Содержание к диссертации
Введение
5 Обзор литературы 9
5.1 Мезоглея и мезоглеальные клетки кишечнополостных 9
5.2 Зародышевые листки кишечнополостных 15
6 Материалы и методы 26
6.1 Сбор материала 26
6.2 Выделение РНК 26
6.3 Дифференциальный дисплей (ДД) 27
6.4 Выделение тотальной ДНК A. aurita 28
6.5 ПЦР на тотальной ДНК A. aurita 28
6.6 Обратнотранскриптазная ПЦР (ОТПЦР) 29
6.7 Флюоресцентная гибридизация in situ ЗО
6.8 Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле 32
6.9 Получение антител против рА47 33
6.10 Иммуноблот (Вестерн болот) 33
6.11 Иммуноцитохимия 33
6.12 Кислый-мочевинный электрофорез 34
6.13 Приготовление проб мезоглеина для MALDI и белкового секвенирования по Эдману 34
6.14 Клонирование мРНК мезоглеина 35
6.14.1 3' Rapid Amplification of cDNA Ends (З'ІІАСЕПЦР) . 35
6.14.2 б'ЯАСЕПЦР 36
6.15 Анализ экспрессии мезоглеина в эпидермисе, мезоглее и гастродерме методом ОТПЦР 37
6.16 Программное обеспечение 38
7 Результаты. 39
7.1 Поиск генов, дифференциально экспрессирующихся в мезоглее методом Дифференциального Дисплея 39
7.2 Выявление мажорного белка мезоглеи 45
7.3 Заряд мезоглеина и условия его экстракции из мезоглеи. 49
7.4 Молекулярное клонирование мРНК мезоглеина. 51
7.5 ОТПЦР мРНК мезоглеина 54
8 Обсуждение. 56
9 Выводы 60
10 Список литературы 61
- Мезоглея и мезоглеальные клетки кишечнополостных
- Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле
- Приготовление проб мезоглеина для MALDI и белкового секвенирования по Эдману
- Поиск генов, дифференциально экспрессирующихся в мезоглее методом Дифференциального Дисплея
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Внеклеточный матрикс (ВКМ) имеется у всех многоклеточных животных и может составлять значительную часть объема их тканей (Ал-бертс и др., 1994). ВКМ активно участвует в регуляции множества процессов, происходящих в организме, начиная с самых первых шагов эмбрионального развития. Он определяет форму контактирующих с ним клеток, их миграцию, пролиферацию, дифференцировку. В защитных реакциях простых в эволюционном отношении организмов ВКМ и клетки, его синтезирующие, играют ключевую роль. Молекулярный состав ВКМ сложен и активно изучается. Основная масса исследований, посвященных ВКМ, проводится на позвоночных животных, преимущественно млекопитающих, традиционных объектах лабораторных исследований. Результаты исследований ВКМ позвоночных непосредственно используются в медицине для создания новых способов лечения ран, лечебной косметики и т.д..
Одна из сложностей в изучении взаимодействий клеток и ВКМ у млекопитающих состоит в разнообразии клеточного состава их тканей. Взаимодействия клеток с ВКМ трудно отличить от взаимодействий между клетками различных типов. Кишечнополостные могут быть хорошей моделью для изучения взаимодействия клеток и ВКМ, т.к. они относительно просты по строению и клеточному составу.
В последнее время клонировано значительное количество консервативных генов различных видов животных из класса Кишечнополостных. На основании анализа их последовательностей исследователи приходят к выводу, что гены, отвечающие за регуляцию экспрессии, контроль трансляции, проведение внутриклеточных сигналов, апоптоз, передачу внеклеточных сигналов, спецификацию миогенной дифферен-цировки клеток и взаимодействие между клетками и ВКМ, удивительно сходны с генами млекопитающих. Некоторые гены Кишечнополостных, такие как mesoderm specification factor Twist, оказались значительно ближе к генам позвоночных, чем родственные гены дрозофилы или нематод (Galliot, Schmid, 2002).
Объектом настоящей работы была выбрана сцифоидная медуза
Aurelia aurita (Eukaryota; Metazoa; Cnidaria; Scyphozoa; Semaeostomeae; Ulmaridae; Aurelia.).
Жизненный цикл A. aurita состоит из четерех стадий: личинки - пла-нулы, полипоидной стадии, эфиры и медузы. Медуза достигает диаметра 30 см. Она охотится на мелкий планктон с помощью стрекательных клеток эпителия, покрывающего верхнюю поверхность зонтика. Жгутиковые клетки эпителия перемещают добычу к краю зонтика, откуда медуза, с помощью щупалец, перемещает добычу в рот.
