Введение к работе
Актуальность научного исследования
Система внутриклеточного транспорта, объединяющая взаимосвязанные процессы экзо- и эндоцитоза, обеспечивает одну из важнейших функций клетки – взаимодействие с окружающей средой, поэтому анализ собственно цитологических механизмов ее реализации и, как следствие, поиск возможных способов воздействия является актуальной проблемой цитологии, молекулярной и клеточной биологии. Ключевым участником внутриклеточного транспорта является комплекс Гольджи (КГ) – мембранная органелла, осуществляющая посттрансляционную модификацию белков и липидов, сортировку молекул, их концентрирование, упаковку и отправку к месту назначения.
Через КГ транспортируется большое количество различных молекул, встраивающихся в структуры тканей и органов и определяющих, в том числе, их функциональную микроанатомию. Так, строение большинства органов зависит от секреции коллагена и ряда внеклеточных белков, включая белки базальной мембраны. Синтез и секреция антител, транспортируемых через КГ, влияет на особенности строения лимфоидных органов и функционирование иммунной системы в целом. Образование синаптических везикул с последующей их доставкой в аксоны и образованием синапсов, во многом определяет микроанатомическую организацию мозга и других органов нервной системы. Наконец, образование новых сосудов (васкуло- и ангиогенез) также во многом зависит от функции КГ в эндотелиальных клетках, так как для формирования почек роста сосудов требуется доставка на плазматическую мембрану (ПМ) рецепторов факторов роста, что происходит при обязательном участии органеллы.
Поэтому изучение механизмов перемещения веществ через КГ открывает новые перспективы в медицине, сельском хозяйстве и других областях: дает возможность начать целенаправленный поиск лекарственных препаратов для лечения заболеваний, в основе которых лежат нарушения модификации и транспорта белков (Миронов А. А., 1998; Банин В. В., 1999) и моделировать тест-системы для их оценки; позволяет разрабатывать новые методы борьбы с возбудителями заболеваний человека и животных, способы стимуляции роста и созревания плодов, защиты растений от неблагоприятных факторов среды (Uknes S. et al., 1992); поможет понять механизмы строительства органов и их систем из клеток и внеклеточного матрикса.
Структура КГ традиционно представляется в виде диктиосомы – стопки уплощенных цистерн или мешочков и ассоциированных с ней мелких везикул и секреторных гранул (Griffiths G., 2000). В клетках человека и многоклеточных животных организация КГ достаточно хорошо изучена (Ladinsky M. еt al., 1999, 2002; Trucco A. et al., 2004). В клетках растений так же, как и животных, КГ описывается в виде диктиосомы. Однако эволюционные группы, давшие начало современным растительным и животным организмам, рано обособились в процессе эволюции и имеют свои существенные характеристики генома, что может определять особенности строения органеллы.
Несмотря на то, что наличие диктиосомы КГ признается одной из характеристик эукариотических клеток (Dacks J. et al., 2007), существуют организмы, среди которых немало известных паразитических видов, в клетках которых мембраны с функциями КГ не формируют диктиосому (Mowbrey K. et al., 2009). Понимание причин вариаций морфологии КГ и их связи с особенностями секреции в клетках таких организмов может быть полезным в решении ряда спорных вопросов о механизмах транспорта через органеллу.
КГ, несмотря на его кажущуюся морфологическую простоту, является сложной в функциональном отношении поляризованной органеллой. В ее «работе» органически сочетаются антероградное перемещение молекул, предназначенных для секреции или экспрессии на клеточной поверхности, и ретроградный возврат собственных, резидентных белков, включая ферменты, в соответствующий компартмент. Выделено и охарактеризовано большое количество молекул, участвующих в этих процессах, все более понятной становится их конкретное участие в регуляции функций органеллы. Однако идентификация всех белков-участников не решила главный вопрос: как происходит процесс перемещения белков и липидов через чрезвычайно сложно устроенный КГ.
Именно поэтому при обилии огромного фактического материала не кажется парадоксальным отсутствие согласованного мнения о конкретных цитологических механизмах, обеспечивающих перенос молекул между компартментами КГ и тех мембранных преобразованиях, которые и определяют, собственно, эти механизмы. Причина нам видится в том, что в течение многих лет обсуждались, в основном, две модели транспорта через органеллу: «везикулярная» и модель так называемого «созревания и прогрессии»
цистерн (мешочков) КГ. Другие модели внутриклеточного транспорта практически не рассматривались.
