Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Интеграция чужеродной ДНК в геном клеток млекопитающих 11
1.2 Вопрос об экстрахромосомном существовании пДН К у млекопитающих.. 14
1.3 Нестабильность интеграции чужеродной ДНК 16
1.3.1 Нестабильность интеграции вирусной ДНК 16
1.3.2 Нестабильность интеграции плазмидной ДНК 18
1.3.3. Влияние копийности на интеграцию ДНК 22
1.3.4 Влияние метилирования на интеграцию ДНК 23
1.3.5. Проявление генетической нестабильности интегрированных ДНК на модели трансгенных мышей 25
1.4. Наиболее вероятный механизм нестабильности чужеродной ДНК - рекомбинация 27
1.4.1. Гомологичная рекомбинация 27
1.4.2. Гомологичная рекомбинация и таргетинг генов 31
1.4.3. Различные проявления негомологичной рекомбинации 35
1.5. Молекулярные механизмы ре комбинационных явлений 38
1.5.1. Строение и биохимические свойства белка RecA 38
1.5.2. Распространение семейства RecA-подобных белков 40
1.5.3. Гомологи белка RecA у эукариот и их функции 42
1.5.4. Другие белки, взаимодействующие с RecA/Rad51, и необходимые для рекомбинации 46
1.5.5. Белки SSB и RPA 48
1.5.6. Белок Rad54 50
1.5.7. Белки BRCA1 и BRCA2 51
1.5.8. Другие белки, способствующие рекомбинации 52
1.5.9. Оверэкспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих 53
1.5.10. Белки, осуществляющие негомологичное воссоединение концов ДНК 54
1.5.11. Изменения в структуре хроматина, происходящие во время негомологичного воссоединения концов ДНК 56
Глава 2. Материалы и методы 59
2.1. Культуры клеток 59
2.2. Плазмиды, использованные в работе 59
2.3. Электропорация; получение и селекция TlC клеток линии А23 60
2.4. Анализ наличия трансгенной ДНК в клетках 61
2.4.1. Выделение ДНК 61
2.4.2. Подготовка геномной ДНК для использования в качестве вектора для трансфекции 62
2.4.3. Анализ методом ПЦР 63
2.4.4. СеквенированиеДНК 63
2.5. Анализ экспрессии гена тимидинкиназы вируса герпеса 64
2.6. Получение и анализ клонов клеток млекопитающих, экспрессирующих белок RecA 64
2.6.1. Вестерн-блот 65
2.6.2. Comet assay 67
2.7. Статистическая обработка результатов 68
Глава 3. Результаты исследования 69
3.1. Изучение феномена нестабильности 69
3.2. Доказательства действительности потери чужеродной ДНК из генома культивируемых клеток линии А23 79
3.3. Проявление нестабильности интеграции чужеродной ДНК различных плазмидных конструкций на разных клеточных линиях 85
3.4. Поиск и исследование факторов, влияющих на нестабильность 87
3.4.1. Облучение у-радиацией 87
3.4.2. Влияние усиления гомологичной рекомбинации за счет экспрессии бактериального белка RecA 89
3.4.2.1. Получение клеточных линий, экспрессирующих RecA 89
3.4.2.2. Проверка наличия гена RecA в трансфецированных клетках и его экспрессии 91
3.4.2.3. Проверка работоспособности белка RecA в эукариотических клетках: .облучение и Comet assay 95
3.4.2.4. Нестабильность чужеродной пДНК в клетках, экспрессирующих RecA 101
3.4.3. Конструирование плазмиды, содержащей последовательности флангов интеграции, и ее анализ 103
3.4.3.1. Стратегия получения плазмиды, содержащей фланги места интеграции в геном плазмиды р16 103
3.4.3.2. Выбрасывание из генома клеток линии А23
ДНК "вторичной " плазмиды р42 33 106
3.4.3.3. Определение нуклеотидной последовательности флангов места интеграции в геном первоначальной плазмиды 109
Глава 4. Обсуждение 110
Выводы 120
Список цитируемой литературы
- Нестабильность интеграции вирусной ДНК
- Электропорация; получение и селекция TlC клеток линии А23
- Получение и анализ клонов клеток млекопитающих, экспрессирующих белок RecA
- Доказательства действительности потери чужеродной ДНК из генома культивируемых клеток линии А23
Введение к работе
