Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы 9
2.1. Регуляция клеточного цикла 9
2.2. Роль МАР-киназных каскадов в контроле клеточного цикла 13
2.3. Транскрипционный фактор АР-1 18
2.3.1. Основные свойства АР-1 19
2.3.2. Роль белков АР-1 в пролиферации клеток 20
2.3.3. Роль белков семейства Fos в составе АР-1 23
2.3.4. Регуляция активности АР-1 23
2.3.5. Регуляция транскрипции генов, кодирующих АР-1 24
2.3.5.1. Регуляция транскрипции гена c-jun 24
2.3.5.2. Регуляция транскрипции гена c-fos 25
2.4. Структура хроматина и регуляция транскрипции 29
2.4.1. Хроматин-модифицирующие ферменты 29
2.4.3. HAT и транскрипционная активация 30
2.4.4. HDAC и транскрипционная репрессия 32
2.4.5. Нарушение ацетилирования гистонов и рак 34
2.5. Ингибиторы HDAC 35
2.6. Онкогены и опухолевая трансформация клеток 38
2.6.1. Классификация онкогенов 39
2.6.3. Онкоген Е1А раннего района аденовируса человека и контроль клеточного цикла 40
2.6.3.1. Мишени Е1А - Белки семейства Rb 41
2.6.3.2. Мишени Е1А - циклины и циклин-зависимые киназы 42
2.6.3.3. Мишени Е1А - HAT, HDAC и реорганизация хроматина 43
2.6.3.4. Мишени Е1А-транскрипционный комплекс АР-1 45
2.6.4. Цитоплазматический онкоген ras. Функции белков Ras в проведении
сигнала 46
2.6.2. Трансформация клеток 50
2.6.5. Трансформация онкогенами Е1А исНа-гая 50
ГЛАВА 3. Материалы и методы 54
3.1. Культивирование клеток 54
3.2. Обработка клеток ингибиторами 54
3.3. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла 54
3.4. Иммунопреципитация 55
3.5. Анализ содержания белков методом иммуноблотинга 55
3.6. Получение ядерных экстрактов 57
3.7. Фосфорилирование белков in vitro 57
3.8. Диск-электрофорез белков по Лэмли 58
3.9. RT-PCR анализ транскрипции генов 58
3.10. Кинирование двуцепочечного олигонуклеотида SRE в присутствие у-32Р-АТР 59
3.11. Задержка подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA) 59
3.12. Анализ фрагментации клеточной ДНК 60
3.13. Флуоресцентная окраска хроматина 61
ГЛАВА 4. Результаты 62
4.1. Трансформация клеток REF онкогенами Е1А и cHa-ras приводит к конститутивной активности МАР киназ 62
4.1.1. Содержание киназ ERK, INK и р38 в трансформантах ElA+cHa-ras повышено по сравнению с клетками REF52 63
4.1.2. Трансформанты ElA+cHa-ras характеризуются повышенным содержанием фосфорилированных форм MAP киназ 63
4.1.3. Активность киназ ERK и р38 повышена в трансформантах Е1А+сНа-ras 65
4.2. Экспрессия генов раннего ответа по-разному дерегулирована в клетках, трансформированных онкогенами Е1А и cHa-ras 69
4.3. Анализ экспрессии TCF-белков в клетках REF и ElA+cHa-ras 72
4.4. Транскрипционный фактор Elk-1 конститутивно фосфорилирован в трансформантах ElA+cHa-ras 74
4.4.1. Белок Elk-1 доминирует в составе тройных комплексов, связывающихся с областью SRE 74
4.4.2. Сывороточная стимуляция не увеличивает содержания тройных комплексов SRF/SRF/TCF в клетках ElA+cHa-ras 76
4.4.3. Анализ статуса фосфорилирования транскрипционного фактора Elk-1 в трансформантах El А+сНа-гау 78
4.4.4. Анализ активности Elk 1-ассоциированных киназ 78
4.5. MEK/ERK-киназный каскад является доминирующим в фосфорилировании белка Elk-1 в трансформантах ElA+cHa-ras 80
4.6. Анализ взаимодействия белка Elk-1 с деацетилазой гистонов HDAC-1 82
4.7. Бутират натрия селективно активирует транскрипцию протоонкогена с-fos в трансформантах ElA+cHa-ras 85
4.8. Исследование регуляции клеточного цикла трансформантов ElA+cHa-ras при обработке ингибитором HDAC бутиратом натрия 88
4.8.1. Эффект бутирата натрия на клеточный цикл трансформантов ElA+cHa-ras 89
4.8.2. NaB не вызывает апоптоза в трансформантах ElA+cHa-ras 89
4.8.3. Анализ экспрессии регуляторов клеточного цикла в трансформантах ЕІА+сНа-ras, обработанных NaB 92
4.8.4. Анализ способности белка p21/Wafl взаимодействовать с циклин-киназными комплексами в клетках, обработанных NaB 97
4.8.5. Анализ активности циклин-киназных комплексов в клетках Е1А+сНа-ras, обработанных NaB 97
ГЛАВА 5. Обсуждение 100
5.1. Активация МАР-киназ при трансформации онкогенами Е1А и cRa-ras. 100
5.2. Модуляция экспрессии генов раннего ответа при трансформации онкогенами Е1А и сНа-гая 103
5.3. Роль структуры хроматина в репрессии транскрипции протоонкогена c-fos в трансформантах ЕІА+сНа-ras 106
5.4. Ингибиторы HDAC и клеточный цикл трансформантов ElA+cRa-ras.. 109
5.4.1. Ингибитор HDAC бутират натрия модулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл 110
5.4.2. Роль белка p21/Wafl в NaB-индуцированной остановке пролиферации трансформантов ЕІА+сНа-ras 113
Выводы 116
Список сокращений 117
Список работ, опубликованных по теме диссертации.119
Список литературы
- Роль МАР-киназных каскадов в контроле клеточного цикла
- Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла
- Содержание киназ ERK, INK и р38 в трансформантах ElA+cHa-ras повышено по сравнению с клетками REF52
- MEK/ERK-киназный каскад является доминирующим в фосфорилировании белка Elk-1 в трансформантах ElA+cHa-ras
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы.