Тело представителей этого вида, как и у других кишечнополостных, образовано двумя эпителиальными пластами, эпидермой и гастро-дермой, между которыми находится мезоглея. У взрослых медуз толщина мезоглеи составляет несколько сантиметров. Мезоглея выполняет функцию скелета, придавая определенную форму телу животного; она участвует также в транспорте и запасании питательных веществ (Chapman, 1966; Bouillon and Coppois, 1977; Weber and Schmid, 1985). Усилие, производимое мышечной системой зонтика, обеспечивает сокращение диаметра внешней части зонтика, тогда как эластичность мезоглеи обеспечивает медузе возврат к первоначальной форме после каждого мышечного сокращения (Bouillon and Coppois, 1977). Мезоглея участвует в регулировании плавучести медузы (Denton, 1963; Mackay, 1969). Мезоглея играет ключевую роль в контроле миграции клеток и морфогенезе (Schmid, 1992; Kleinman et al., 2003). Основную массу мезоглеи составляет внеклеточный матрикс (ВКМ), который у многих кишечнополостных не содержит клеток.
У медузы A. aurita и ряда других представителей классов Scyphozoa и Anthozoa мезоглея заселена свободными подвижными клетками (Chapman, 1966). У таких кишечнополостных мезоглея приобретает внешнее сходство с соединительными тканями других животных (За-варзин, 1945; Chapman D.M., 1974). Наличие у медузы A. aurita толстого слоя мезоглеи, заселенной почти исключительно клетками одного типа, предоставляет исключительные возможности для изучения влияния ВКМ на клетки и наоборот. Происхождение мезоглеальных клеток (Мк) в онтогенезе слабо изучено. Одни авторы полагают, что Мк имеют эк-тодермальное происхождение (Hyman, 1940; Werner, 1984), другие - что источником их развития служит гастродерма (Заварзин, 1945; Young, 1974). Принято считать, что выселение происходит в ходе позднего эм-
брионального развития или, скорее, постоянно у взрослых организмов (Заварзин, 1945; Knight, 1971). Показано что пролиферативная активность Мк достаточна для самоподдержания этой популяции, без подсева клетками из эпителиальных пластов. Следовательно, популяция Мк способна самообновляться (Чага, 1996), но это не исключает возможности постоянного выселения Мк из эпителиев. Показано, что мезоглея или экстракт мезоглеи сцифоидной медузы Rhopilema nomadica является оптимальной подложкой для переживающих культур клеток пяти видов морских кишечнополостных группы anthozoa (Aiptasia sp., Anemonia sulcata, Stylophora pistillata, Heteroxenia fuscescence, Nephthea sp.) (Frank, Rinkevich, 1999). Возможно, изучение состава мезоглеи медузы поможет решить проблему культивирования постоянных клеточных линий беспозвоночных.
Полагают, что ВКМ мезоглеи синтезируется клетками эпителиев (Hausman, 1973; Singer, 1974). Участие Мк в регуляции состава ВКМ мезоглеи не очевидно, однако ранее мы показали, что они являются активно синтезирующими (Shaposhnikova et al., 2005) и это позволяет предполагать, что Мк участвуют в формировании ВКМ мезоглеи. С помощью электрофоретического анализа белкового состава мезоглеи зрелых медуз A. aurita мы показали наличие в ней нескольких мажорных белков. Одним из них является белок с молекулярной массой 45/47 кДа. Мы получили поликлональные антитела против белков фракции 45/47 кДа и подтвердили их специфичность с помощью иммуноблота. Проведенный нами иммуногистохимический анализ срезов A. aurita показал, что антиген 45/47 кДа локализуется в гранулах Мк и в апикальной части клеток эпидермы, а у зрелых медуз он выявляется также в составе эластических волокон. Следовательно, Мк A. aurita (наряду с эпидер-мальными клетками) определенно участвуют в процессах формирования межклеточного вещества мезоглеи (Shaposhnikova et al., 2005).
Получение нуклеотидных последовательности генов, экспрессирую-щихся в Мк позволит приблизиться к пониманию функций этих клеток. Выявление генов специфически экспрессирующихся в Мк, позволит судить о том, насколько специализированной является эта группа клеток. Такие гены можно будет, также, использовать как маркеры дифферен-цировки Мк, что позволит проследить их происхождение в онтогенезе.
Мы клонировали и секвенировали мРНК мажорного белока мезоглеи
A. aurita с молекулярной массой около 45 кДа и назвали его мезоглеин, а также показали, что у взрослых медуз этот белок экспрессируется только в Мк.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы был поиск генов специфически экспресси-рующихся в Мк.