Актуальность проблемы:
Геном клеток высших эукариот находится под постоянным риском инвазии чужеродной ДНК. In vivo клетки млекопитающих продолжительное время контактируют с различными бактериями, вирусами и фрагментами их ДНК, что предполагает возможность горизонтального переноса генетической информации. В действительности, свидетельства о захвате и сохранении бактериальной ДНК в геноме млекопитающих достаточно ограничены (Scrable, Stambrook 1999; Doerfler et al., 2001). Практическое отсутствие остатков фрагментов бактериальной ДНК в геноме млекопитающих дают основания для предположения о наличии в их клетках высокоэффективной системы по защите собственного генома от приобретения нежелательной чужеродной ДНК. Экспериментально доказать наличие таких систем достаточно сложно, и исследования в этой области находятся на начальной стадии (Awadala, 2003). Несмотря на то, что подобные защитные системы были описаны для бактерий, простейших (Selker, 2003; Yao et al., 2003) и растений (Matzke et al., 2000), об их существовании у млекопитающих свидетельствуют лишь немногочисленные отрывочные данные (Hemmi et al., 2000; Pravtcheva, Wise, 2003; Pipes et al, 2005).
Знание подобных аспектов стабильности генома особенно важно в случаях направленного введения в клетки высших эукариот желательных фрагментов ДНК, таких как геномные исследования, генная терапия, получение трансгенных животных и т.д. (Smith, 2004).
В сфере медицинских исследований большое значение имеет вопрос об особенностях интеграции в геном соматических клеток человека вирусов, в том числе и онкогенных. Кроме достаточно хорошо изученного момента интеграции вирусной ДНК в клеточный геном, остаётся плохо понятной
дальнейшая судьба вирусной ДНК и ее взаимоотношения с системами поддержания стабильности генома (Doerfier et al., 1997).
Хорошо известно, что мутационные или делеционные события в резидентных генах клеток млекопитающих достаточно редки и, как правило, происходят с частотами не выше 1 на 1 000 000 клеточных делений, часто приводя к злокачественному перерождению клетки (Kopnin, 2000). Спонтанная же потеря гена в популяции перевиваемых клеток представляет собой практически невероятное событие. В то же время, есть достаточно старые наблюдения, что интегрированные в геном культивируемых клеток млекопитающих экзогенные плазмидные ДНК, несущие селективные гены, могут быть потеряны с частотами, варьирющими от 1 на 100 до 1 на 1000 000 на клеточное деление (Sandri-Goldin et al., 1981; Глебов, Абрамян, 19856). Отмечается, что при культивировании часто наблюдается спонтанная потеря искусственно интегрированных в геном селективных маркеров в процессе роста клеточных популяций. Возникает необходимость поиска объяснения наблюдаемому феномену удаления встроившейся чужеродной ДНК из генома клеток млекопитающих.
На начальной стадии исследования было предложено две основных гипотезы, объясняющие это явление:
1) Клетка млекопитающих может "узнавать" и удалять места
интеграции чужеродной ДНК с помощью механизмов гомологичной
рекомбинации за счет взаимодействия с гомологичной хромосомой или
хроматидой;
2) Основное влияние на стабильность интегрированного в геном
трансгена оказывают нуклеотидные последовательности флангов,
окружающих сайт внедрения чужеродной ДНК в хромосому.
Цель исследования:
Целью данного исследования является демонстрация явления нестабильности интеграции чужеродной ДНК в геном соматических клеток
млекопитающих на модели культур клеток, количественная характеристика этого явления для линии клеток китайского хомячка А23, поиск и изучение факторов, влияющих на удаление чужеродной ДНК из генома клеток млекопитающих.