Пролиферация клеток является сложным многоэтапным процессом. Фитогенная стимуляция приводит к активации мембранных рецепторов и запуску различных путей передачи сигнала в клетке. В результате этого активируются транскрипционные факторы и специфические регуляторы клеточного цикла. Онкогенная трансформация клеток приводит к нарушениям передачи сигнала, в результате чего происходит изменение регуляции активности MAP (mitogen activated protein kinase) киназных каскадов и активности ряда транскрипционных факторов, в частности фактора АР-1, который является важным регулятором пролиферации. Многие трансформирующие вирусные онкобелки способны взаимодействовать с белками, регулирующими клеточный цикл. Поэтому трансформированные клетки теряют способность останавливаться в клеточном цикле после действия ДНК-повреждающих агентов и стрессорных факторов.
Первичные эмбриональные фибробласты крысы, стабильно трансформированные онкогенами ElAad5 и cHa-ras, характеризуются высокой и нерегулируемой скоростью пролиферации независимо от экзогенных факторов роста (Поспелова и др., 1990). В трансформантах ElA+cHa-ras наблюдается высокая и конститутивная активность транскрипционного комплекса АР-1. Однако экспрессия генов, кодирующих основные компоненты АР-1, по-разному изменена в этих клетках: ген c-jun экспрессируется на постоянном, высоком уровне, а транскрипты гена c-fos практически не обнаруживаются (Pospelova et al., 1999). Кроме того, в клетках ElA+cHa-ras изменен состав транскрипционного комплекса АР-1: гетеродимеры Fos/Jun заменены Jun/ATF2, что связано с отсутствием белка c-Fos. Селективное выключение экспрессии ключевых генов раннего ответа при трансформации может быть следствием де регуляции основных MAP киназных каскадов в трансформантах.
Одним из механизмов модуляции транскрипции генов является реорганизация структуры хроматина в области их паромоторов.
Релаксированная структура хроматина, характеризующаяся гиперацетилированным состоянием нуклеосомных пистонов, свойственна активно экспрессирующимся генам. Статус ацетилирования гистонов регулируется двумя типами ферментов: гистоновыми ацетилтрансферазами (HAT) и гистон-деацетилазами (HDAC). Известно, что ряд транскрипционных факторов, обладающих тумор-супрессорной активностью, (pRB, р53) способны взаимодействовать с HAT- или HDAC-белками, тем самым, способствуя активации или репрессии транскрипции. Все большее количество данных указывает на связь между трансформацией клеток и нарушением контроля ацетилирования гистонов. Сейчас установлено, что возникновение некоторых опухолей связано с нарушениями активности HAT и HDAC (Timmermann et al., 2001, Mahlknecht et al., 2000). Гипоацетилированный хроматин, образующийся в результате деятельности HDAC, характерен для транскрипционно неактивных генов. Изменение регуляции ферментов, обладающих активностью HDAC, при трансформации может привести к дерегуляции ряда важных генов. Подавление активности HDAC специфическими ингибиторами приводит к гиперацетилированию гистонов, релаксации структуры хроматина и активации транскрипции. Изучение действия ингибиторов HDAC на трансформированные клетки представляет особый интерес, поскольку они способны останавливать пролиферацию некоторых опухолевых клеток в дозах, нетоксичных для нормальных клеток (Butler et al., 2001), что может иметь широкие перспективы в терапии опухолей.