Были поставлены следующие задачи:
Сравнить транскрипты Мк с транскриптами клеток эпидермы и гастродермы с помощью метода дифференциального дисплея (ДД).
Определить нуклеотидную последовательности мРНК мажорного белка мезоглеи A. aurita с молекулярной массой около 45/47 кДа.
Проверить предположение о том, что ген мажорного белка мезоглеи с молекулярной массой 45/47 кДа специфически экспрессируется в Мк.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Клонирована и секвенирована мРНК мажорного белка ВКМ мезо
глеи A. aurita - мезоглеина.
2. На основании нуклеотидной последовательности клонированой
мРНК сделан вывод что мезоглеин содержит домены ZP и DSL, что
характерно для экстраклеточных белков.
3. Мезоглеин синтезируют и экскретируют мезоглеальные клетки.
Научная новизна. Ранее предполагалось, что Мк принимают участие в регуляции состава ВКМ мезоглеи. В данной работе показано, что Мк синтезируют один из белков ВКМ мезоглеи. Клонирована и секвенирована мРНК мезоглеина - белка синтезируемого и экскретируемого Мк. Анализ последовательности мезоглеина позволяет делать предположения о функциях этого белка и Мк.
Теоретическое и практическое значение работы. Доказательство того, что мезоглеальные клетки A. aurita являются активно синтезирующими, определение нуклеотидной последовательности мРНК мезоглеина, за синтез которого они ответственны, требует пересмотра общепринятого взгляда об инертной природе этой клеточной популяции. Анализ последовательности мРНК мезоглеина позволило отнести его к семейству ZP содержащих белков. Полученный сиквенс может быть использован для сравнительно эволюционных исследований. Среди известных обладателей ZP содержащих белков, A. aurita является самым
низшим представителем в современной зоологической классификации. Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биолого-почвенного факультета Санкт- Петербургского государственного университета и могут быть использованы в общих и специальных курсах лекций биологических факультетов других университетов.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ (из них 3 статьи). Основные положения представлены и обсуждены на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (2002), 10th Evolutionary Biology Meeting at Marseilles (2006), Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (2006), на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 82 публикаций. Работа изложена на 75 страницах машинописного текста и иллюстрирована 9 рисунками.
Мезоглея и мезоглеальные клетки кишечнополостных
Кишечнополостные (Coelenterata или Cnidaria) низшие многоклеточные животные, тело которых образовано двумя эпителиальными слоями. Между наружным (эпидерма) и внутренним (гастродерма) слоями тела расположена прослойка межклеточного вещества, называемая мезоглеей (Chapman DM, 1974; Догель, 1981). Степень развития мезоглеи отличается как в разных группах, так и на разных стадиях жизненного цикла от тонкой пластинки у гидры до обширной массы у зрелых сцифомедуз. У многих кишечнополостных мезоглея не содержит клеток, однако у ряда представителей этого типа мезоглея заселена мезоглеальными клетками (Заварзин, 1945; Chapman DM, 1974). По своей структуре мезоглея кишечнополостных может быть весьма сложно организована и сравнима с рыхлыми соединительными тканями других животных (Заварзин,1945).
Матрикс мезоглеи состоит из фибрилл, заключенных в аморфное вещество. Методами дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии было показано, что основная масса мезоглеальных фибрилл имеет коллагеновую природу (Adams, 1978). Позднее биохимическими и иммунохимическими методами в составе матрик-са были обнаружены фибриллярный коллаген с высокой степенью гликозилирования, фибриллярный коллаген, сходный с коллагеном V типа позвоночных, а также не фибриллярный коллаген IV типа (Franc et al., 1984; Miura, Kimura, 1985; Sarras et al., 1991; Tillet et al., 1996). Коллагеновые фибриллы образуют в мезоглее пучки разной толщины (Chapman D., 1974). В мезоглее гидроидных и сцифоидных медуз имеются также волокна, отличающиеся по своим химическим и физическим свойствам от кол-лагеновых (Chapman G., 1959). Они выполняют функцию антагониста мускулатуры и потому названы эластическими волокнами. Располагаются они в мезоглее в направлении от гастро- к эпидерме, поэтому второе их название вертикальные волокна (Weber, Schmid, 1985; Оскольский, 1985). Химическая природа эластических волокон не ясна.