Задачи исследования:
1) на модели культуры соматических клеток китайского хомячка А23
продемонстрировать и количественно охарактеризовать феномен
нестабильности интегрированной в геном плазмидной ДНК;
2) с помощью метода ПЦР доказать действительную потерю
интегрированных последовательностей ДНК из генома клонов клеток,
характеризующихся подобной нестабильностью;
3) продемонстрировать функциональность модифицированного
бактериального белка RecA в клетках исследуемых линий;
4) рассмотреть влияние возможного усиления гомологичной
рекомбинации на стабильность интегрированной чужеродной ДНК на
примере введения в соматические клетки млекопитающих бактериального
белка RecA;
5) разработать подход для анализа областей генома, окружающих место
интеграции плазмиды, попытаться определить роль влияния фланговой
геномной ДНК на стабильность интегрированной чужеродной ДНК.
Научная новизна:
На модели культур клеток продемонстрирован и впервые количественно описан феномен потери интегрированной чужеродной ДНК. Выявлено, что основным фактором, влияющим на такую нестабильность, являются фланги хромосомной ДНК, окружающие место интеграции плазмиды.
Показано, что бактериальный белок RecA, модифицированный сигналом ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV40, а также гиперрекомбиногенный белок RecA-X53, экспрессированные в клетках
млекопитающих, функционально активны и приводят к некоторому уменьшению повреждений ДНК после облучения. Данная картина визуализирована методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (Comet assay). Установлено, что усиление процессов гомологичной рекомбинации с помощью экспрессии этих белков практически не влияет на нестабильность трансгенов.
Разработан оригинальный подход конструирования «вторичной» плазмиды, содержащей участки генома клетки китайского хомячка вокруг места интеграции первоначальной плазмиды.
Теоретическое и практическое значение результатов работы:
Полученные данные о нестабильности интеграции плазмидной ДНК в геном культивируемых клеток млекопитающих говорят о существовании в клетках высших эукариот пока до конца неизвестных механизмов защиты генома от инвазии чужеродной ДНК. Хотя предположения о существовании подобных систем у эукариот существуют достаточно давно, а их работе у растений посвящен целый выпуск журнала "Nature" (Dangl, Jones, 2001; Waterhouse et al., 2001), об их действиях по защите генома млекопитающих свидетельствуют только единичные отрывочные данные (Doerfler et al., 2001). Данное исследование говорит о необходимости дополнительного изучения систем поддержания стабильности генома и репарации у млекопитающих.
Это приобретает особую актуальность в случаях удаления из генома интегрированной ДНК провирусов, а также в случаях генной терапии различных заболеваний. Хотя данное исследование проведено на культурах клеток, явление нестабильности введенной ДНК проявляется и на трансгенных животных (Scrable, Stambrook, 1999; Pravtcheva, Wise, 2003), что также необходимо учитывать при проведении соответствующих экспериментов.
Кроме того, настоящая работа нарушает "классическую" концепцию, согласно которой трансген после интеграции в геном рассматривается как часть хозяйской хромосомной ДНК, неотличимой от собственных генов организма.
Разработана стратегия оценки степени нестабильности в динамике во время культивирования клеток млекопитающих in vitro.
Положения, выносимые на защиту:
На модели культуры клеток А23 и плазмиды р 16 наблюдается явление направленного удаления чужеродной ДНК, предварительно интегрированной в геном.
Попытки усилить ГР в клетках исследуемых линий с помощью экспрессии бактериального белка RecA не приводят к существенным изменениям нестабильности интегрированных чужеродных генов.
С помощью оригинального подхода по определению влияния нуклеотидной последовательности флангов геномной ДНК, окружающих места интеграции плазмиды, на стабильность существования чужеродной плазмидной ДНК в геноме соматических клеток млекопитающих демонстрируется возможность зависимости судьбы чужеродной ДНК от места ее интеграции в геном.