В соответствии с очень популярной «везикулярной» моделью, которая была предложена Дж. Паладе (Palade G., 1975; Farquhar M., Palade G., 1981), но наиболее полно разработана Дж. Ротманом (Rothman G. et al., 1984; Rothman G., 1994), молекулы карго (модифицируемого продукта) перемещаются от цистерны к цистерне в мелких (50–60 нм) транспортных везикулах. С позиции этой модели сложно объяснить отсутствие в везикулах целого
ряда известных белков, например альбумина, проинсулина, вирусных белков и некоторых других, а также понять, как транспортируются молекулы, имеющие большие размеры, чем размеры везикулы, например проколлаген I в фибробластах (Leblond C., 1989) или липопротеиновые агрегаты в гепатоцитах и энтероцитах (Claude A., 1970; Sabesin S., 1977). Исследования последних лет выявили новые факты, которые также не могут быть объяснены «везикулярной» моделью транспорта. В частности, было доказано, что агрегаты проколлагена I длиной 300 нм и необыкновенной резистентностью к изгибам транспортируются через КГ (Bonfanti L. et al., 1998) с той же скоростью, что и мембранные белки (Mironov A. et al., 2001).
В классическом варианте модели «созревания и прогрессии» цистерн транспортируемый белок, оставаясь в составе цистерн, постепенно передвигается от проксимального цис-полюса КГ к дистальному транс-полюсу органеллы. Такая прогрессия должна сопровождаться возвратом ферментов и других резидентных белков КГ, который, как предполагается, осуществляется везикулами, имеющими СОРI-покрытие (Bannyhk S., 1997; Mironov A. еt al., 1997; Glick B., 1998). Однако в везикулах, ассоциированных с диктиосомой (стопкой мешочков), не было выявлено повышенной концентрации ферментов гликозилирования, а также трансмембранных переносчиков моносахаров, химически связанных с нуклеотидами (Orci L. et al., 2000; Kweon H. et al., 2004; Fusella A. et al., 2013).
В последние годы появились доказательства существования непрерывных тубулярных сообщений между цистернами КГ, вследствие чего было высказано предположение о перемещении некоторых транспортируемых белков по этим связям (Marsh B. et al., 2004; Trucco A. et al., 2004). Было предложено сразу несколько новых моделей, одной из которых стала «диффузионная» модель (Patterson G. et al., 2008). Однако и она не объяснила существующие противоречия. Так, например, если для карго, имеющего небольшие размеры и обладающего способностью к диффузии (например, альбумина), существует возможность перемещения по тубулярным сообщениям, то для больших молекул (проколлаген) такой путь невозможен – диаметр трубочек слишком мал для этого. Кроме того, при рассмотрении постоянных тубулярных коммуникаций как основного транспортного пути трудно понять механизм концентрирования растворимых и мембранных белков-карго по мере их продвижения через стопку и поддержания вдоль секреторного пути концентрационных и других градиентов (Mironov A. et al., 2012).
В настоящее время начала активно обсуждаться модель, в которой в качестве базового используется механизм «слияния и последующего разделения» мембран, получившей название «kiss-and-run» модели (Mironov A. et al., 2008, 2012). Она предполагает, что транспорт растворимых секретируемых белков и мембран через КГ осуществляется с участием тубулярных сообщений, которые временно формируются между компартментами КГ. Образование таких связей может ингибироваться 50–60 нм везикулами, имеющими СОРI-покрытие (Fusella A. et al., 2013). Крупные агрегаты белков, которые не могут диффундировать по тонким тубулярным сообщениям между цистернами, видимо, транспортируются согласно асимметричной версии модели «слияния и последующего разделения» компартментов. Эта модель предполагает, что слияние происходит на лидирующей стороне переносчика, содержащего агрегаты белков, а разделение осуществляется на участке, расположенном непосредственно за транспортером (Mironov А. et al., 2012).