Что касается присутствия в мезоглее кислых гликозамингликанов, важного компонента соединительных тканей многоклеточных животных, то гистохимический анализ показал отсутствие этих веществ у актиний, гидромедуз и сидячей сцифомедузы Lucernaria quadricornis, в мезоглее же мягкого коралла Gersemia fructicosa сульфа-тированные гликозамингликаны присутствуют в большом количестве (Оскольский, 1985). Мезоглея сцифомедуз Cyanea arctica и Aurelia aurita по этому показателю занимает промежуточное положение (Оскольский, 1985; Napara et al., 1996а). Кроме того, в мезоглее ряда видов кишечнополостных выявлены белки, сходные с фибриллином, а также с ламинином и фибронектином, входящими в состав базальных пластин (Schmid et al., 1991; Reber-Muller et al., 1995).
У представителей класса Hydrozoa мезоглея обычно не содержит клеток (Chapman G., 1966), но у гидроидных полипов, имеющих хитиновый перисарк, имеются подвижные гранулярные клетки (Заварзин, 1945; Knight, 1971). У ряда представителей классов Scyphozoa и Anthozoa мезоглея заселена свободными подвижными клетками (Chapman G., 1966). Однако выявить закономерности их появления в мезоглее кишечнополостных в целом не удается. Например, в роде Cyanea у одного вида клетки в мезоглее имеются, у другого вида их нет (Наумов, 1961); на одной стадии жизненного цикла (сцифистома Chrysaora quinquencirrha) мезоглея содержит клетки, а на другой стадии (медуза Chrysaora quinquencirrha) клетки в мезоглее отсутствуют (Bynum, Black, 1974). О функциях мезоглеальных клеток известно крайне мало. Описана способность этих клеток к амебоидному движению и фагоцитозу (Мечников, 1947; Napara et al., 1994).
У кишечнополостных, мезоглея которых заселена мезоглеальными клетками, она приобретает внешнее сходство с соединительными тканями других животных (Заварзин, 1945; Chapman, 1974). Хотя многие авторы исследовали механизмы синтеза мезо глеи, в том числе методом авторадиографии с 3Н-пролином (Hausman, Burnett, 1971; Singer, 1974; Young, 1974; Naparaet al., 1996b), возможная роль мезоглеальных клеток в формировании внеклеточного матрикса остается неясной.
Мезоглея кишечнополостных выполняет те же основные функции, что и рыхлые соединительные ткани других многоклеточных животных. Она является частью скелетной системы этих животных (Chapman DM., 1974); служит антагонистом мускулатуры (Elder, 1973); выполняет транспортную функцию и, возможно, служит местом резервирования питательных веществ (Chapman С, 1966); участвует в регуляции миграции и дифференцировки клеток в морфогенетических и регенерационных процессах (Sarras et al., 1993; Schmid et al, 1993; Stidwill, Christen, 1998; Frank, Rinkevich, 1999; Schmid et al., 1999). Таким образом, мезоглею, заселенную мезоглеальными клетками, можно рассматривать, как тканевую систему, сопоставимую по своим функциям с тканями внутренней среды других многоклеточных животных (Napara, Chaga, 1992b). Исследования взаимоотношений клеток и ВКМ, организации и синтеза межклеточного вещества мезоглеи у кишечнополостных, позволяют проследить ранние этапы становления этой тканевой системы. Одним из интереснейших объектов для такого рода исследований является медуза Aurelia aurita, один из представителей класса Scyphozoa.
Обыкновенная, или ушастая медуза A. aurita широко распространена в водах Мирового океана от арктических до тропических морей и обладает типичным жизненным циклом, в ходе которого чередуются полипоидная и медузоидная стадии (Догель, 1937). Одиночные полипы (сцифистомы), прикрепленные при помощи ножки к субстрату, живут, питаются и размножаются почкованием. В определенный период начинается стробиляция - полип делится путем ряда поперечных перетяжек, в результате чего получается стопка дисков, соединенных между собой центральным стволом, стробила. Каждый диск представляет собой будущую молодую медузу, называемую эфирой. Эфиры, считающиеся особой, личиночной стадией, последовательно отрываются от стробилы и переходят к плавающему образу жизни (Догель, 1981; Иванов и др., 1981). После стробиляции сцифистомы восстанавливаются и, достигнув обычных размеров, вновь приступают к почкованию. Превращение эфиры во взрослую медузу сопровождается выравниванием краев зонтика, формированием щупалец и ротовых лопастей, развитием системы пищеварительных каналов, появлением зачатков гонад. Медузы растут и, достигнув зрелости, приступают к половому размножению. Медузы раздельнополы. Оплодотворение и эмбриональное развитие протекает в специальных карманах ротовых лопастей самок. Образующиеся планулы некоторое время плавают, а затем прикрепляются к подходящему субстрату и превращаются в сцифистом. Таким образом, A. aurita обладает ярко выраженным чередованием полового и бесполого поколений (метагенезом), характерным для сцифомедуз, с хорошо развитым медузоидным (половым) поколением (Догель, 1981).
Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле
В отличие от ранних представлений о том, что мезодерма кишечнополостных носит примитивный мезенхимальный характер (Hyman, 1951) мезодерма энтокодона гидромедуз мезенхималыюй не является, а образует отдельную трехмерную структуру (ме-зотелеальный компартмент), которая дифференцируется в субумбрелярные мышечные и нервные клетки (Seipel et al., 2004). Таким образом, в терминологии Hyman и в более строгих формулировках Pantin (1960) and Chapman (1966), требующих трехмерности мезодермальных структур, энтокодон классифицируется как настоящая мезодерма.
Животные классов Scyphozoa, Cubozoa и Anthozoa не имеют энтокодона, однако некоторые из них имеют другие структуры, предположительно, мезодермального происхождения.
Развитие планулы сцифоидных может проходить различными путями, включая разнообразные инвагинации и многополярные ингрессии (Franc, 1993). Личинка имеет типичное для кишечнополостных двухслойное строение. Необычный способ инвагинации наблюдается у Aurelia flavidula, у которой третий слой клеток образуется путем многополярной деламинации от эктодермы незадолго до и во время инвагинации эндодермы (Smith, 1881). Дальнейшая роль клеток третьего слоя в развитии не известна, возможно они участвуют в формировании мезоглеальных мезенхимальных клеток или дегенерируют. После прикрепления личинки к субстрату, образуется полип, по строе-нию сходный с Hydrozoa. В целом, анатомия сцифистомы (полипа) напоминает полип Anthozoa, Stauromedusa и Coronata (Stephanoscyphus), сцифистома обладает чертами как полипа, так и медузы (Werner, 1967).
Все сцифоидные полипы обладают мускулами-ретракторами и многочисленными амебоцитами в ВКМ. У сцифистом Amelia aurita наблюдаются как гладкие так и поперечнополосатые миофибриллы в основании щупалец, внешнем около-ротовом диске и верхней части мускула-ретрактора (Chia et al., 1984). Ретрактор интерпретировали как плоскую эктодермальную ламеллу, направленную аборально, и растущую внутрь от перистомального поля, в котором дифференцируются мышечные волокна - предшественники мышц септ (Goette, 1887; Hein, 1900; Hargitt and Hargitt, 1910; Chapman, 1966). У полипов Cyanea palmstruchi, на ранней стадии развития (до формирования щупалец), из эктодермальных клеток вселяющихся в ВКМ из гипостомального поля, образуются тяжи мезэнтериальных мышц, также эктодермальные клетки выселяются из боковых стенок тела по мере роста мезэнтерия в сторону основания ноги (Widersten, 1966). У Stauromedusa Haliclystus octoradiatus ретрактор развивается похожим образом из клеток, мигрирующих от гипостомальной эктодермы в базальном направлении. Объемные тяжи гладких мышц полностью окружены ВКМ и не имеют контакта ни с эктодермой, ни с эндодермой ( Wietrzykowski, 1912).
Сцифоидные обладают выраженной медузоидной стадией с гладкими эпидермаль-ными и поперечнополосатыми субэпидермальными мышцами (Chapman et al., 1962; Chapman, 1968; 1999). В щупальцах Pelagia, сцифоидного организма не имеющего полипоидной стадии, гладкомышечные и нервные клетки образуют трубо-образные пучки (Krasinska, 1914). Эти пучки залегают глубоко в ВКМ и, в основном, не контактируют с экто- и эндодермальпыми слоями. Происхождение поперечнополосатых мышечных клеток в развитии эфиры и медузы не исследовано, но при отсутствии эн-токодона, оно определенно отличается от Hydrozoa.
Эмбриональное развитие Cubozoa не описано. Полипы не обладают мезентерием и ретракторами. У них нет элементов предположительно мезодермального происхождения.