Нестабильность интеграции вирусной ДНК
Явление нестабильной интеграции чужеродной ДНК в геном первоначально было отмечено при изучении механизмов внедрения вирусной ДНК (Holmes-Son et al., 2001; Hejnar et al., 2003). Однако специальных исследований такой нестабильности не проводилось.
Существует достаточно много отрывочных данных, упоминающих о нестабильной интеграции последовательностей вирусных ДНК в геном. Так, при изучении мест интеграции в геном различных клеток ДНК вируса SV40 и аденовируса 2 не было найдено специфических сайтов интеграции, при этом отмечались частые амплификации и делеции вирусной ДНК после трансформации (Sambrook et al., 1980). Отмечено, что при интеграции вируса полиомы в клетки крысы происходят множественные рекомбинационные события между вирусным и клеточным геномом. При этом вирусная ДНК часто вырезается, приводя к локальным делециям клеточного генома в сайте интеграции (Hayday et al., 1982). Единичные случаи нестабильности обнаружены при интеграции вируса SV40 в фибробласты человека (Yano et al., 1991). Позднее было проведено исследование интеграции вируса SV40 в геном культивируемых клеток с применением плазмидной конструкции, содержащей последовательности SV40: ориджин репликации, оба промотора, энхансер, ген большого Т антигена (Т Ag), а также ген устойчивости к G-418 NEO (Hunter, Gurney, 1994). Наибольшая нестабильность отмечена в областях NEO и Т Ag, при этом область ori и ранний контрольный участок оказались гораздо более устойчивы к делециям из генома.
Doerfler с коллегами (1997) на модели интеграции в геном культивируемых клеток китайского хомячка ДНК аденовируса 12 и бактериофага "к выделили следующие закономерности интеграции вирусной ДНК в геном клеток млекопитающих: 1) интеграция происходит мультикопийно, от 1 до 30 копий; 2) не обнаруживается свободной (эписомной) вирусной ДНК; 3) в некоторых случаях у вирусной ДНК происходит потеря до 200 нуклеотидов; 4) в хромосоме в месте интеграции может быть делитировано от 0 до нескольких тысяч пар нуклеотидов; 5) интеграция происходит преимущественно в случайные сайты; 6) часто наблюдается короткая, до 10-20 нуклеотидов, гомология между концами вирусной ДНК и флангами сайта интеграции; 7) компьютерный анализ показывает частое формирование структуры «изгиб-петля» в месте контакта; 8) интегрированная чужеродная ДНК очень быстро становится метилированной; 9) происходит изменение паттерна метилирования геномной ДНК на значительном (до 1000 п.н.) расстоянии от места интеграции; 10) интеграция, как правило, стабильна, но в любой момент может быть потеряна в результате действия неизвестных механизмов.
При применении различных методов трансфекции векторной ДНК в геном клеток млекопитающих во многих работах отмечалась нестабильная интеграция такой ДНК в хромосомы и неровная, часто пропадающая экспрессия вводимых генов (Etkin et al., 1984; Saxon et al., 1985; Hough-Evans et al., 1988; Culver, 1994; Kang et al., 1999; Рыбчин, 2002). Однако механизмы потери трансфецированной ДНК из генома и снижения уровня экспрессии чужеродных генов остаются неясными. Характеристики эффективности трансдукции, степени интеграции и длительности экспрессии различных методов трансфекции приведены в Таблице 1. Как видно из таблицы, длительная экспрессия возможна только в случаях применения при трансфекции вирусных носителей.
На сегодняшний день известна единственная работа, в которой показано существование в геноме соматических клеток сайтов как стабильной, так и нестабильной интеграции пДНК, причем сайты стабильной интеграции, по данным авторов, представлены значительно реже (Migliaccio et al., 2000). Нестабильные сайты характеризуются потерей встроенной пДНК к 60-250 поколению клеток, тогда как в стабильных сайтах интегрированная последовательность обнаруживается и транскрибируется на изначальном уровне и по истечение этого срока.