1.2. Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось исследование дерегуляции онкогенами Е1А и cHa-ras активности основных MAP киназных каскадов, транскрипции генов раннего ответа и генов, контролирующих клеточный цикл.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1) проанализировать содержание, уровень фосфорилирования и активность МАР киназ (ERK, JNK и р38), опосредующих активацию генов раннего ответа, в трансформантах ElA+cHa-ras;
2) исследовать регуляцию экспрессии генов раннего ответа c-fos и c-jun, продукты которых формируют транскрипционный комплекс АР-1;
3) исследовать механизмы репрессии транскрипции гена c-fos в клетках ElA+cHa-ras и роль структуры хроматина в этом процессе;
4) изучить влияние ингибитора HDAC бутирата натрия на пролиферацию трансформантов ElA+cHa-ras и на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы клеточного цикла;
1.3. Основные положения, выносимые на защиту.
1) Трансформация эмбриональных фибробластов крысы комплементирующими онкогенами Е1А и cHa-ras приводит к высокой, нерегулируемой сывороткой активности MAP киназ (ERK, JNK и р38);
2) Селективная репрессия транскрипции протоонкогена c-fos в трансформантах ElA+cHa-ras связана с формированием неактивной структуры хроматина в области паромотора c-fos; 3) Подавление активности деацетилаз пистонов вызывает остановку клеток ElA+cHa-ras на границах фаз G1/S и G2/M клеточного цикла, что сопровождается подавлением транскрипции генов циклинов (Dl, Е, А) и активацией транскрипции гена, кодирующего ингибитор циклин-киназных комплексов р21/Waf 1.
1.4. Научная новизна.
Впервые показано, что позитивный регулятор транскрипции Elk-1 может выступать в качестве репрессора транскрипции гена c-fos в клетках, трансформированных онкогенами ElA+cHa-ras. В трансформантах ElA+cHa-ras транскрипционный фактор Elk-1, конститутивно связанный с паромотором с-fos, постоянно ассоциирован с деацетилазой гистонов HDAC-1, что приводит к поддержанию репрессированного состояния транскрипции гена c-fos. Возможно, что высокая и нерегулируемая активность МАР киназ ERK, JNK и р38 в клетках ElA+cHa-ras вносит вклад в изменение характера взаимодействия транскрипционного фактора Elk-1 с HDAC-1.
Впервые было показано, что клетки, трансформированные онкогенами Е1А и cHa-ras, которые не останавливаются в цикле при действии ДНК-повреждающих агентов и при удалении ростовых факторов, могут быть остановлены при обработке ингибитором деацетилаз гистонов бутиратом натрия.
1.5. Теоретическое и практическое значение работы.
Результаты, полученные в работе, вносят существенный вклад в понимание механизмов трансформации клеток вирусными и клеточными онкогенами. Представленные данные могут быть использованы для углубленного изучения роли структурных преобразований хроматина в области промоторов пролиферативных генов в процессе трансформации клеток. Ингибиторы гистон-деацетилазной активности как модификаторы структуры хроматина и экспрессии генов могут рассматриваться в качестве перспективного подхода в терапии опухолей. Поскольку ингибитор деацетилаз пистонов бутирата натрия способен вызывать остановку пролиферации клеток ElA+cHa-ras, которые не останавливаются при действии облучения и цитостатиков, это вносит значительный вклад в исследование механизмов подавления пролиферации трансформированных клеток.
Материалы диссертации используются в курсах лекций для магистров на факультете медицинской физики СПбГТУ. 1.6. Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ (3 статьи). Материалы настоящей работы были представлены на XIII и XIV Всероссийских симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1999 г., 2002 г.), на Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2001), на конференциях Европейского общества молекулярной биологии (EMBL) "Oncogenes and Growth Control" (Heidelberg, Germany, 2000, 2002) и на конференции "Chemical Probes in Biology" (Island of Spetses, Greece, 2002).
1.7. Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста и иллюстрированы 24 рисунками.
Роль МАР-киназных каскадов в контроле клеточного цикла
В быстро и часто меняющихся условиях окружающей среды клетка должна достаточно быстро реагировать на внешние сигналы, детектируемые мембранными рецепторами и белками. Обратимое фосфорилирование внутриклеточных регуляторных белков является основным механизмом, осуществляющим быструю передачу и модулирование таких сигналов. Пути передачи сигнала от клеточной мембраны к ядерным транскрипционным факторам часто организованы в системы сигнальных сетей, которые могут функционировать независимо или взаимодействовать. Каскады митоген активируемых протеинкиназ (Mitogene-Activated Protein (MAP) kinase) являются ключевым и наиболее общим механизмом передачи сигнала в клетке. Ядро этих каскадов состоит из трех, последовательно активируемых, протеинкиназ. Для каталитической активации МАР-киназы (МАРК) необходимо фосфорилирование консервативных остатков тирозина и треонина киназой МАР-киназы (МАР2К/МАРКК/МЕК) с двойной специфичностью. МАР2К в свою очередь активируется фосфорилированием консервативных остатков серина и треонина серин/треониновой киназой киназы МАР-киназы (МАРЗК/МАРККК/МЕКК). Активирование (фосфорилирование) МАР-киназы способствует ее транслокации в ядро, где она модулирует активность соответствующих транскрипционных факторов, что приводит к сигнал-зависимым изменениям экспрессии генов (Treisman, 1996; Wilkinson and Millar, 1998).
