Введение к работе
Актуальность проблемы. Актин, один из основных белков сократительного. аппарата мышц, является также одним из основных белков цитоскелета, и его содержание в клетке очень высоко. С актиновыми структурами цитоскелета связано поддержание формы, движение и деление клеток, эндоцитоз, передача медиаторов, свертывание крови, процессы, предшествующие оплодотворению, и многие другие. Предполагается также участие цитоскелета в регуляции активности ионных каналов, в процессах передачи сигнала с рецепторов на геном, в транскрипции и регуляции активности ферментов. Характерной особенностью актиновых структур цитоскелета является их динамичность. В отличие от актиновых нитей стабильного сократительного аппарата скелетных мышц, образующихся однократно, микрофиламенты цитоскелета способны собираться и разбираться в зависимости от физиологического состояния клетки. Динамика микрофиламентов цитоскелета основана на двух фундаментальных свойствах актина: способности к обратимой трансформации из глобулярного состояния (G-актин) в полимер (F-актин) и взаимодействии с многочисленными актин-связывающими белками, которые могут ускорять или ингибировать полимеризацию, фрагментировать актиновые нити или связывать их в пучки и прикреплять к клеточной мембране. Нарушение процессов сборки и разборки актиновых структур приводит к нарушению нормальной жизнедеятельности клетки, в том числе, к ее опухолевой трансформации. В связи с этим изучение полимеризации актина и его взаимодействия с белками, влияющими на полимеризацию, существенно для понимания механизмов, лежащих в основе биологии клетки и ее регуляции.
В разных мышцах и в немышечных клетках актин представлен разными изоформами. Актин таких постоянных сократительных структур, как миофибриллы (а-изоформа), отличается от р- и у-изоактинов, входящих в состав динамичных структур цитоскелета. Кроме того, специфические изоформы актина обнаружены в гладких мышцах, в тканях беспозвоночных животных, в растениях и в одноклеточных организмах. Показано также, что внутри одной клетки разные изоформы актина компартментализованы. Тканеспецифич-ность изоформ и их локализация в определенных частях клетки поднимают вопрос о связи между структурой, функциональными особенностями изоформ актина и свойствами сократительных и цитоскелетных систем, которые они образуют.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение физико-химических и функциональных свойств изоформ актина, коррелирующих со свойствами сократительных систем, в состав которых они входят. В задачи исследования входило: 1) Изучить особенности структуры и полимеризации актинов, выделенных из разных сократительных систем. 2) Выявить структурно-функциональные связи в молекуле актина и локализовать сайты, участвующие в поддержании стабильной структуры полимеров. 3) Исследовать влияние актин-связывающих белков на структуру актина и его способность формировать стабильные полимеры. 4) Сопостапить структурно-функциональные особенности изоформ актина со свойствами тех структур клетки, в состав которых они входят.
Научная новизна. Впервые обнаружены различия в свойствах актинов, выделенных на разных стадиях формирования сократительного аппарата. Показано, что стабильность полимеров, образованных разными изоформами актина, коррелирует со стабильностью или динамичностью соответствующих микро-филаментных структур. Впервые показано, что причиной меньшей стабильности немышечной изоформы актина может быть более открытая конформация нуклеотидной щели, что, по-видимому, является результатом менее эффективных структурных перестроек в мономере актина при его включении в полимер.
Открыт новый фермент - бактериальная протеиназа ЕСР32, специфически расщепляющая полипептидную цепь актина между Gly42 и Val43. Это точечное повреждение полипептидной цепи приводит к полной потере способности актина к полимеризации и ингибированию активности ДНКазы I. Эти данные впервые продемонстрировали, что стабильность полимеров актина критически зависит от конформации N-концевой части ДНКазной петли в субдомене 2 молекулы актина. Показано, что полимеризуемость расщепленного актина восстанавливается при замещении прочно связанного иона Са на ион Мд и при взаимодействии с субфрагментом 1 миозина, что является прямым экспериментальным доказательством активации мономеров актина в этих условиях. Кроме того, нами впервые показано, что взаимодействие с гельзолином, ускоряющим стадию нуклеазции в процессе полимеризации актина, вызывает конформационные изменения в сайтах актин-актиновых контактов, способствующие стабилизации зародышей полимеризации. Локализованы участки молекулы актина, которые участвуют в распространении вызванных гельзолином конформационных изменений вдоль нити актина.