Электропорация; получение и селекция TlC клеток линии А23
ДНК из культивируемых клеток млекопитающих выделяли с использованием модифицированного метода Блина и Стаффорда, лизируя клетки саркозилом и расщепляя белки протеиназой К в присутствии ЭДТА (Херрингтон, Макги, 1999). Для этого сначала осаждали клетки в стеклянные пробирки для забора крови объемом 15 мл. Из флаконов, находящихся на экспоненциальной стадии роста сливали среду, клетки споласкивали 5 мл фосфатного буфера (ФБ) (рН 7,5), заливали 4 мл раствора Версена (ФБ + ЭДТА), оставляли на 5-Ю мин. при 37С, встряхивали, взвесь клеток переливали в пробирки и центрифугировали при 800 g в течение 5-Ю мин. Полученный осадок клеток рассуспендировали в 200 мкл ФБ и переносили в пробирки «эпендорф» объемом 1,5 мл. В каждую пробирку в итоге помещали 3 х 106 клеток (2-3 флакона).
На следующей стадии выделения ДНК клетки размораживали и к каждой пробе добавляли 1 мл лизирующего буфера следующего состава: саркозил - 50%, протеиназа К - 100 мкг/мл, РНКаза А - 30 мкг/мл. Пробы тщательно перемешивали пипетированием и оставляли на ночь при 37С.
Для дальнейшей обработки приготовляли насыщенный фенол и хлороформ-изопропанол по Sambrook et al., 1989, с изменениями. 50 мл фенола, перегнанного под аргоном, расплавляли и смешивали с равным объемом 0,5 М TrisHCl, рН 8,0, добавляли 100 мг 8-гидроксихинолина и 200 мг 3-меркаптоэтанола. После этого смесь перемешивали, давали отстояться 20 мин., и удаляли верхнюю фазу. Эту процедуру проводили 3 раза, после последней фенол оставляли покрытым тонким прозрачным слоем Tris. Хлороформ готовили, добавляя 1/24 объема изопропанола.
Получившийся в результате протеолиза гомогенный раствор последовательно обрабатывали 300 мкл фенола, затем 500 мкл смеси 1/1 фенола и хлороформа, затем 500 мкл хлороформа. После каждой экстракции (10 мин. при аккуратном перемешивании) смесь центрифугировали 15 мин, 3000 g, и отбирали водную фазу.
Подготовка геномной ДНК для использования в качестве вектора для трансфекции. При проведении опытов по вторичной трансфекции суммарной геномной ДНК клона 42 линии клеток А23 очищенную ДНК дробили воздействием ультразвука частотой 40 х 10 Гц в течение 10 сек. на приборе производства ОМРБ ПИЯФ РАН.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась по стандартной методике (Mullis, Fallona, 1987) по схеме: 1 цикл - 92С в течение 200 сек., 20 циклов - 92С - 60 сек., 58С - 90 сек., 73С - 120 сек., последний цикл 73С - 200 сек. на термоциклере производства ОМРБ ПИЯФ РАН. На каждую реакцию брали 100 нг обработанной ДНК, 0.2 мкМ нуклеотид трифосфатов, 2.8 мМ MgCl2, 50 мкг/мл BSA, 1 мкМ каждого из праймеров, 1 единицу Taq полимеразы.
Определение нуклеотидной последовательности части плазмиды р42_3-3, содержащей участки флангов места первоначальной интеграции, осуществляли по Сенджеру с использованием реактивов и оборудования фирмы «Хеликс Лимитед» (Санкт-Петербург). Был использован праймер P4233R5 -ACAAGCGCCCAGATAACAATG-3\
Анализ полученной нуклеотидной последовательности проводили с помощью программы BLASTN, входящей в пакет Vector NTI. 2.5. Анализ экспрессии гена тимидинкиназы вируса герпеса.
