Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение механизмов трансмиссии хромосом при клеточных делениях у эукариот является фундаментальной проблемой современной клеточной биологии. На протяжен їй последней декады изучение трансмиссии хромосом у эукариот преимущественно происходило путём выявления новых энзимов, участвующих в репликации и репарации хромосомной ДНК. Очевидно, что такой подход не применим для изучения процесса сегрегации хромосом. Более того, большое число генов, кодирующих структурные белки, необходимые для процесса репликации хромосом, оставалось невыявленным. Прогресс в изучении трансмиссии хромосом начался і разр?">отки мутационного подхода, то есть с получением первых мутантов с дестабилизацией хромосом. На сегодняшний день мутационный подход может быть применён только для ограниченного числа эукариотических объектов. Одним из наиболее удобных модельных организмов для изучения трансмиссии хромосом у эукариот являются дрожжи-сахаромицеты. Именно на дрожжах получены мутанты по основным генам, обеспечивающим энзимологию репликации ДНК, а именно, генам трёх ДНК полимераз, гену ДНК лигазы и генам основных репликативных факторов. Преимущество дрожжей-сахаромицетов, как модельного объекта, объясняется не только лёгкостью получения мутантов на гаплоидных линиях дрожжей, но также и тем фактом, что главные структурные элементы воспроизведения хромосом (центромерные последовательности, области начала репликации и теломерныс последовательности) изолированы и детально охарактеризованы у дрожжей. Несмотря на значительный прогресс в изучении генетического контроля репликации и сегрегации хромосом у дрожжей, приведший к описанию более 50 генов, значительное число генов, необходимых для трансмиссии хромосом у дрожжей, пока остаётся невыявленным. Именно поэтому представляется актуальным идентификация и характеристика новых генов, контролирующих сегрегацию и репликацию хромосом у дрожжей; Ввиду высокой консервативности процесса репликации и сегрегации хромосом у эукариот данные, полученные на дрожжах, могут быть использованы и для изучения хромосомного цикла у высших организмов, включая
человека. Прогресс, достигнутый в изучении трансмиссии хромосом у дрожжей, привёл к конструированию искусственных хромосом дрожжей или YAC (от Xeast Artificial Chromosome), способных поддерживать воспроизведение больших фрагментов хромосом человека Ввиду своей высокой клонирующей ёмкости. YAC являются основным материалом для построения физических карт хромосом человека и выделения индивидуальных генов. Эта работ<ытроводится в рамках международной программы "Геном Человека*. Существующие библиотеки YAC клонов" сод ржат набор случайных фрагментов хромосом человека протяжённостью до 1 миллиона пар оснований. Изолирование специфических фрагментов из библиотек основано на трудоёмком гибридизационном анализе многих десятков тысяч случайных YAC клонов. Таким образом, разработка новых подходов, позволяющих селективно изолировать интересующие участки хромосом человека в виде искусственных хромосом дрожжей, представляется актуальнейшей задачей на современном этапе развития геномного проекта
Цель и задачи иссчдования. Цель данного иследования-изучение генетического контроля трансмиссии природных и искусственных хромосом (YAC) у дрожжей-сахаромицетов. В задачу исследования входило: 1)разработка селективной системы идентификации генов, влияющих на митотическую стабильность хромосом у дрожжей; 2) разработка генетической системы, позволяющей отделять мутанты с нарушением репликации от мутантов с нарушением сегрегации хромосом;3)картирование, клонирование и структурный анализ новых генов, контролирующих хромосомный цикл у дрожжей; 4) разработка новой системы селективного клонирования фрагментов хромосом человека в виде искусственных хромосом дрожжей.
Научная новизна. Идентифицировано 12 новых генов CHL (от C_H/omosome Loss), контролирующих митотк-іескую трансмиссию хромосом у дрожжей. Анализ поведения различных типов искусственных хромосом у полученных мутантов позволил разделить новые гены на две группы: группу, контролирующую репликацию хромосомной ДНК, и группу, определяющую расхождение хромосом. Два гена, относящихся к первой группе, CHL12 и CHL15, и один из генов, относящийся ко второй группе, СНЫ, были физически и генетически картированы и выделены в виде ДНЮ клонов. Установлено, что ген CHLI5 кодирует полипептид с
молекулярной массой 105 кД и входит в состав комплекса ДНК полимеразы а. Второй ген, CHLI2, кодирует белок с молекулярной массой 84 кД и,
судя по структурным данным и анализу мутантных аллелей, является частью репликативного фактора С (RF-C). Установлено, что ген CHL4, необходимый для расхождения хромосом, кодирует неизвестный ранее белок с молекулярной массой 53 кД, содержащий ДНК-связывающий домен. Анализ мутантов с полной делецией гена CHL4 согласуется с ролью этого гена в формировании кинетохора. Таким образом, в ходе данного Исследования разработаны новые подходы к изучению генетического Контроля трансмиссии хромосом у дрожжей-сахаромицетов, а также детально охарактеризовано несколько новых генетических локусов важных для репликации и расхождения хромосом в митозе. В дополнении к этому, анализ поведения в митозе и при трансформации искусственных хромосом у дрожжей позволил создать принципиально новую систему селективного клонирования генов млекопитающих, основанную на рекомбинации in vivo (TAR-клонирование).