Необходимым условием существования данной модели является наличие временных мембранных сообщений между компартментами секреторного пути. Кроме того, должны существовать механизмы концентрации транспортируемых белков по ходу их передвижения через КГ, а также белков SNARE в местах слияния мембран и разделения мембранных соединений. При этом основным противоречием (скорее, камнем преткновения) всех обсуждаемых моделей стало определение роли СОРI-зависимых 50–60 нм пузырьков, транспортные функции которых сторонники классических теорий продолжают доказывать.
В решении спорных вопросов, по нашему мнению, помогут новые морфологические подходы в изучении клетки, одним из которых является сравнительная микроанатомия, а также современные методы трехмерной реконструкции клеток и органелл.
Обсуждаемые в настоящее время модели секреторного транспорта в большинстве своем разрабатываются и тестируются на клетках млекопитающих. Однако при использовании в качестве модельных объектов клеток других организмов (растений, паразитических простейших и др.) полученные экспериментальные данные плохо согласуются с предложенными гипотезами. Между тем, учитывая филогенетические исследования последних лет (Klute M. et al., 2011), представляется маловероятным формирование у эукариот разных механизмов транспорта через КГ. Поэтому если предположить возможность существования некоторого общего механизма транспорта через органеллу во всех клетках, то потребуется верификация обсуждаемых моделей и доказательства универсальности для КГ всех известных эукариот.
Следовательно, для решения спорных вопросов и поиска морфологических доказательств в пользу одной из обсуждаемых моделей транспорта мы сравниваем структуру КГ клеток человека и ряда модельных объектов –типичных представителей систематических групп эукариот со «стопочной» организацией КГ: представителей Высших растений (Embryophyta) и Настоящих животных (Metazoa), тела которых формируются специализированными клетками, имеющими сложную многоступенчатую систему посттрансляционной модификации белков, обеспечивающуюся в том числе и общими классами гликозилтрансфераз (Munro S., 2002; Reiter W., 2002). Для возможности сравнения было важно учесть, насколько изучены те или иные организмы. Поэтому мы взяли представителей с мало известным строением КГ (для доказательства/опровержения существования тех же закономерностей), но из систематических групп, где в какой-то мере уже был проведен анализ строения органеллы (тип Черви, Членистоногие, класс Рыбы, Насекомые). КГ других взятых нами объектов практически не исследован.
КГ в клетках растений, несмотря на стопочную структуру, имеет существенные особенности организации. Поэтому остается непонятной возможность экстраполяции механизмов секреторного транспорта, разработанных на клетках животных, на секреторный путь растительных организмов, имеющих значительные, по сравнению с животными, различия генома.
Кроме того, мы проанализировали строение КГ в клетках, не имеющих «классической» стопки органеллы, обладающих более простой структурой секреторных белков и ограниченным количеством ферментов гликозилирования (Munro S. et al., 1995), и также хорошо известным геномом. Мы учитывали доступность материала для электронно-микроскопического изучения.
Таким образом, несмотря на большое количество работ, изучающих секреторный транспорт, не сформировалось единого мнения о механизмах перемещения белков (карго) через КГ. Поэтому сравнительно-морфологический анализ, включающий комплекс электронно-микроскопических (ЭМ) методов, в том числе ЭМ-томографию и сканирующую электронную микроскопию с использованием детектора обратно рассеянных электронов и внутреннего ультратома, вмонтированного в камеру микроскопа (один из современных методов микроанатомии), представляется достаточно эффективным для обоснования (или отрицания) той модели внутриклеточного транспорта, которая наиболее полно объясняет имеющиеся экспериментальные факты.
Цель исследования – сравнительный анализ структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот для обоснования наиболее адекватной модели внутриклеточного транспорта.
Задачи исследования
-
Выявить и обобщить на основании комплексного морфологического исследования, включающего микроанатомический анализ, особенности строения разных морфологических форм комплекса Гольджи в клетках модельных объектов: а) фибробластов человека и животных основных систематических групп; б) меристематических клетках корня гороха; в) дрожжах Saccharomyces cerevisiae; г) микроспоридиях.
-
Найти морфологические обоснования для одной из моделей внутриклеточного транспорта через комплекс Гольджи:
а) выявить в модельных объектах и охарактеризовать тубулярные сообщения компартментов секреторного пути;
б) проанализировать распределение и возможную роль COPI-зависимых везикул в структуре комплекса Гольджи клеток эукариот.