К культуральной среде добавляли бромдезоксиуридин (БДУ) до конечной концентрации 5-Ю мкг/мл. Через 12-24 ч. клетки снимали с флаконов, фиксировали этанолом, и обрабатывали в течение 20 мин. 4М соляной кислотой. Клетки инкубировали с моноклональными мышиными антителами против БДУ (ОМРБ ПИЯФ РАН) в разведении 1:500 фосфатным буфером (рН 7,5), промывали ФБ 5 раз по 10 мин и инкубировали с козьими антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с ФИТЦ (Promega) 1-4 ч при 4С. После 5 промывок ФБ по 10 мин клетки переносились на предметные стекла, накрывались покровными стеклами, и излишки буфера удалялись фильтровальной бумагой. Анализ и фотографирование препаратов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа OPTON Axiomat.
Оценка доли поделившихся за время инкубации клеток проводилась с помощью техники проточной цитофлуорометрии. При этом была использована методика, основанная на гашении флуоресценции связывающегося с клеточной ДНК красителя Hoechst 33258 за счет включившегося в ДНК при репликации бромдезоксиуридина (Kroll, 1984; Kubbies et al., 1985).
Получение и анализ клонов клеток млекопитающих, экспрессирующих белок RecA
Интеграция гена NEO в геном ведет к появлению клонов клеток, способных расти в присутствии G418. Интеграция же гена ТК HSV сообщает клеткам, дефектным по эндогенному гену тимидинкиназы, способность расти на среде HAT, но делает клетки чувствительными к такому аналогу природных нуклеозидов как ганцикловир. Такая ситуация реализуется только в случае встройки вводимой плазмидной ДНК в геном клеток - реципиентов. Данная конструкция, как и все подобного рода конструкции, не имеющие специальных вирусных ori репликации ДНК, не может сохраняться и работать в клетках млекопитающих в эписомном состоянии сколь либо долгое время. Она должна либо интегрироваться в клеточный геном, либо будет утрачена. Не интегрированные генные конструкции такого рода обычно утрачиваются клетками уже после нескольких делений (Тимченко и др., 1990). Таким образом, полученная конструкция позволяет вести отбор клеток, в геном которых она интегрировалась - по устойчивости к G418 и наоборот - вести среди этих интегрантов отбор клеток, потерявших ее, по устойчивости к ганцикловиру.
Селекция на среде HAT помогает удалять ревертантов по гену ТК в случаях, когда доля таких ревертантов приближается к 100%, но не достигает этого значения. В таких случаях сложно определить истинное значение реверсии визуальным подсчетом выживших на ганцикловире колоний. После зачистки на среде HAT (на 70-е сутки эксперимента) выживают только клетки, сохранившие ТК+ фенотип, они образуют колонии, число которых легко подсчитать.
Трансфекция плазмидной ДНК в клетки китайского хомячка линии А23 проводилась с помощью метода электропорации. Для каждого опыта бралось 200 000 клеток и 50-100 мкг плазмиды. После 48 часов культивирования в обычной среде, необходимого для экспрессии вводимых генов, производилась замена среды на селективную, содержащую 400 мкг/мл G418. Колонии, устойчивые к G418, вырастали с частотой порядка 1 на 10 000 посеянных клеток.
Полученные клоны клеток изолировали, подращивали и анализировали на чувствительность к ганцикловиру (4 мкг/мл) и на способность расти в среде HAT. Клоны не способные расти на HAT среде и (или) устойчивые к ганцикловиру исключали из дальнейшего рассмотрения, как с самого начала не содержащие ген ТК. Вероятно, в этих случаях происходила потеря гена ТК в процессе интеграции плазмиды (Henderson, Simon, 1997).
При использовании для трансфекции плазмид р16 и р39 никакой разницы в выходе устойчивых к G418 клеток и последующем появлении реверсий обнаружено не было. Все дальнейшие обсуждаемые результаты получены на модели А23-р16.