Научно-практическая значимость. Разработанный подход отбора мутантов по репликации и сегрегации хромосом может быть использован для выявления новых генов, контролирующих этот процесс у дрожжей. Структурный и функциональный анализ генов, охарактеризованных в ходе данного исследования, расширяет наши представления о механизме трансмиссии хромосом у дрожжей-сахаромицетов и може с помочь при изучении этого процесса у высших эукариот после обнаружения соответствующих гомологов. Международная программа "Геном Человека "является важнейшим проектом 20-ого столетия. Одним из главных этапов этой программы является физическое картирование хромосом человека с использованием искусственных хромосом дрожжей (Y АС). В ходе настоящего исследования была разработана принципиально новая технология селективного клонирования больших фрагментов хромосом человека в виде YAC, основанная на рекомбинации молекул ДНК при трансфекции в сферопласты дрожжей TAR-клонирование). Новый подход позволяет конструировать библиотеки индивидуальных хромосом человека, а также селективно клонировать различные группы генов и индивидуальные гены из общей геномной ДНК. Таким образом, TAR-клонирование имеет важное значение для завершения физического картирования хромосом и
функционального исследования индивидуальных генов человека. Разработанные в диссертации методы и практические результаты используются в Институте молекулярной генетики РАН (Москва), в Центре генной инженерии РАН (Москва), в Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург), в Институте гриппа (Санкт-Петербург), в Центре изучения генома человека (Лос-Аламос, США), в Университете им. Дж. Гопкинса (Балтимор, США), в Мелборнском институте детских
болезней (Австралия), вТохокском университете (Япония)гв Марбургском
униг "рситете (Германия), в Институте прикладной микробиологии (Базель, Швейцария), в Государственном университете в Буэнос-Айросе (Аргентина), в Центре геномных исследований (Кэмбридж, США)
Место проведения работы. Работа проводилась в Институте цитологии РАН (зав. лаб. д б н В. Л. Ларионов) и частично в Университете им. Джона Гопкинса и Национальном институте здравохранения, США. Основные результаты получены в соавторстве с д б н В Л. Ларионовым, с лабораторией дб.н. В М. Захарьева (Институт молекулярной биологии РАН), с лабораторией проф. Ф. Хитера и с лабораторией проф М Резника (США).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены или представлены на конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1985), на международном симпозиуме "Физико-химические свойства ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси 1987), на сьезде ВОГиС им. Н. И. Вавилова (Москва, 1987), на симпозиуме "Клеточная биология дрожжей" (Колд Спринг Харбор, США, 1987), на 14 международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Эспо, Финляндия, 1988), на 16 международном конгрессе "Генетика" (Торонто, Канада, 1988), на симпозиуме "Молекулярная биология дрожжей" (Колд Спринг Харбор, США, 1989), на международном симпозиуме "Трансмиссия хромое» і" (Ленинград, 1990), на международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Гаага, Голландия, 1990), на ФАСЕБ конференции "Репликация и сегрегация хромосом у дрожжей" (Сакстонс Рива, США, 1990), на международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Сан-Франциско, США. 1991), на двустороннем симпозиуме Россия-США "Геном Человека" (Санкт-Петербург, 1992), на ежегодной Средне-Атлантическое конференции "Дрожжи" (Балтимор, США. 1992), на
ФАСЕБ симпозиуме "Структура, репликация и сегрегация у дрожжей" (Сноумасс, США, 19Э2), на 3-ем рабочем совещании Департамента энергетики США по проекту "Геном человека" (Санта Фе, США, 1992), на 16 международной конференции " Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Вена, Австрия, 1992), на Гордоновской ежегодной конференции "Динамика плазмид и хромосом" (Плимаус, США, 1993), на конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Мэдисон, США, 1993), на второй конференции "биологические последствия нестабильности генома" (Чапел Хил, США, 1994), на конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Сиэтл, США, 1994), на 4-ом рабочем совещании Департамента энергетики США по программе "Геном Человека" (Санта Фе. США, 1994), на ФАСЕБ симпозиуме "Генетическая рекомбинация и геномные перестройки" (Сноумасс, США, 1995), на конференции "Картирование и секвенирование генома" (Колд Спринг Харбор, США, 1996), на конференции "Генетика дрожжей и болезни человека" (Балтимор, США, 1996).
Структура и объбм диссертации. Диссертация изложена на 36 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 9 рисунков, список опубликованных по теме диссертации статей включает 31 наименование.
Похожие диссертации на Трансмиссия природных и искусственных хромосом у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и ее генетический контроль
