной локализации белка hRad!8 и его возможное изменение в ответ на повреждение ДНК. Для этого нами была сконструирована плазмида, кодирующая гибридный белок GFP-hRadl8 и создан клон клеток китайского хомячка V79-4, стабильно экспрессирующий данный белок. 4.3.1. Создание вектора, кодирующего гибридный белок GFP-hRadl8. Плазмида GFP-N-faRadl8, кодирующая гибридный белок GFP-hRadl8, была получена клонированием амплифмцированного фрагмента кДНК, содержащего кодирующий участок гена hRadl8, в вектор N-концевого слияния с GFP для ТОРОклонирования pcDNA3.1/NT-GFPOPO (Invitrogen, США) (рис. 7). Данный вектор предназначен для экспрессии встроенных в него генов в клетках млекопитающих под контролем CMV-промотора. Наличие ориджина репликации SV-40 обеспечивает возможность амплификации данного вектора в клетках млекопитающих после трансфекции, а ген устойчивости к G418 (Neo) позволяет отбирать клоны стабильных трансфектантов путем культивирования клеток после трансфекции в ростовой среде, содержащей данный антибиотик. Полученная нами конструкция содержала стоп-кодон гена hRadlS, но не содержала ATG-кодона, замененного последовательностью, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), со своим старт-кодоном, с которого и начиналась транскрипция гена GFP-hRadI8. После трансфекции клеток V79-4 плазмидой GFP-N-hRadl 8 отбор стабильных трансфектантов проводили в течение 1-2 недель в ростовой среде, содержащей G418 в концентрации 1 мг/мл. Клоны, экспрессирующие белок GFP-hRadl8, отбирали при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа, оценивая флуоресценцию GFP. Флуоресцентный маркер GFP позволил определить, что белок GFP-hRadl8 имеет внутриядерную локализацию. Во многих ядрах распределение белка имело диффузный характер, хотя в некоторых ядрах, помимо диффузного, также наблюдался GFP-hRadl8, сконцентрированный в фокусах (рис. 8А). Анализ лизатов клеток стабильного клона при помощи иммуноблоттинга и антител к GFP выявлял мажорную белковую зону, соответствующую примерно 110 кДа (рис. 8Б). Данный молекулярный вес несколько больше предполагаемого веса GFP-hRadl8, который, согласно теоретическому расчету, составляет порядка 85 кДа. Однако есть основания утверждать, что детектируемый банд - это исследуемый гибридный белок GFP-hRadl8, поскольку при помощи РТ-ПЦР и секвенирования мы подтвердили наличие транскриптов, кодирующих данный гибридный белок в клетках стабильного клона.
Помимо этого при помощи иммуноблоттинга и антител к GFP идентичная белковая зона обнаруживалась в лизатах клеток V79-4 после временной трансфекции плазмидой GFP-N-hRadl 8. Отличие между теоретическим и экспериментально установленным размером GFP-hRadl8 может быть вызвано посттрансляционными модификациями белка либо его аномальной подвижностью в ПААГ, но не связано с какой-либо перестройкой последовательности плазмиды GFP-N-hRadl 8 после ее интеграции в хромосому. При помощи иммуноблоттинга было показано, что через 5 ч после обработки ММС в клетках происходит существенное накопление белка GFP-hRadl8 (рис. 9Д). Наблюдалось также общее увеличение интенсивности флуоресценции GFP и появление ярких фокусов GFP-hRadl8 в большинстве ядер (рис. 9Б). Данное накопление изучаемого белка может быть связано с ММС-индуцированной активацией экспрессии на уровне транскрипции. В используемых нами клетках стабильного клона V79-4 ген GFP-hRadl8 находился под контролем CMV-промотора. Поскольку в той же клеточной линии китайского хомячка мы не наблюдали ММС-индуцированного увеличения экспрессии других гибридных белков, находящихся под контролем CMV-промотора (например, GFPRF1), мы предполагаем, что обработка ММС приводит к накоплению белка GFP-hRadl8 за счет его стабилизации, а не за счет усиления транскрипции гена GFP-hRadl8. Данные иммунофлуоресцентного анализа и иммуноблоттинга показывают, что после обработки клеток цитоскелетным буферным раствором CSK (Kamiuchi et аК, 2002), содержащим 0,5% Triton Х-100, и далее 100%-ным метанолом при -20С, белок