Помимо приобретения способности расти на среде HAT и чувствительности к ганцикловиру об экспрессии гена ТК HSV можно судить по включению трансформированными ТК+ и контрольными ТК- клетками аналога тимидина БДУ (бромдезоксиуридина) (Hamel et al., 2001). Это свойство позволило провести проверочные эксперименты по оценке эффективности функционирования ТК ВПГ в клетках исследуемой линии А23.
Включение БДУ регистрировали с помощью моноклональных антител к БДУ (Рис. 10 а) и по гашению флуоресценции красителя Hoechst 33342 регистрируемого с помощью проточной цитофлуорометрии (Рис. 10 б). Суть последнего метода состоит в том, что клетки, включившие БДУ в процессе репликации ДНК, флуоресцируют значительно слабее при окрашивании флуоресцентным красителем Hoechst 33342. В результате на гистограмме проточной цитофлуорометрии такие клетки после деления образуют пик меньшей интенсивности флюоресценции ближе к началу координат (левее), чем непролиферирующие клетки (Рис. 10 б). Число клеток, образовавших этот пик, позволяет оценить долю клеток, поделившихся за время инкубации сБДУ.
Клоны клеток, экспрессирующие оба трансфецированных гена, культивировали в обычной среде, лишенной селектирующих агентов, для того, чтобы сделать возможным рост клеток, потерявших селективные маркеры. Периодически, через 10-20 суток, их подвергали анализу на стабильность интегрированной ДНК путем тестирования на способность расти в присутствии используемых селектирующих ядов. Всего в общей сложности было получено и проанализировано 64 независимых клона клеток линии А23. Тестирование начинали проводить через 20 сут. после трансфекции. В течение этого времени клетки росли на среде, содержащей G418, что было необходимо для получения и наращивания клонов, содержащих интегированную плазмидную ДНК.
Было обнаружено несколько вариантов поведения чужеродной плазм ид ной ДНК при вторичной селекции на ганцикловире, G418 и среде HAT.
Часть исследованных клонов целиком погибала на среде с ганцикловиром и обладала 100% устойчивостью к G418. При дальнейшем пассировании такие клоны демонстрировали стабильный фенотип и не давали ревертантов по исследуемым маркерам в течение времени наблюдения (до 6 мес. культивирования). В этих случаях, видимо, можно говорить о стабильной интеграции экзогенной ДНК в геном клеток млекопитающих. В дальнейшем подобные клоны обозначались как стабильные.
Доказательства действительности потери чужеродной ДНК из генома культивируемых клеток линии А23
Как уже отмечалось в обзоре литературы, белок RecA бактерий и его эукариотические гомологи являются основным элементами системы гомологичной рекомбинации. У эукариотических клеток в эту систему вовлечено большое количество основных и вспомогательных белков, в первую очередь Rad51, Rad52, Rad54, поэтому усиление экспрессии одного из них, даже самого важного (Rad51), не приводит к значительному (до 5-Ю раз и более) усилению процессов ГР (Vispe et al., 1998). Напротив, введение в клетки эукариот бактериального гена г ее А, связанного с системой нуклеотидных последовательностей, обеспечивающих его оверэкспрессию, приводит к усилению процессов ГР как минимум на порядок (Shcherbakova et al., 2000).
Именно эта стратегия - оверэкспрессия бактериального белка RecA была выбрана в качестве основы для проверки гипотезы о влиянии механизмов ГР на стабильность интегрированной чужеродной ДНК. Для осуществления этой идеи была получена линия клеток А23, экспрессирующих ген recA Е. coli. Для контроля воспроизводимости такого подхода на других клеточных линиях также были получены линии клеток китайского хомячка V79 и тератокарциномы мыши F9, экспрессирующие бактериальный белок RecA Е. coli и химерный белок RecA-X53 P. aeruginosa, обладающий гиперрекомбиногенными свойствами. Для трансфекции была выбрана плазмида pATR4, кодирующая ген recA Е. coli, связанный с сигналом ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV40. Для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих промотор гена recA в плазмиде pATR4 заменён промотором [3-актина цыплёнка и сигналом инициации трансляции Козак (Kido et al., 1992).