Наиболее изученными МАР киназами являются киназы семейства ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase), которые принимают участие в передаче сигнала, проходящего через связанный с мембраной белок Ras. Белок Ras является важным эффектором различных мембранных рецепторов. Он активирует несколько сигнал-передающих каскадов, однако определяющим эффектором Ras является серин/треониновая киназа Raf (Moodie and Wolfman, 1994), которая фосфорилирует и активирует две МАРК киназы (МАРКК) -МЕК1 и МЕК2 (Crews and Erikson, 1993). МЕК киназы в свою очередь фосфорилируют по остаткам тирозина и треонина две МАР-киназы ERK1 и ERK2.
Второй класс МАР-киназ, представленный двумя подсемействами: JNK (c-Jun Nerminal kinase) и р38, активируется в ответ на цитокины, различные стрессорные и ДНК-повреждающие воздействия, а также ингибиторы белкового синтеза (Derijard et al., 1994; Galcheva-Gargova et al., 1994; Han et al., 1994). Эти, активируемые стрессом, МАР-киназы (SAPK, stress-activated МАРл kinases) участвуют в контроле многих процессов в клетке, включая пролиферацию, апоптоз, ответ на стресс и синтез воспалительных цитокинов.
В клетках млекопитающих внешние сигналы способны влиять на машину регуляции клеточного цикла главным образом в фазе G1. После прохождения G1 -точки рестрикции клетки становятся невосприимчивыми к внешним сигналам и коммитированы к завершению полного митотического цикла даже в отсутствие митогенных сигналов (Pardee, 1989). При этом в некоторых типах клеток, нормально пролиферирующих, независимо от внешних митогеных сигналов (например, при дроблении у эмбрионов шпорцевой лягушки или дрозофилы), обычно отсутствуют (или присутствуют в крайне низких количествах) циклины D-типа (Dl, D2, D3) (Sherr and Roberts, 1999). Поэтому, киназный комплекс, содержащий циклин D, по-видимому, является основной мишенью среди регуляторов клеточного цикла для модуляции внешними сигналами. Следовательно, основной задачей митоген-зависимых путей передачи сигнала во время перехода G1/S является регуляция активности этого киназного комплекса, что и определяет главные функции МАР-киназных путей в регуляции клеточного цикла.
Киназы ERK, JNK и р38 принимают непосредственное участие в контроле синтеза циклина Dl (Albanese et al., 1995; Lavoie et al., 1996). Экспрессия гена, кодирующего циклин Dl, регулируется в основном связывающимися с определенными элементами в промоторе гена транскрипционными факторами АР-1 и ETS (Albanese et al., 1995; Peeper et al., 1997; Kerkhoff and Rapp, 1997; Wisdom et al., 1999; Lavoie et al., 1996), активность которых модулируется МАР-киназами. МАР-киназы потенцируют активность транскрипционного комплекса АР-1, активируя экспрессию генов, кодирующих компоненты АР-1: белков семейства Fos и Jim (Treisman, 1996). Во-вторых, для стабилизации белков и увеличения транс-активационных свойств комплекса АР-1 необходимо фосфорилирование его компонентов МАР-киназами (Karin, 1995; Gruda et al., 1994). Более того, Ras/ERK киназный путь позитивно регулирует сборку и каталитическую активность циклин-киназных комплексов: образование комплекса вновь синтезированного циклина D1 с циклин-зависимой киназой Cdk4 зависит от активности Ras/ERK-киназного каскада (Peeper et al., 1997). ERK, опосредующие этот процесс, пока не идентифицированы. Ядерная локализация и активация циклин-зависимой киназы Cdk2 также зависит от фосфорилирования ERK киназой. Подавление активности MEK/ERK-киназного пути специфическим ингибитором PD98059 предотвращает активацию и ядерную локализацию Cdk2, а также переход в фазу S клеточного цикла некоторых типов клеток (Blanchard et al., 2000; Chiariello et al., 2001; Hoshino et al., 2001; Milella et al., 2001).
Синтез ингибиторов циклин-киназных комплексов также непосредственно модулируется ERK киназами. Стимуляция голодающих клеток факторами роста приводит к переходу клеток из состояния покоя к пролиферации. Это сопровождается временной экспрессией ингибитора циклин-киназных комплексов p21/Wafl, зависящей от активности киназы ERK. Ингибирование MEK/ERK-киназного пути предотвращает накопление p21/Wafl в клетке (Bottazzi et al., 1999). Иначе регулируется уровень другого ингибитора циклин-зависимых киназ p27/Kipl в клетке. Фосфорилирование p27/Kipl комплексом циклин E/Cdk2 способствует его протеолитической деградации в конце фазы G1, что освобождает комплекс циклин E/Cdk2 от ингибирующего воздействия p27/Kipl (Sheaff et al., 1997; Montagnoli et al., 1999). MEK/ERK-киназный путь также способен фосфорилировать p27/Kipl in vitro, что приводит к диссоциации p27/Kipl от циклин-киназного комплекса и его деградации (Sheaff et al., 1997), а ингибирование MEK/ERK пути приводит к накоплению белка p27/Kipl, что сопровождается остановкой пролиферации клеток на границе Gl/S (Takuwa and Takuwa, 1997; Milella et al., 2001; Hoshino etal.,2001).
Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла
Распределение клеток по содержанию ДНК изучали методом проточной цитофлуориметрии (Розанов, 1988).
Для однопараметрического анализа (анализа содержания ДНК) клетки снимали с чашек раствором Версена, промывали 3 раза раствором PBS (0.14 М NaCl, 2.7 мМ КС1, 6.5 мМ Na2HP04, 1.5 мМ КН2Р04, рН 7.2), пермеабилизовали с использованием сапонина (Sigma) в конечной концентрации 0.01% в течение 0.5 ч при комнатной температуре и многократно отмывали от сапонина раствором PBS. Затем добавляли РНКазу А (100 мкг/мл), иодид пропидия (10 мкг/мл) (ICN), инкубировали 15 мин при 37С и анализировали на проточном цитофлуориметре АТС300 (Brucker).
Для иммунопреципитации клетки промывали раствором PBS и лизировали в буфере CEWIPI, содержащем 10 мМ трис-НС1, рН 7.4; 150 мМ NaCl; 0.5% NP-40; 1% тритон Х-100, а также ингибиторы протеаз (1 мМ PMSF, леупептин, пепстатин А, апротинин (все Sigma) в концентрации 10 мкг/мл) и ингибиторы фосфатаз (1 мМ ортованадат натрия, 5 мМ EGTA (Serva), 10 мМ фторид натрия). Клеточные лизаты иммунопреципитировали соответствующими антителами при +8С с перемешиванием (в течение 2 ч или ночи). К пробам добавляли по 50 мкл 10% суспензии протеин А-сефарозы (Boehringer) и продолжали инкубировать еще 1 ч при +8С с перемешиванием. После инкубации суспензию центрифугировали (0С, 1.5 тыс. об/мин, 5 мин). Преципитаты дважды промывали в 200 мкл буфера для выделения клеточных экстрактов с ингибиторами протеаз и фосфатаз (CEWIPI), осаждали на центрифуге (0С, 1.5 тыс. об/мин, 5 мин.) и удаляли надосадочную жидкость. После этого иммунные комплексы, сорбированные на протеин А-сефарозе, использовали, как источник киназ в реакции фосфорилирования in vitro, или суспендировали осадок в 20 мкл буфера CEWIPI, добавляли равный объем 2 буфера для проб (250 мМ трис-HCl, рН 6.7; 6% SDS; 20% глицерин; 8% 2-меркаптоэтанол; 0.25% бромфеноловый синий), кипятили 5 мин и разделяли белковые комплексы электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) для последующего анализа методом иммуноблотинга.
Клеточные экстракты получали в присутствие буфера, приготовленного на основе натрий-калий-фосфатного буфера (PBS) и содержащего 1% NP-40 (Sigma), 0.5 % дезоксихолат натрия, 0.1% додецилсульфат натрия (SDS), ингибиторы протеаз (IMMPMSF, леупептин, пепстатин А, апротинин (все Sigma) в концентрации 10 мкг/мл) и фосфатаз (1 мМ ортованадат натрия, 5 мМ EGTA (Serva), 10 мМ фторид натрия). Концентрацию белка в экстрактах определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976) и уравнивали пробы по количеству белка между собой. Белки разделяли электрофорезом в 10-12% ПААГ на трис-глициновом буфере в присутствии 0.1% SDS. В качестве маркеров молекулярного веса использовали окрашенные белки (Novex). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) в течение ночи при +8С в аппарате для электроблотинга при Iconst=100 mA. Т-буфер для переноса белков содержал 25 мМ трис, 192 мМ глицин (рН 8.3), 0.1% SDS, 20% (V/V) метанол. Для предупреждения неспецифической сорбции мембраны со связанными на них белками несколько раз промывали в PBST (PBS с 0.5% Tween 20) и 1 раз в течение 30-120 мин в 5% обезжиренном молоке, приготовленном на PBST. После этого мембраны инкубировали в PBST, содержащем 1% BSA и соответствующие специфические антитела (в течение 2 ч или ночи) при +8С. Мембраны отмывали 3 раза по 5 мин в PBST и инкубировали 1 час в PBST с 5% молоком, содержащим вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, при комнатной температуре. Мембраны промывали три раза по 10 мин в PBST. Белки на мембранах выявляли методом усиления хемолюминесценции (ECL), согласно инструкции фирмы-производителя (Sigma) или SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce), и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре. Компоненты ECL-смеси (Sigma): 1.25 мМ люминол, 0.1 М трис-НС1 (рН 8.5), 6.8 мкМ раствор кумаровой кислоты в DMSO (диметилсульфоксид), 0.02% Н202.