Полученные результаты впервые позволили объяснить физиологический смысл существования разных изоформ актина. Предложена модель сборки актиновых микрофиламентов в миофибриллах и цитоскелете, основанная на адаптивном характере различий между изоформами актина и аллостерической регуляции структурных перестроек, стабилизирующих полимер. Согласно предложенной модели, способность мышечной а-изоформы актина коррелирует со стабильностью филамёнтов в миофибриллах. Динамика цитоскелета обеспечивается сочетанием нестабильности полимеров, образованных цитоскелетными р- и у-изоактинами, с возможностью стабилизировать полимеры с помощью актин-связывающих белков.
Научно-практическая значимость. Обнаружен и охарактеризован новый штамм бактерий Escherichia coli А2 - продуцент нового фермента, протеиназы ЕСР32, обладающей высокой субстратной специфичностью (авторское свидетельство N 1390241). Протеаза ЕСР32 расщепляет актин в уникальном сайте, который участвует в контактах между субъединицами актина в полимере. Этот сайт не расщепляется другими протеазами, а расщепление протеазой ЕСР32 качественно изменяет свойства актина. Поэтому протеаза ЕСР32 успешно используется для изучения структуры и функций актина в Университете штата Миннесота (Миннеаполис, США), в Институте экспериментальной биологии им. Ненцкого (Варшава, Польша), в Университете г.Билефельд (Германия), в Иерусалимском университете (Израиль). Кроме того, новый фермент может быть использован для изучения структуры белков теплового шока и гистонов. Разработанные в ходе настоящего исследования методы выделения актина и а-актинина из мышц моллюсков могут быть использованы для выделения этих белков из других источников. В частности, метод очистки актина с помощью трипсиновой обработки был успешно применен для выделения актина из гладкой мышцы желудка цыпленка с целью получения поликлональных антител к этому актину (Лаб.им.А.Н. Белозерского, МГУ). Разработанный при участии автора флуоресцентный метод определения количества инактивированного актина в его препаратах применяется для оценки нативности всех исследуемых препаратов актина.
Место проведения работы. Работа проводилась в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН (зав. отделом д.б.н.,
профессор Г.П.Пинаев) и частично- в Институте экспериментальной биологии им. Ненцкого ПАН (Варшава, Польша) и в Университете г.Билефельд (Германия). Основные результаты работы получены автором лично и в сооавторстве с проф. Г.П.Пинаевым и сотрудниками Института цитологии РАН - Т.Д.Смирновой, В.В. Матвеевым, К.К. Туроверовым, И. М. Кузнецовой, А. М. Морозовой и О. А. Антроповой, с A.M. Усмановой (Казанский университет), с сотрудниками лаборатории проф. Х.Стржелецкой-Голашевской (Варшава, Польша) и с проф. Х.Хинссеном (.Билефельд, Германия) Определение N-концевых аминокислотных последовательностей протеазы ЕСР32 и фрагментов молекулы актина проведено в лаборатории проф. Д.Коллинза (Университет штата Мэриленд, Балтимор, США). Масс-спектрометрический анализ фрагментов актина, расщепленного протеазой ЕСР32, выполнен д.б.н. О.А.Миргородской (Институт цитологии РАН) совместно с доктором В.Тиде в Центре молекулярной медицины Макса Дельбрюка (Берлин-Бух, Германия).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II, III, IV, V, VI, VII и VIII Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышц (Ереван, 1971; Тбилиси, 1974; Киев, 1977; Львов, 1980; Тбилиси, 1983; Пущино, 1987; Тбилиси, 1990), на Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1972; Телави, 1985), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на I, II, IV и V Всесоюзных школах по биологической подвижности (Ленинград, 1976; Репино, 1979; Лосево, 1985, 1989), на XVI Конгрессе FEBS (Москва, 1984), на международной конференции «Механизмы адаптации мышц» (Сегед, Венгрия, 1986), на международной конференции «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989), на XX, XXIII, XXIV и XXV Европейских мышечных конгрессах (Оксфорд, Англия, 1991; Бохум, Германия, 1994; Флоренция, Италия, 1995; Монпелье, Франция, 1996); на международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 1994), на конференции «Молекулярные взаимодействия актина» (Гавайи, США, 1997).
Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме научного доклада на 40 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 12 рисунков. Материалы диссертации отражены в 34 статьях в отечественных и международных журналах, в том числе в четырех обзорах.