Белок T-RecA, кодируемый плазмидой pATR4, модифицирован сигналом ядерной локализации большого Т антигена вируса SV40, или так называемой последовательностью Калдерона (Kalderon et al., 1984). Показано, что модифицированный таким образом белок T-RecA сохраняет все активности, присущие оригинальному белку RecA (Kido et al., 1992; Reiss et al., 1997). Эти же авторы показали, что белок T-RecA локализуется именно в ядрах эукариотических клеток.
Трансфекция плазмиды pATR4 в клетки А23, V79 и F9 проводилась методом электропорации в условиях, аналогичных опытам по нестабильности плазмиды р16 (стр. 70). Клоны, в которых плазмида была стабильно интегрирована в геном, были отобраны по устойчивости к гигро-мицину В, которая обеспечивалась селективным маркером плазмиды - геном hph, кодирующим гигромицин В-фосфотрансферазу. Эффективность трансфекции составляла примерно 3 на 105 отобранных для эксперимента клеток. Устойчивые колонии отбирались на 14 день после начала селекции на гигромицине.
Для выявления клонов клеток, экспрессирующих белок T-RecA, лизаты клеток из различных клонов, устойчивых к гигромицину, анализировали методом Вестерн-блоттинга с помощью поликлон альных кроличьих антител к белку RecA. Данные опыты проводили по достаточно оригинальной методике, имеющей в основе стандартный набор методов (Sambrook et al., 1989), дополненных и улучшенных с учетом последних работ (Goers, 1993; Gersten, 1996; Wilkinson, 2000).
Сравнение интенсивности окрашивания белка T-RecA в лизатах отобранных клонов с интенсивностью контрольных сигналов блоттинга при известных концентрациях очищенного белка RecA позволило определить примерный порядок концентрации белков RecA и RecAX53 в исследуемых образцах (Не et al., 2004). Такое сравнение показало, что уровень экспресии белка T-RecA в различных клонах составлял от 0,05 до 0,1% от общего клеточного белка. Молекулярный вес белка T-RecA, выявленного иммунологически в пробах, приблизительно равен 38 кДа, что соответствовало ожидаемому. Эксперименты по контролю содержания белка RecA в исследуемых линиях клеток были повторены 4 раза с интервалами в 6-7 месяцев для подтверждения наличия в клетках продукта экспрессии чужеродного гена.
Перед постановкой опытов по Вестерн-блоттингу проводился предварительный электрофорез в денатурирующих условиях лизатов исследуемых клеток с последующей окраской серебром. Подобная процедура позволяла определить концентрации белков в каждой пробе, чтобы в дальнейшем наносить одинаковое количество общей массы белков в каждую лунку при проведении фореза с полусухим переносом белков на мембрану и окраской антителами к белку RecA. Кроме того, эти предварительные опыты позволили точно определить скорость миграции белка RecA в геле, а в отдельных случаях и определить отношение содержания T-RecA к общей массе клеточных белков.
Фотографии гелей представлены на Рис. 17 и 18. Как и предполагалось, экспрессия бека RecA в культивируемых клетках млекопитающих оказалась достаточно нестабильной. За время исследования только одна клеточная линия, полученная из клона А23-847, смогла сохранить экспрессию бека RecA в течение полутора лет, причем за это время уровень экспрессии белка несколько уменьшился.
Анализ Вестерн-блотом позволяет определить только содержание чужеродного белка в исследуемых клетках, не позволяя говорить в случае отрицательного результата о причинах потери экспрессии интегрированного гена. Для проверки наличия неповрежденного интегрированного гена в геноме исследуемых клеток был применен метод ПЦР. Для амплификации участка гена гесА были применены праймеры, ранее использованные в работе по изучению роли С-концевого домена белка RecA (Алексеев, 1995). Во всех опытах по амплификации участка гена гесА у культивируемых клеток млекопитающих ставилось два контроля - положительный (плазмида pATR4) и отрицательный (ДНК "чистых" клеток линий А23 или F9).
