Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что костный мозг может поставлять циркулирующие костномозговые предшественники, участвующие в репарации сосудистой стенки. В экспериментах на животных показано, что такие клетки участвуют в новообразовании интимы магистральных артерий при экспериментальной аллотрансплантации органов, после механического повреждения сосудов и при гиперлипидемически индуцированном атеросклерозе [Sata etal., 2000].
Экспериментальные доказательства участия клеток костного мозга в репарации сосудов после повреждения ранее были получены и в нашей лаборатории. Иммуноцитохимические и авторадиографические исследования кинетики пролиферации клеток, участвующих в репарации сонной артерии крысы после повреждения показало, что они имеют скорее гематогенное, чем местное происхождение [Ильинская и соавт., 2003]. Нами также были приведены доказательства костномозгового происхождения клеток, участвующих в образовании неоинтимы после баллонной ангиопластики сонных артерий химерных крыс, с маркированными по Y-хромосоме клетками костного мозга. При этом было показано, что в области репарации артерии значительную долю (38%) составляли клетки, несущие маркер донорских клеток - Y-хромосому, что свидетельствовало о костномозговом происхождении этих клеток [Ильинская и соавт., 2008; Тарарак и соавт., 2008].
В связи с тем, что за последние 10-15 лет методология переноса генов в клетки млекопитающих получила значительное развитие, в настоящее время активно разрабатываются подходы к генной терапии различных заболеваний. Основной ее принцип заключается во введении в клетки организма необходимых генов, оказывающих определенное терапевтическое воздействие, или, напротив, в выключении экспрессии генов, способствующих развитию патологического процесса. Значительные успехи уже были достигнуты в экспериментах по переносу генов в клетки экспериментальных животных для коррекции миодистрофии Дюшенна [Li et al., 2005], муковисцидоза легких [Copreni et al., 2004], повреждения периферических нервов [Tannemaat et al., 2008]. Также были проведены первые клинические исследования по генотерапии наследственных заболеваний крови [Cavazzana-Calvo et al., 2002; Muul et al., 2003].
Особое место среди других систем трансгенного переноса занимают лентивирусные системы, ввиду их уникальной способности доставлять гены в неделящиеся клетки млекопитающих [Curran М.А. et al, 2000], в том числе и в стволовые [Tahara-Hanaoka S et al., 2002, Horn PA. et al. 2004, Geraerts M et al, 2006, Liang M, 2009]. Это их свойство особенно важно для переноса генов в примитивные стволовые клетки костного мозга, так как основная масса последних находится вне клеточного цикла, а мобилизация в цикл существенно сказывается на пролиферативном потенциале и судьбе стволовых клеток после их трансплантации in vivo [Traycoff СМ. et al., 1998]. Исследования на
животных показали, что векторы на основе H1V-1 могут использоваться для введения генетического материала в в терминально дифференцированные и стволовые нейральные клетки [Geraerts et al., 2006; Torashima et al., 2006; Naldini et al., 1996], гепатоциты [Oertel et al., 2003; Tang et al., 2006], мышечные клетки [Kafii et al., 1997], и гемопоэтические стволовые клетки [Tahara-Hanaoka et al., 2002; Horn et al. 2004] с полным сохранением всех функций и свойств этих клеток. Также in vitro успешно подвергались трансдукции практически все типы человеческих клеток, в том числе: CD34+ клетки из периферической и пуповинной крови [Miyoshi et al., 1999, Chinnasamy et al., 2004, Horn et al. 2004, Liang et al., 2009], эмбриональные стволовые клетки [Gropp M. et al., 2006]. Ho если эффективность трансдукции CD34+ клеток, циркулирующих в периферической крови достаточно высока, то при трансдукции субпопуляций костномозговых клеток, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками (Lin'c-kit+ или Lin*c-kit+Sca-l+) редко удается зафиксировать значительное количество флуоресцирующих клеток in vitro и еще меньше среди их потомков после трансплантации in vivo [Chen et al., 2000].
Поэтому, на сегодняшний день весьма актуальной становится задача разработки эффективного метода доставки генов научного и терапевтического интереса в клетки костного мозга, с последующей их стабильной экспрессией в клетках-«мишенях».
Данное исследование явилось начальным этапом разработки методов переноса генов в костномозговые клетки. В дальнейшем, маркирование костномозговых клеток флуоресцентной меткой, с одной стороны, позволит проследить и охарактеризовать их возможное участие в процессах репарации и патологической перестройки стенки кровеносных сосудов. С другой, - доставка в эти клетки генов терапевтического интереса может быть использована для разработки подходов к генотерапии окклюзивных заболеваний сосудов.