В качестве специфических антител использовали антитела к белкам Elk-1, Sap-1, Net, Net-b, любезно предоставленные Б. Василиком. Антитела к С-концевому транс-активирующему домену белка Elk-1, содержащему области фосфорилирования МАР-киназами, получали также путем иммунизации кролика слитым белком GST-Elk-C, выделенным из трансформированных соответствующей плазмидой pGEX-Elk-C бактерий E.coli (штамм BL21) по процедуре (Fernandes, 1995). Далее эти антитела были очищены из сыворотки преципитацией сульфатом аммония (Sambrook,1989) и затем хромотографией на колонке с протеин G-сефарозой (Pharmacia) согласно протоколу фирмы Upstate Biotechnology. Также были использованы антитела к нефосфор илированным формам киназ ERK1, JNK1, р38, их фосфорилированным формам: pERK, pJNK, рр38, к фосфорилированной форме транскрипционного фактора Elk-1 (все Santa Craz). В работе также использовались антитела к гемаглютинину (Boehringer) и к деацетилазе гистонов HDAC1 (Upstate Biotech.). Для анализа регуляции клеточного цикла были использованы антитела против циклинов А, В, D1, Е, циклин-зависимых киназ Cdk2, Cdk4 и против ингибиторов клеточного цикла p21/Wafl и p27/Kipl (Santa Cruz). В качестве вторых антител были использованы антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, антитела козла против иммуноглобулинов кролика или антитела осла против иммуноглобулинов козла.
Содержание киназ ERK, INK и р38 в трансформантах ElA+cHa-ras повышено по сравнению с клетками REF52
Решающие шаги клеточного цикла в основном контролируются через регуляцию транскрипции ряда специфических генов. Трансформация клеток онкогенами нарушает нормальную картину экспрессии генов, продукты которых контролируют клеточную пролиферацию. Известно, что при трансформации клеток грызунов онкогенами ElA+cHa-ras происходит дерегуляция активности транскрипционного комплекса АР-1 и изменение экспрессии его компонентов: транскрипция протоонкогена c-fos подавлена, а c-jun экспрессируется на высоком, нерегулируемом сывороткой уровне (Pospelova et al., 1999). Ответ этих генов на индукцию сывороткой определяется специфическими регуляторными элементами в промоторных областях генов: элементы АР-1 в промоторе гена c-jun, SRE и АР-1 регуляторные элементы в промоторе гена c-fos (Hill et al., 1995). Изменение экспрессии генов, кодирующих компоненты комплекса АР-1, может привести к изменению экспрессии генов-мишеней АР-1. Поэтому нас заинтересовал вопрос, каким образом меняется экспрессия Fos/Jun-регулируемых генов в клетках, лишенных гетеродимера Fos/Jun, а также меняется ли подобным образом транскрипция генов, регулируемых через те же регуляторные элементы, что и c-fos и c-jun. Гены fra-1 и cyclinDl, как и c-jun, являются АР-1-регулируемыми генами (van Dam and Castellazzi, 2001), а ген раннего ответа egr-1, так же как и c-fos, регулируется через сывороточные элементы SRE (Mora-Garcia and Sakamoto, 2000).
Методом RT-PCR с праймерами к кодирующим областям генов мы исследовали кинетику транскрипции протоонкогенов c-fos и c-jun, а также генов fra-1, cyclinDl и egr-1 в клетках REF и ElA+cHa-ras, стимулированных сывороткой. Стимуляция покоящихся нормальных клеток REF приводит к активации транскрипции генов раннего ответа c-fos, c-jun, egr-1 и fra-1. Содержание транскриптов этих генов от низкого базального уровня в голодающих клетках (рис. 8, А, дорожка 1) увеличивается при добавлении сыворотки и достигает максимума через 45-60 минут (рис. 8, А, дорожки 3, 4). Затем происходит включение механизмов подавления транскрипции многих генов раннего ответа. Через 2 часа сывороточной стимуляции уровень экспрессии c-fos значительно падает. Количество транскриптов гена c-jun и egr-І также начинает снижаться через 2 часа после стимуляции (рис. 8, А, дорожка 5), а транскрипция гена раннего ответа fra-І, достигнув максимума, сохраняется на этом уровне достаточно долго (рис. 8, А, дорожка 5). Известно, что транскрипты fra-І можно обнаружить в клетках даже через 16 часов после стимуляции (Lallemand et al., 1997). Экспрессия другого гена, регулируемого через элемент АР-1, cyclinDl не изменяется в исследуемых временных рамках. Это соответствует литературным данным о том, что сыворотка вызывает увеличение содержания мРНК гена cyclinDl от достаточно высокого начального уровня только через 8-12 часов после стимуляции (Won et al., 1992). В целом картина экспрессии исследованных генов соответствует данным, полученным на других нормальных клетках (Pospelova et al., 1999, Won et al., 1992, Muller et al., 1984).