GFP-hRadl8 практически полностью экстрагируется из необработанных ММС клеток (рис. 9, ср. А и В). Однако, через 4 ч после обработки клеток ММС происходит не только увеличение общего количества белка GFP-hRadl8, но и накопление неэкстрагируемой Тритоном и метанолом фракции этого белка (рис. 11, верхняя панель, ср. дор. 5 и 6). В то же время, в большинстве ядер клеток после экстракции CSK-буфером GFP-hRadl8 локализуется в виде ярких дискретных фокусов (рис. 9Г). Таким образом, можно заключить, что в ответ на повреждение ДНК физико-химические свойства белка GFP-hRadl8 меняются, и происходит его внутриядерное накопление и иммобилизация на каких-то детергент-нерастворимых ядерных структурах. Вспомогательный фактор ДНК-полимеразы 5, белок PCNA, маркирует места синтеза ДНК и во время репликации рекрутируется к репликативным вилкам и становится устойчивым к экстракции детергентом Triton Х-100 (Bravo, MacDonald-Bravo, 1987) и метанолом (Madsen, Celis, 1985). Kannouche с сотр. показали, что через 4-5 часов после обработки клеток ММС происходит накопление клеток, содержащих дискретные фокусы Ро1т, колокализующиеся с детергент-нерастворимым PCNA и сайтами включения 5-бромдезоксиуридина (репликативными центрами). На основании этих данных было сделано предположение о том, что Poll] накапливается в фокусах, содержащих заблокированные повреждениями ДНК репликативные вилки (Kannouche et al., 2001). Чтобы установить, происходит ли накопление белка GFP-hRadl8 в местах заблокированных репликативных вилок в ответ на повреждение ДНК, мы исследовали возможность колокализации GFP-hRadl8 с эндогенным PCNA до и после обработки клеток ММС при помощи иммунофлуоресцентного анализа.
Для визуализации PCNA в фиксированных клетках V79-4, стабильно экспрессирующих GFP-hRadl8, использовали мышиные антитела к PCNA и вторичные антитела к мышиному IgG, связанные с флуорофором Texas Red. Перед фиксацией контрольных и обработанных ММС клеток растворимые фракции белков экстрагировали, цитоскелетным буфером (CSK), содержащим 0.5% Тритон Х-100, и 100%-ным метанолом, как описано в разделе "Материалы и методы". Данные по совместной визуализации белков GFP-hRadl8 (зеленый сигнал) и PCNA (красный сигнал) (рис. 10, А-В) показывают, что фокальный GFP-hRadl8 колокализуется с фокусами PCNA менее чем в 5% интактных клеток, тогда как через 4 ч после обработки клеток ММС выраженная колокализация белков наблюдается более чем в 80% S-фазных клеток (рис. 10, ср. А и Б). На рис. 10 (Г-Е) показаны конфокальные изображения одних и тех же ядер клеток через 4 ч после обработки ММС (0.01%); совмещенные сигналы PCNA и GFP-hRadl8 (рис. ЮД), только PCNA (рис. ЮГ) и только GFP-hRadl8 (рис. 10Е). Желтая окраска большинства фокусов после совмещения сигналов PCNA и GFP-hRadl8 (рис. ЮД) говорит о высокой степени кол окал изации данных белков. Кроме того, через 4 ч после обработки ММС (0.01%) наблюдалось увеличение уровня интенсивности общей флуоресценции GFP, посчитанной в S-фазных клетках и нормализованной относительно сигнала PCNA (рис. 12, ср. ст. 1 и 3). Итак, белок GFP-hRadl8 в ответ на повреждение ДНК иммобилизуется на каких-то нерастворимых структурах, ассоциированных с заблокированными репликативными вилками, что свидетельствует об индуцируемой повреждениями ДНК транслокации GFP-hRadl8 к сайтам, содержащим заблокированные повреждениями репликативные комплексы. 4.3.4. Стауроспорин ингибирует ММС-яндуцированное накопление и транслокацию hRadl8. Нами было показано, что детектируемое иммуноблоттингом ММС-индуцируемое накопление как тотального, так и неэкстрагируемого Тритоном GFP-hRadl 8, подавляется стауроспорином, который добавляли в ростовую среду за 30 мин до обработки клеток ММС, а также во время последующей инкубации (рис. ПА, верхняя панель). Полное подавление наблюдалось при концентрации стауроспорина 200 нМ и частичное при 20 нМ. Отметим, что стауроспорин и ММС не влияли на уровень экспрессии и экстрагируемость PCNA (рис. ПА, Б, нижние панели).