-
Проанализировать возможность существования в клетках человека и эукариот разных систематических групп общего принципа организации транспорта белков через комплекс Гольджи:
а) провести сравнительный анализ организации комплекса Гольджи растительных и животных клеток с использованием информационных показателей;
б) проанализировать зависимость структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот от систематического положения организма и комплекса молекулярных механизмов, принимающих участие в функционировании органеллы.
-
При использовании результатов сравнительно-морфологического анализа обосновать наиболее вероятную модель транспорта белков через комплекс Гольджи в клетках эукариот.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Основные мембранные компоненты комплекса Гольджи: цистерны (мешочки), тубулы (трубки) и везикулы (сферы) – формируют дискретные функциональные единицы органеллы, которые могут быть связаны в единую мембранную структуру.
-
Тубулярные сообщения между компартментами секреторного пути присутствуют во всех модельных объектах и носят непостоянный характер, что соответствует представлениям об организации транспорта через комплекс Гольджи на основании механизма «слияния и последующего разделения» компартментов.
-
СОРI-зависимые мелкие везикулы не являются обязательным компонентом комплекса Гольджи, что исключает их ведущую роль в качестве основного транспортного переносчика.
-
Разработаны морфологические критерии для оценки строения комплекса Гольджи и впервые предложена классификация его фенотипических форм. Доказано, что в клетках эукариот существуют три основных фенотипических формы органеллы: стопочная; с преобладанием единичных мешочков и тубулярная. Каждая из указанных форм может характеризоваться разной выраженностью везикулярного компонента и иметь дискретный или централизованный тип расположения мембранных структур.
-
Строение комплекса Гольджи не зависит от систематического положения организма. Комплекс Гольджи формировался в клетках каждой
систематической группы эукариот на основе единых, эволюционно старых молекулярных механизмов, ведущих свое происхождение от последнего единого предка эукариот. -
Морфологические и информационные показатели подтверждают универсальный план строения и принципы функционирования комплекса Гольджи в клетках человека, животных (фибробласты) и растений (клетки меристемы).
-
Полученные в работе данные подтверждают существование общего принципа организации транспорта белков через комплекс Гольджи в клетках эукариот, который наиболее полно описывается моделью «слияния и последующего разделения» компартментов.
Научная новизна исследования
-
Впервые новые, современные методы электронно-микроскопического анализа, включая трехмерную реконструкцию на основе ЭМ-томографии, адаптированы для сравнительно-микроанатомического анализа структуры комплекса Гольджи. Данный подход впервые используется как способ обоснования модели секреторного транспорта в клетках эукариот.
-
Впервые доказано существование тубулярных соединений между цистернами комплекса Гольджи, как морфологического субстрата модели «слияния и последующего разделения» мембран не только в клетках млекопитающих, но и организмов, находящихся на разных ступенях эволюционной лестницы.
-
Впервые дана детальная количественная характеристика комплекса Гольджи у представителей типов Mollusca (моллюски), Annelida (черви), классов Pisces (рыбы), Amphibia (земноводные), Aves (птицы).
-
Впервые сравнительно небольшая роль везикул как переносчиков белков и липидов продемонстрирована в разных систематических группах эукариот. Показано отсутствие «мегавезикул» не только в культуре ткани, но и в клетках in situ, в частности, в комплексе Гольджи фибробластов сухожилий новорожденных крыс, транспортирующем агрегаты проколлагена I.
-
На основании ряда существенных признаков: локализации органеллы в клетке и степени связности функциональных единиц; состава и выраженности основных структурных компонентов – впервые выявлены и обоснованы фенотипические формы строения комплекса Гольджи, которые отражают особенности строения органеллы в клетках эукариот разных систематических групп.
-
Предложена оригинальная морфологическая классификация комплекса Гольджи, способствующая пониманию закономерностей строения и механизмов транспорта через органеллу в клетках представителей разных систематических групп эукариот.
-
На примере комплекса Гольджи некоторых клеток человека, животных и растений впервые использован структурно-информационный анализ в качестве метода сравнительной оценки динамичных клеточных систем, который продемонстрировал универсальность плана строения и единые принципы функционирования органеллы в различных организмах.
-
Оригинальным является анализ распространенности разных фенотипических форм и типов строения комплекса Гольджи и причин их формирования среди систематических групп эукариот на основе предложенной классификации.