Трансформация клеток REF онкогенами ЕІА+сНа-ras приводит к постоянно высокому уровню экспрессии генов c-jun, fra-1, cyclinDl и egr-1. Стимуляция голодающих трансформированных клеток не вызывает значительных изменений высокого базального уровня транскрипции этих генов (рис. 8, Б). Исключение составляет транскрипция протоонкогена c-fos. В клетках, трансформированных онкогенами ЕІА+сНа-ras, транскрипция c-fos находится под сильным негативным контролем: добавление сыворотки также приводит к активации транскрипции гена c-fos, но уровень содержания транскриптов гораздо ниже, чем в нормальных клетках (рис. 8, Б).
Таким образом, репрессия гена c-fos в клетках ЕІА+сНа-ras не приводит к подавлению транскрипции Fos/Jun-регулируемых генов fra-І и cyclinDl. Возможно, что это следствие замещения белка c-Fos на Fra-І в составе комплекса АР-1. Известно, что гетеродимер Fra-1 /Jun связывается с теми же последовательностями ДНК, как и гетеродимер c-Fos/Jun (Cohen et al., 1989). Следовательно, разные транскрипционные факторы семейства АР-1 могут проявлять отличающиеся и специфические функции в транскрипционном контроле в зависимости от контекста конкретного промотора.
При стимуляции покоящихся нормальных клеток ростовыми факторами сыворотки происходит кратковременная активация транскрипции гена c-fos, после чего включаются механизмы подавления его экспрессии, так называемая рефрактерная стадия. В нормальных клетках сывороточная индукция транскрипции гена c-fos, опосредована через элемент SRE, с которым постоянно связаны транскрипционные факторы тройного комплекса SRF/SRF/TCF (Hill et al., 1995). Как известно, белки семейства TCF являются позитивными регуляторами транскрипции. Для транскрипционной активации необходимо фосфорилирование белков TCF MAP киназами ERK, JNK или р38 (Giovane et al., 1997, Clarke et al., 1998). Используя клетки ЕІА+сНа-ras со стабильно интегрированными в геном репортерными конструкциями fos-CAT, содержащими мутации в элементе SRE, ранее было показано, что репрессия промотора c-fos связана именно с этой областью (Pospelova et al., 1999). Таким образом, негативная регуляция fos-промотора в трансформантах ElA+cHa-ras может быть обусловлена формированием неактивных для инициации транскрипции комплексов в области SRE.
Одним из возможных путей формирования неактивных для инициации транскрипции комплексов на элементе SRE промотора гена c-fos может быть замещение позитивных транскрипционных факторов TCF в составе тройных комплексов на репрессорные белки того же семейства, такие как Net-b (Giovane et al., 1997) или Sap-lb (Treisman, 1994). Методом иммуноблотинга с поликлональными антителами против белков TCF мы анализировали содержание транскрипционных факторов этого семейства в нормальных клетках REF и в трансформантах ElA+cHa-ras в условиях голода при низком содержании сыворотки и при кратковременной стимуляции (30 мин).
MEK/ERK-киназный каскад является доминирующим в фосфорилировании белка Elk-1 в трансформантах ElA+cHa-ras
Почти все идентифицированные ингибиторы HDAC вызывают ряд антипролиферативных эффектов, включая индукцию G1/S и G2/M блоков клеточного цикла и дифференцировку (Yoshida et al., 1995, Gottlicher et al., 2001) или апоптоз (Medina et al., 1997) в трансформированных клетках. Во многих работах показано, что блоки клеточного цикла, вызванные NaB, связаны с измененным характером экспрессии генов и онкогенов, вовлеченных в клеточную пролиферацию (Krupitza et al., 1996, Smith et al., 1998). В эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами ЕІА+сНа-ras, NaB изменяет характер экспрессии ряда важных пролиферативных генов, включая гены раннего ответа c-fos, c-jun и fra-1, кодирующие транскрипционный фактор АР-1, а также экспрессию циклина D1. Поэтому нас заинтересовал вопрос, может ли NaB вызывать антипролиферативный эффект в ElA+cRa-ras трансформированных клетках, которые не способны реализовывать блоки клеточного цикла в условиях голода и при действии ДНК-повреждающих агентов.