Мышцы Anthozoa представлены двумя типами гладких мышц (Hyman, 1940; Amerongen and Peteya, 1980). В ходе развития личинки Anthozoa у октакораллов эндодерма образуется деламинацией (Tixier-Durivault, 1987), у гексокораллов инвагинацией и многополярной ингрессией (Van-Praet and Doumenc, 1987). У Actiniidae (гексо-кораллы) инвагинация происходит на оральном (бластопор) конце эмбриона и может прямо превращаться в действующий рот (Tardent, 1978). Вскоре после образования ротовой ямки и до прикрепления планулы, формируется мезентерий в виде билатеральных выростов эктодермального слоя на оральном конце, постепенно растущих к заднему концу. На ранних этапах этого процесса оба эпителия начинают синтезировать богатый коллагеном ВКМ. В этом матриксе залегают и дифференцируются ре-тракторы, амебоциты, иногда склеробласты и гонады (Hyman, 1940). Миофиламенты ретрактора погружены в ВКМ и большинство мышечных клеток отделены от эндо-дермальных эпителиальных мышц (Doumenc, 1976, 1979). Различные данные свидетельствуют о том, что все эти типы клеток (кроме, возможно, гамет) происходят от эктодермальных мезенхимальных клеток мигрирующих в ВКМ от орального полюса по мере дифференцировки мезентерия (Doumenc, 1977; 1979). Некоторые клетки сразу проникают в ВКМ, тогда как другие сначала мигрируют вдоль и внутри эндодермаль-ного слоя развивающегося мезентерия. Дифференцировка миофиламентов ретрактора запускается, когда мигрирующие клетки теряют контакт с эндодермой, образуют контакты между собой и формируют мышцы ретрактора. Некоторые элементы нервной системы развиваются похожим образом. Это напоминает об энтакодоне, клетки которого способны дифференцироваться в мышечные и нервные клетки, что указы вает на эволюционную связь между этими типами клеток (Seipel et al., 2004). Формирование мезенхимальных клеток из клеток эктодермального эпителия мигрирующих в ВКМ, также, наблюдается у коралла из группы alcyonarian Sympodium (Kovalevsky and Marion, 1883).
В общем, можно сказать, что мезентериальные мышцы-ретракторы у Scyphozoa и Anthozoa имеют эктобластемное происхождение и образуют гладкомышечные пучки, частично или полностью погруженные в ВКМ. Имеющиеся данные позволяют предположить, что полипы обоих классов кишечнополостных имеют трехмерное строение мышц мезодермального/мезенхимального происхождения. Последние исследования экспрессии генов мезодермальной/миогенной дифференцировки и patterning генов у Nematostella vectensis, относящейся к Anthozoa, не противоречат этому предположению (Martindale et al., 2004). На основании приведенных данных можно составить две гипотезы о происхождении мезодермы: 1) "Мезодерма"кишечнополостных и происходящие от нее мышцы гомопластичны мезодерме билатеральных животных, и их сходство является результатом конвергентной эволюции. 2) Мезодермы кишечнополостных и билатеральных гомологичны, что предполагает наличие общего трехслойного предка.
Приготовление проб мезоглеина для MALDI и белкового секвенирования по Эдману
Для выявления генов, специфически экспрессирующихся в клетках эпидермы, мезоглеи и гастродермы, каждую особь A. aurita разделяли на 3 соответствующие части как описано в разделе "Материалы и методы". Из каждого препарата выделяли тотальную РНК и сравнили эти РНК при помощи дифференциального дисплея (рис. 1). Чтобы исключить из анализа дифференциальные зоны, специфические для отдельных особей A. aurita, ДД повторен на РНК трех особей медуз. Продукты ДДПЦР на РНК из одинаковых тканей разных медуз нанесены в соседние карманы геля. На рис. 1 стрелками отмечены зоны, которые есть в мезоглее, но отсутствуют в эпидерме или гастродерме, и повторяющиеся в пробах РНК разных медуз. Это мезоглеальные дифференциальные зоны. Они содержат фрагменты кДНК, которые могут быть фрагментами дифференциально экспрессирующихся транскриптов.
Для того, чтобы добиться повторяемости наборов зон на РНК разных особей медузы и наблюдать при этом дифференциальные зоны, поставили около 100 ДДПЦР с различными произвольными праймерами и условиями реакций. Праймеры и условия ДДПЦР, с применением которых получили лучший результат, описаны в разделе ДДПЦР "Материалы и методы".
Участки геля, содержащие дифференциальные зоны (рис. 1), вырезали и использовали для реамплификации содержащихся в них фрагментов ДНК. Каждая вырезанная дифференциальная зона обычно содержит смесь фрагментов ДНК одинаковой длины. ДНК, реамплифицированая из вырезанных участков геля, была клонирована и секвенирована.
Секвенировано 10 фрагментов кДНК, полученных при помощи ДДПЦР. При их сравнении с известными генами в базах данных GenBank и EMBL при помощи программы BLAST (Altschul et al., 1997) 4 фрагмента показали высокую степень гомологии (87-100%) с различными генами бактерий. Поскольку РНК для ДДПЦР была получена из медуз, пойманных в природе, и контаминация бактериальной РНК весьма вероятна, такие фрагменты были исключены из дальнейшего анализа.
Один из фрагментов на 99% гомологичен гену AY033611.1 Homo sapiens placenta immunoregulatory factor PLIF mRNA. ПЦР на матрице тотальной ДНК A. aurita с праймерами к данному фрагменту не подтвердила его принадлежность медузе. При обработке тотальной РНК и при обратной транскрипции был использован ингибитор РНКазы, полученный из плаценты человека (Fermentas), и ОТПЦР показал наличие этого фрагмента только в препаратах к ДНК, полученных с использованием этого ингибитора. Поэтому данный фрагмент также был исключен из дальнейшего анализа.
Фрагмент aurp54 (рис. 2) на 98% гомологичен с гену AF161446 Homo sapiens HSPC328. Фрагменты aurpl, aurp7, aurp52 (рис. 2) не показали достоверной гомологии с известными генами содержащимися, в базах данных GenBank и EMBL.
Для того, чтобы проверить принадлежность секвенированых фрагментов A. aurita, провели ПЦР тотальной ДНК медузы с праймерами к этим фрагментам. Такая проверка позволила подтвердить принадлежность фрагментов aurp7, aurp52 и aurp54 медузе, но не фрагмента aurpl. ОТПЦР РНК нескольких особей A. aurita с праймерами к этому фрагменту дал продукт ожидаемого размера. На основании результатов ОТПЦР можно заключить, что aurpl принадлежит A. aurita.
Тканеспецифичная экспрессия генов фрагментами которых являются последовательности aurpl, aurp7, aurp52, aurp54, была проверена ОТПЦР на РНК из клеток эпидермы, мезоглеи и гастродермы. Для этого РНК из соответствующих клеток была обработана ДНКазой и проведена обратная транскрипция (ОТ) с праймером ANK1, комплементарным поли-А концу мРНК. Полученная кДНК была использована для ПЦР с праймерами к секвенированым фрагментам. С помощью ОТПЦР с праймерами к фрагментам aurpl, aurp52, aurp54 было показано, что они не тканеспецифичны. Результат ОТПЦР с праймерами к фрагменту aurp7 представлен на рис. 3. На дорожках, содержащих продукты ОТПЦР на РНК из клеток эпидермы разных особей А. аигйа (дорожки 1,4), видны зоны, представляющие продукты ОТПЦР. Продукты реакции на остальных дорожках отсутствуют (слабые зоны на них - праймеры). Таким образом, ОТПЦР показала, что фрагмент aurp7 специфичен для эпидермы.
Тканеспецифичная экспрессия гена фрагментом которого является последовательность aurp52 была проверена флюоресцентной гибридизацией in situ на срезах медузы. На рис. 4а приведена гибридизация одноцепочечного антисмыслового (комплиментарного к аигр52) ДНК зонда на срезе. В цитоплазме Мк, по периферии ядер, видны черные точки гибридзационного сигнала. На рис. 4Ь приведен отрицательный контроль -гибридизация с одноцепочечным смысловым зондом, на этом рисунке гибридизацион-ный сигнал отсутствует. Таким образом, ДНК зонд гибридизуется с РНК в клетках, однако зонд aurp52 гибридизуется как с РНК в Мк, так и с РНК в клетках эпидермы и гастродермы (данные не приведены) и тканеспецифичным не является, что согласуется с результатами проверки локализации его экспрессии методом ОТПЦР.
Секвенировано 4 фрагмента неизвестных генов A. aurita. Из них 1 дифференциально экспрессируется в эпидерме медузы. Генов, специфично экспрессирующихся в Мк, с помощью метода дифференциального дисплея, обнаружить не удалось.
Поиск генов, дифференциально экспрессирующихся в мезоглее методом Дифференциального Дисплея
В результате поиска известных доменов в гипотетической аминокислотной последовательности мезоглеина были обнаружены домены Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) и Zona Pelucida (ZP), а также 3 сайта узнавания протеазы фурин (furin), 2 возможных сайта N-гликозилирования и 1 возможный сайт 0-гликозилирования. Расположение доменов и сайтов показано на рис. 8.