-
Впервые получены прямые доказательства того, что в микроспоридиях транспорт через комплекс Гольджи осуществляется посредством механизма «слияние – разъединение («разрыв») мембран.
-
Разработана новая оригинальная гипотеза раннего эволюционного происхождения комплекса Гольджи в клетках эукариот на базе мембранных соединений между предшественником эндоплазматического ретикулюма и плазматической мембраной с участием и ведущей ролью прото-коатомера.
Практическая значимость научного исследования
Полученные результаты:
-
расширяют представление о биологии клеток изученных организмов;
-
способствуют пониманию закономерностей строения комплекса Гольджи в клетках эукариот разных систематических групп;
-
доказывают универсальность организации комплекса Гольджи в клетках эукариот, что позволяет конструировать и тестировать единую модель секреторного транспорта, применимую к клеткам с разными фенотипическими формами строения органеллы;
-
могут использоваться для создания экспериментальных систем для тестирования лекарственных средств; средств воздействия на растения; борьбы с возбудителями болезней животных и другие;
-
способствуют пониманию клеточных механизмов ряда заболеваний, в том числе опухолевого роста, что необходимо для создания эффективных методов лечения, а также оценки возможных и наблюдаемых эффектов применения лекарственных средств;
-
способствуют решению ключевых вопросов филогении клетки.
Примененные в работе методические подходы, в том числе микроанатомический анализ, составляют новое направление в клеточной биологии и могут быть использованы для дальнейшего изучения морфологической организации транспортных путей эукариотических клеток.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах биологии и экологии и гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Ивановская медицинская академия» Минздрава России; экологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Шуйский государственный университет»; экологии и зоологии Мелитопольского государственного педагогического университета им. Б. Хмельницкого; ботаники и зоологии ГБОУ ВПО «Ивановский государственный университет»; паразитологии имени академика РАСХН Ю.Ф. Петрова и селекции, ботаники и экологии ФГБОУ ВПО «Ивановская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д. К. Беляева»; ботаники и экологии растений, экологии и зоологии ФГБОУ ВПО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»; кафедре экологии ФГБОУ ВПО «Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых».
Личный вклад автора
Автор принимал самое активное участие в определении направления исследований, выборе темы, постановке цели, определении задач, в разработке новых методических и экспериментальных подходов, проведении научного поиска, обработке, анализе и интерпретации результатов. Некоторые наблюдения и их интерпретация были осуществлены совместно с другими исследователями, что подробно указано в тексте работы и документировано совместными публикациями. В частности, образцы микроспоридий были подготовлены с участием канд. биол. наук Е. В. Селиверстовой и канд. биол. наук В. В. Долгих. Подготовка и съемка части образцов осуществлена с помощью д-ра мед. наук Г. В. Безнусенко в НИИ Марио Негри Суд (Италия) и в Ивановском НИИ материнства и детства им. В. Н. Городкова с участием д-ра мед. наук, профессора Л. П. Перетятко.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации были представлены в 23 докладах на конференциях и конгрессах, в том числе: на V Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); на II Съезде лимфологов России (Санкт-Петербург, 2005); на Международном конгрессе по световой и электронной микроскопии (Давос, Швейцария, 2005); на VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006); на 5-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения» (Орел, 2006); на научной конференции «XXII Любищевские чтения» (Ульяновск, 2008); на X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); на Международной научной конференции, посвященной 65-летию ивановской школы лимфологов (Иваново, 2009); на I Международной научно-практической конференции «Наука и современность 2010» (Новосибирск, 2010); на IV Съезде Ассоциации лимфологов России с международным участием (Москва, 2011); на XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012); на IX Международной научной конференции «Наука и образование» (Прага, Польша, 2013).
Публикации
По результатам выполненных исследований опубликовано 43 научных и приравненных к ним работ, из которых 18 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ и 8 включены в международные информационные базы данных PubMed.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав результатов собственных исследований с иллюстрациями, заключения, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 53 комбинированными рисунками. Библиография включает 368 источников.
Благодарность
Выражаю персональную благодарность научным консультантам А. А. Миронову, В. В. Банину, а так же Г. В. Безнусенко, В. В. Долгих, Е. В. Селиверстовой, Л. П. Перетятко, и другим ученым, помогавшим в проведении исследований (подробнее см. текст диссертации).