Цель исследования
Изучить эффективность лентивирусной трансдукции популяций клеток костного мозга мыши, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками ex vivo. Оценить длительность экспрессии введенного трансгена in vitro и ex vivo.
Задачи исследования
Сравнить способность лентивекторов, сконструированных на основе вирусов иммунодефицита кошки (FIV) или человека (HIV), а также HIV-векторов, в которых экспрессия трансгена обеспечивается разными промоторами, эффективно трансдуцировать клетки костного мозга. Провести трансдукцию субпопуляций клеток костного мозга мыши с фенотипами Linc-kit+, Lin"c-kit+Sca-l+ и CD105+Sca-1+ с помощью лентивирусных векторов, содержащих в качестве репортерных гены зеленого (copGFP) или красного (dsRed) флуоресцентных белков.
Оценить стабильность экспрессии и интенсивность флуоресценции репортерных генов на клетках культуры фибробластов мыши линии NIH/3T3 после их трансдукции лентивирусными HIV-векторами.
In vivo методом селезеночных колоний оценить эффективность трансдукции колониеобразующих единиц селезенки, присутствующих в субпопуляции клеток с фенотипом Lin"c-kit+. Провести морфологический и иммуноцитохимический анализ клеток селезеночных колоний.
Получить радиационных костномозговых химерных мышей путем замещения костного мозга самок на трансдуцированные in vitro костномозговые клетки самца. В разные сроки после восстановления кроветворения выявить наличие трансдуцированных клеток в костном мозге и периферической крови химерных животных методом ПЦР и цитофлуориметрии в потоке. Провести иммуноцитохимический анализ клеток костного мозга химер.
Научная новизна и практическая значимость работы
В работе продемонстрировано преимущество использования для трансдукции клеток костного мозга векторов, полученных на основе лентивируса HIV-1, а не FIV. При этом лучшую экспрессию трансгена в клетках-«мишенях» обеспечивает промотор вируса стволовых клеток мыши, по сравнению с промотором ранних генов цитомегаловируса человека, который наиболее часто используется в генетических конструкциях для контроля экспрессии трансгена при переносе генов в стволовые и прогениторные клетки. В работе также была показана стабильность экспрессии трансгенов, введенных в клетки с помощью лентивирусных HIV-векторов, в течение 3-х месяцев культивирования. Впервые в опытах ex vivo методом селезеночных колоний обнаружено, что лентивирусные HIV-векторы способны с высокой эффективностью транедуцировать КОЕ-с и в составе генома передаваться их потомкам. При этом показано отсутствие выраженного негативного влияния использованных векторов на процесс гемопоэза в колониях. Также в работе впервые было продемонстрировано, что лентивирусные HIV-векторы способны транедуцировать ex vivo клетки-предшественники костного мозга, находящиеся на разных ступенях иерархии гемопоэтических клеток, в том числе и стволовые. При этом процесс трансдукции не влияет на потенциал гемопоэтических стволовых клеток репопулировать костный мозг и кровь летально облученных животных. Также впервые было показано, что трансген, доставленный в клетки костного мозга с помощью HIV-вектора, сохраняется в геноме клеток-«мишеней» как минимум в течение одного года.
Таким образом, полученные в работе результаты существенно дополняют имеющиеся в современной литературе данные по переносу генов в стволовые и прогениторные клетки костного мозга с помощью векторов, полученных на основе лентивирусов.
Разработанная при выполнении настоящей работы технология переноса генов, в дальнейшем, позволит получить новые данные, которые будут способствовать уточнению этапов мобилизации костномозговых клеток-предшественников элементов сосудистой стенки, их миграции через кровь и инвазии в область репарации. При дальнейшем изучении эти этапы наряду с исследованием пролиферации и дифференцировки низкодифференцированных клеток в зрелые элементы очагов гиперплазии сосудистой стенки могут стать
важными точками приложения стратегии генной и клеточной терапии при лечении стенозирующих заболеваний артерий.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были доложены на конференциях: XIV International Symposium on Atherosclerosis (Rome, 2006), 46th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology (San Diego, CA, 2006), 76th European Atherosclerosis Society Congress (Helsinki, 2007), 7-th Internationmal congress on coronary artery disease (Venice, 2007), Российском национальном конгрессе кардиологов. Конгрессе кардиологов стран СНГ (Москва, 2007), V конференции молодых ученых России: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007), на межлабораторном семинаре в Институте экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ РФ и были рекомендованы к защите. Материалы диссертационной работы отражены в 11 публикациях: 3 статьи и 8 публикаций в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из 6 разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список использованных источников". Работа проиллюстрирована 18 рисунками, 11 таблицами, список использованной литературы включает 218 источников.