Для того чтобы выяснить влияние ингибитора гистоновых деацетилаз на пролиферацию трансформантов ElA+cHa-ras, методом проточной цитофлюориметрии мы проанализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла до и после обработки бутиратом натрия. Трансформанты ElA+cHa-ras культивировали в среде без NaB, или содержащей NaB в разных концентрациях в течение 16 ч. Мы показали, что NaB вызывает остановку клеток ElA+cHa-ras в контрольных точках G1/S и G2/M клеточного цикла. Ингибирующее действие NaB на пролиферацию растет с повышением концентрации (рис. 19): рост клеток ElA+cHa-ras подавляется уже при концентрации NaB 0.5 мМ, а полное ингибирование достигается при концентрации 4 мМ. Уменьшение количества клеток в фазе S и накопление на границах фаз G1/S и G2/M начинается через 6 часов после добавления ингибитора в среду культивирования, а полная остановка наблюдается через 16 часов (рис. 20). Ингибитор HDAC бутират натрия при этом не изменяет экспрессию онкогенов AU5E1A и cHa-ras в трансформантах ElA+cHa-ras (результаты не представлены), из чего можно заключить, что бутират натрия способен останавливать пролиферацию клеток, трансформированных онкогенами Е1А и cHa-ros, обходя и/или нейтрализуя функции вирусных и клеточных онкобелков.
Ранее было показано, что трансформанты ElA+cHa-ras не останавливаются в клеточном цикле при действии ДНК-повреждающих и стресс-факторов (гамма-облучение, адраимицин, сывороточное голодание (Bulavin et al., 1999)). Представленные выше данные свидетельствуют о том, что клетки ElA+cHa-ras способны к блокам G1/S и G2/M после обработки ингибитором гистон-деацетилазной активности бутиратом натрия.
NaB не вызывает апоптоза в трансформантах ElA+cHa-ras. Ингибиторы гистоновых деацетилаз (NaB, TSA и др.) способны вызывать апоптотическую гибель некоторых типов трансформированных клеток (Medina et al., 1997, Finzer et al., 2001). Мы анализировали характер ответа клеток на NaB: сопровождается он остановкой или апоптотической гибелью. Исследования показали, что трансформанты ElA+cHa-ras, обработанные NaB, не гибнут в результате апоптоза. Об этом свидетельствует отсутствие олигонуклеосомной фрагментации ДНК, характерной для апоптотической гибели, после обработки NaB клеток ElA+cHa-ras в течение 20 ч (рис. 21, А). Морфология ядер, выявляемая при окраске флюорохромом DAPI, также не изменяется (рис. 21, Б).
Таким образом, действие ингибитора гистон-деацетилазной активности бутирата натрия приводит не к апоптотической гибели трансформантов ElA+cHa-ras, а к остановке клеточного цикла в контрольных точках.
Бутират натрия, являясь ингибитором HDAC, изменяет транскрипцию HDAC-зависимых генов, через которые осуществляется контроль клеточного цикла. Для того чтобы выяснить причины остановки трансформантов ElA+cHa-ras, вызванной NaB, мы исследовали экспрессию регуляторов клеточного цикла: циклинов, циклин-зависимых киназ и ингибиторов циклин-киназных комплексов.
Для прохождения клеток по клеточному циклу необходима активация различных комплексов циклинов с циклин-зависимыми киназами и фосфорилирование ими своих мишеней. Во время перехода G1/S последовательно активируются соответствующие комплексы циклин/циклин-зависимых киназ. Инициация и начало фазы G1 контролируется комплексами киназы Cdk4 (Cdk6) с циклином D1. Для активации генов, необходимых для синтеза ДНК, требуется формирование активных комплексов киназы Cdk2 с циклином Е - середина и поздняя фаза G1 (переход G1/S) и с циклином А в период поздней G1 и прогрессии фазы S (Sherr, 1993). При переходе к митозу необходима активация комплекса циклина В и киназы Cdkl/2 (Elledge et al., 1996).
В экспоненциально растущих трансформантах ElA+cHa-ras наблюдается высокий уровень экспрессии генов, кодирующих циклины D1 и Е, как на уровне мРНК, определяемом методом RT-PCR, (рис. 22, А, дорожка 1), так и на уровне белка, определяемом методом иммуноблотинга с соответствующими антителами (рис. 22, Б, дорожка 1). Добавление NaB к трансформантам приводит к подавлению экспрессии этих генов. Уже через 6 часов обработки ингибитором уровень содержания транскриптов значительно снижается и становится практически недетектируемым через 16 часов, что коррелирует по времени с максимальным уменьшением содержания трансформантов в фазе S клеточного цикла (рис. 19). Содержание циклин-зависимых киназ Cdk2 и Cdk4 также снижается через 16 ч обработки трансформантов NaB (рис.22, Б).
Транскрипция гена, кодирующего фосфатазу cdc25A, которая осуществляет активирующее дефосфорилирование циклин-зависимой киназы Cdk2, также значительно падает через 16 часов после добавления NaB к трансформантам (рис. 22, А).
Для прохождения контрольной точки G2/M необходима активация комплексов CyclinA/Cdc2 и CyclinB/Cdc2 (рис. 1, А). Анализ содержания белков, формирующих эти комплексы, показал, что в трансформантах ЕІЛ+сНа-ras, обработанных NaB, количество циклина А значительно падает, по сравнению с необработанными клетками, а циклина В несколько увеличивается. Количество киназы Cdc2 заметно не изменяется после обработки NaB (рис.22, Б).