Домен Zona Pelucida (ZP) встречается в большом количестве различных экстраклеточных белков. В настоящее время известно около 680 белков, содержащих этот домен. Функции ZP-содержащих белков разнообразны - от структурных компонентов в оболочке яйца или в "слизистых домиках "аппендикулярий до компонентов, передающих механическую нагрузку (mechanotransducers) в крыле дрозофилы, или рецепторов у млекопитающих и других позвоночных (Jovine et al., 2005). ZP-содержащие белки могут подвергаться посттрансляционному расщеплению фурино-подобными эндопептидазами (furin-like endopeptidases), как это было показано для белков млекопитающих ZP2 и ZP3 (Litscher et al., 1999). Мезоглеин содержит три возможных сайта узнавания протеазы фурин (рис. 8): первый RRRR - перед доменом DSL (позиции 4-7 аа), второй RDSR - между DSL и ZP доменами (позиции 86-89 аа), третий RKER - ниже домена ZP (позиции 370-373 аа). У многих ZP-содержащих белков есть трансмембранный домен, или GPI-anchor, прикрепляющий эти белки к клеточной мембране. Такие белки экскретируются после того, как фурин-подобная протеаза разрезает белок между ZP-доменом и местом крепления белка к клеточной мембране. У мезоглеина не обнаружено ни трансмембранного домена, ни GPI-anchor. Известны другие ZP-содержащие белки, не имеющие трансмембранного домена и GPI-anchor, например белки семейства oikosins (Jovine et al., 2005). Домен DSL встречается в экстраклеточных белках или в экстраклеточной части мембранных и трансмембранных белков. Этот домен необходим для активации рецепторов - членов семейства Lin-12/Notch. Домен DSL может служить связующим зве ном при олигомеризации DSL-содержащих белков, в результате которой образуется активный лиганд, взаимодействующий с экстраклеточной частью Lin-12 /Notch белков (Fitzgerald, Greenwald, 1995; Yuan et al., 2001). Белки семейства Lin-12/Notch являются трансмембранными белками, пересекающими клеточного мембрану один раз. Они участвуют в различных процессах, определяющих направление дифференцировки клеток у беспозвоночных и позвоночных (Kiyota, Kinoshita2002).
Кроме мезоглеина существуют другие белки, содержащие ZP и DSL домены, например Strongylocentrotus purpuratus predicted protein UniProt Accession No. UPI0000583FF7 similar to Neurogenic locus Notch protein precursor.
Теоретическая кривая титрования, построенная на основании аминокислотной последовательности, имеет изоэлектрическую точку 9.03, что подтверждает предположение о положительном заряде мезоглеина. Сильный позитивный заряд не характерен для ZP-содержащих белков. Только 12.5% белков этого семейства имеют теоретическую изоэлектрическую точку выше pi 8. Средняя теоретическая изоэлектрическая точка ZP-содержащих белков pi 6.3 а средняя изоэлектрическая точка ZP доменов pi 6.2.
На основании того, что изоэлектрическая точка мезоглеина сдвинута в щелочную область, можно сделать вывод, что при нейтральном рН мезоглеин заряжен положительно. Положительный заряд белка должен способствовать его хорошей растворимости, однако в ходе экспериментов по экстракции мезоглеина из мезоглеи, было показано что белок хорошо экстрагируется только при кислом рН. Эти данные позволяют предположить, что мезоглеин прочно связан с ВКМ.
Есть расхождение между результатами окраски антителами и ОТПЦР. При окраске антителами к мезоглеину иммуноблотов диск-электрофореза мезоглеи, Мк, эпидермы и гастродермы, кроме зоны соответствующей мезоглеину, окрашиваются также зоны 80 кДа и 120 кДа на дорожках, соответствующих Мк и эпидерме. Возможно, мезоглеин синтезируется в виде белка- предшественника, который подвергается посттрансляционному расщеплению. При окраске срезов медузы антитела к мезоглеину окрашивают Мк, волокна в ВКМ мезоглеи и клетки эпидермы. Возможно, в клетках эпидермы есть мезоглеин, но экспрессия его гена у взрослых медуз в клетках эпидермы шла на более ранних стадиях онтогенеза. Аминокислотная последовательность мезоглеина составляет около 416 аа из них больше половины занимает домен ZP (246 аа), поэтому одно из объяснений расхождения результатов состоит в том, что, возможно, антитела узнают домен ZP других ZP содержащих белков в клетках эпидермы. Результаты ОТПЦР представляются достовернее окраски антителами, т.к. праймеры обеспечивают большую специфичность, чем поликлональные антитела. Таким образом, мезоглеин дифференциально экспрессируется в Мк взрослых медуз.
На основании полученных данных можно предположить, что мезоглеин является структурным элементом ВКМ мезоглеи.
Поскольку показано, что ZP-содержащие белки могут выполнять роль элементов, передающих механическую нагрузку (Jovine et al., 2005), можно предположить, что мезоглеин модифицирует механические свойства ВКМ мезоглеи, делая ее более прочной. Это подтверждается субъективным наблюдением, что тело медуз, достигших максимальных размеров, более жесткое, чем у молодых медуз.
Наличие в мезоглеине домена DSL позволяет предположить, что мезоглеин может направлять дифференцировку какого-то типа клеток. Возможно DSL мезоглеина является сигналом для клеток, выселившихся из эпителия в мезоглею, направляющим их дифференцировку в Мк.
