Введение к работе
Актуальность проблемы. За последнее десятилетие иммунология претерпела глубокие изменения в связи с доказательством того, что иммунная система регулируется пептидными гормонами - цитокинами,
действия которых подчиняются тем же закономерностям, что и процессы с
участием классических гормонов и их рецепторов (Завьялов, 1993). На
данный момент известна первичная структура нескольких десятков
цитокинов, обеспечивающих дистанционное взаимодействие
иммунокомпетентных клеток между собой. Изучение цитокинов имеет не только теоретическое, но и прикладное значение (Кетлинский, 1992).
Наиболее широкое применение в клинической практике получили
интерфероны (ИНФ), представляющие собой естественную систему
противовирусной защиты организма, а также оказывающие
иммуностимулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и антимитотическое действие (Ершов и др., 1996). ИФН-у, иммунный, синтезируется Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, антителами, интерлейкином-2.
Иммунные интерфероны млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения и профилактики различных заболеваний животных. Использование интерферонов в качестве лекарственного средства имеет существенные преимущества по сравнению с антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов.
С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах и получать рекомбинантные белки в значительных количествах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli (Дебабов, 1985). Однако E.coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени является токсичным, что ограничивает применение его в медицине (Primrose, 1986). Использование непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантных цитокинов млекопитающих позволяет использовать эти белки в ветеринарии.
Используя системы экспрессии различных видов дрожжей, а также подбирая условия культивирования, можно добиться достаточно высокого уровня выхода рекомбинантного белка. Однако следует отметить, что целью подобных экспериментов является, в основном, повышение продукции гетерологичных белков. При этом мало внимания уделяется самим продуцентам и процессам, происходящим в клетках микроорганизмов во время синтеза чужеродных белков. Очевидно, что такие исследования необходимы для успешного решения основной задачи биотехнологии -увеличения выхода целевого продукта.
Целью данной работы являлось получение штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris - продуцентов биологически активного ИФН-у быка и изучение особенностей продукции гетерологичного белка клетками двух видов дрожжей.
В задачи исследования входило:
- получение вектора экспрессии, обеспечивающего синтез нативного
и модифицированного у-интерферона быка в клетках дрожжей Р.
pastoris;
получение штаммов-продуцентов биологически активного ИФН-у быка на основе дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris;
изучение протеолитической стабильности нативного и модифицированного белков;
сравнение эффективности дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris в качестве систем экспрессии гетерологичных генов;
изучение влияния экспрессии гетерологичного гена bIFNG на клетку-хозяина.
Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей Р. pastoris - продуцент модифицированного ИФН-у быка, обладающего повышенной протеолитической стабильностью. Впервые показано, что продукция рекомбинантного ИФН-у быка приводит к повышению количества карбонилированных белков в клетках дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Установлено, что дрожжи Р. pastoris являются более устойчивыми к различным стрессорным факторам. Показано, что в клетках дрожжей P. pastoris синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае S. cerevisiae он образует так называемые «тельца включения». Впервые показано, что сигнал ядерной локализации ИФН-у млекопитающих обеспечивает транспорт гетерологичного белка в ядро дрожжевой клетки, что свидетельствует об эволюционной консервативности этого процесса.
Практическая значимость. Штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, синтезирующие и аккумулирующие рекомбинантный ИФН-у быка внутри клеток, могут быть использованы в качестве иммунопробиотической кормовой добавки для профилактики различных заболеваний животных. Штамм - продуцент модифицированного ИФН-у может быть использован для получения рекомбинантного белка и создания на его основе лекарственного препарата, аналоги которого в настоящее время в России отсутствуют.
Положения, выносимые на защиту:
1. Продукция рекомбинантного ИФН-у быка оказывает на клетки
дрожжей негативное влияние, подобное оксидативному стрессу. Различная устойчивость дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris к негативному воздействию продукции чужеродного белка обусловлена особенностями метаболизма.
Делеция десяти аминокислот на С-конце молекулы ИФН-у быка повышает устойчивость белка к протеолитической деградации, не оказывая влияния на его биологическую активность.
В молекуле ИФН-у быка имеется сигнал ядерной локализации, который выполняет свою функцию в клетках дрожжей.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), на XXII международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Словакия, Братислава, 2005), в работе Школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006), на Седьмой международной научно-практической конференции «Исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 1 статья, 2 патента и 4 тезисных сообщения.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 131 машинописной странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 194 наименования, и приложения. Работа содержит 3 таблицы и 29 рисунков.
Похожие диссертации на Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris
