Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Введение 5
1.1 Актуальность проблемы 5
1.2 Цели и задачи 8
ГЛАВА 2. Обзор литературы , 9
2.1 Белки SMC семейства 9
2.2 Конденсин 11
2.2.1 Конденсин: структура 11
2.2.2 Конденсин: локализация в клетке, связывание с ДНК 14
2.2.3 Конденсин: функции - компактизация 19
2.2.4 Конденсин: функции - сегрегация хроматид 21
2.2.5 Конденсин: функции - регуляция клеточного цикла 22
2.2.6 Конденсин: функции - регуляция транскрипции 25
2.3 рДНК, ядрышко, ядрышковый организатор 26
2.4 Регуляция биосинтеза рибосом: TOR, рапамицин 32
2.5 Штаммы с изменённой рибосомной ДНК 33
ГЛАВА 3. Материалы и методы 37
3.1 Штаммы 37
3.2 Плазмиды 37
3.3 Среды и условия культивирования 37
3.4 Молекулярно-биологические и биохимические методы 41
3.5 Тест на стабильность хромосомы III 43
3.6 Минихромосомы 43
3.7 Тест на потерю минихромосом 44
3.8 Микроскопия 45
3.9 Микроскопия живых клеток в реальном времени 46
ГЛАВА 5. Результаты 47
5.1 Значение ядрышкового организатора в контроле продолжительности и динамики анафазы дрожжей 47
5.1.1 Штаммы с эписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности 47
5.1.2 Отсутствие хромосомного локуса рДНК повышает уровень успешной сегрегации ядрышка в мутантах smc2-8 49
5.1.3 Возможный механизм нестабильности генома в штамме с ЭрДНК: повышенная чувствительность к функциональности митотического веретена и кинетохора 52
1.4.1 Анализ динамики митоза (телофаза+анафаза) в штаммах с различной структурой рДНК 53
5.2 Функциональное и физическое взаимодействие конденсина с ДНК ядрышкового организатора 57
5.2.1 Активность Pol I необходима для выхода конденсина из ядрышка по окончании митоза 57
5.2.2 Транскрипционный статус рДНК связан с повышением частоты ошибок сегрегации ядрышка при активации мутации конденсина 60
5.2.3 Стабильность минихромосомы, содержащей мономер рДНК, зависит от функционального состояния рДНК (активности Pol I) и мутации конденсина 62
5.2.4 Транскрипция РНК-полимеразой II не оказывает дестабилизирующего действия на минихромосому, содержащую рДНК 66
2.5 Исследование митотической стабильности минихромосом, содержащих двойной повтор рДНК 69
5.3 Определение стабильности минихромосом, содержащих последовательности связьшания конденсина in situ 71
ГЛАВА 6. Обсуждение 77
6.1 Транскирипция Рої I и связывание конденсина на рДНК 77
6.2 Роль рДНК в процессе регуляции точности расхождения хромосом в митозе 81
6.3 Скрининг индивидуальных сайтов связьшания конденсина в геноме S. cerevisiae с использованием модели митотической сегрегации минихромосом 83
Выводы 86
Список цитированной литературы
- Конденсин: структура
- Молекулярно-биологические и биохимические методы
- Штаммы с эписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности
- Роль рДНК в процессе регуляции точности расхождения хромосом в митозе
Введение к работе
1.1 Актуальность проблемы
Стабильность генома и передача генетического материала из поколения в поколение гарантируется точностью расхождения хромосом в митозе. Сегрегация хромосом в процессе клеточного деления требует от эукариотической клетки слаженной работы комплекса ассоциированных с хроматином структурных белков и энзимов. Один из этих белковых факторов - это конденсин, молекулярная «машина» конденсации хромосом (Losada, Hirano, 2005). У позвоночных обнаружены два конденсиновых комплекса (конденсин I и конденсин II), различающиеся динамикой экспрессии и картиной хромосомной локализации (Hirano, 2006). У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae выявлен только один конденсин, состоящий из пяти жизненно важных субъединиц, две из которых Smc2 и Smc4 относятся к SMC белкам (Structural Maintenance of Chromosomes), и содержат участок связывания АТФ, а три - это вспомогательные субъединицы Brn1, Ycs4 и Ycs5. Все компоненты комплекса - высококонсервативные белки. Мутации хотя бы одной из субъединиц приводят к нарушению разделения хроматина при делении клетки (Freeman et al., 2000). Сходные фенотипы нерасхождения хроматид в митозе при инактивации конденсина описаны и у высших эукариот (Saka et al., 1994; Gerlich et al., 2006). Основной функцией конденсина in vivo является не столько компактизация хроматина, сколько разделение хроматид в ходе митотической сегрегации. Кроме того, конденсин принимает участие в регуляции экспрессии генов, которые сохраняют активность в митозе (Xing et al., 2008).
У позвоночных конденсины, диффузно распределённые в цитоплазме (конденсин I) или в ядре (конденсин II) в интерфазе, в митозе перераспределяются во внутренние домены конденсированных хромосом (Swedlow, Hirano, 2003; Maeshima et al., 2005). У S. cerevisiae в интерфазе конденсин диффузно распределён в цитоплазме, а в митозе основным сайтом связывания конденсина является рибосомная ДНК (Freeman et al., 2000).
Рибосомная ДНК (рДНК) S. cerevisiae состоит из примерно 150 повторов, которые располагаются на правом плече XII хромосомы. Каждый повтор рибосомной ДНК содержит ген - предшественник 35S рРНК, транскрибируемый РНК полимеразой первого типа (Рої I), а также ген, транскрибируемый РНК полимеразой третьего типа (Pol III), кодирующий 5S рРНК (Shaw et al., 2005). Эти гены разделены двумя нетраскрибируемыми (спейсерными) участками (рис. 6А). Ранее было показано, что конденсин имеет 4 главных сайта связывания на рибосомной ДНК, два из которых приходятся на участок, транскрибируемый Pol I. Около половины повторов рДНК являются транскрипционно активными, при этом число генов рДНК остается стабильным из поколения в поколение (Damman et al., 1993), при этом регуляция уровня рРНК у клеток, находящихся в разных фазах роста (French et. al., 2003), осуществляется путём модуляции транскрипции «активных» повторов. Роль «молчащих» повторов рДНК остаётся неизвестной. Инактивация конденсина в клетках S. cerevisiae приводит к тому, что большая часть клеток останавливается в метафазе митоза, но сохраняет высокую жизнеспособность. Часть клеток, которые входят в анафазу, обладают признаками неправильной сегрегации хромосом. Дефекты сегрегации наиболее ярко выражены для хромосомы XII, несущей гены ядрышкового организатора. Частота нерасхождений этой хромосомы в 2-3 раза выше, чем других хромосом (Yong-Gonzalez et al., 2007). Какие особенности организации и функционирования ядрышка обуславливают тот факт, что сегрегация именно этого локуса является особенно зависимой от конденсина? Этот вопрос, а также вопрос о молекулярной природе взаимодействия конденсина и района ядрышкового организатора, являются предметом настоящей работы.
Высокая пластичность дрожжевого генома предоставляет возможность исследовать анатомию взаимодействия конденсина и субдоменов рДНК. Для исследования функционального взаимодействия хроматина ядрышка с конденсином в митозе мы использовали штамм с эписомной локализацией рДНК, в котором хромосомный локус рДНК (тандемные повторы) был заменён многокопийной плазмидой, несущей одиночные повторы рДНК (Wai et al., 2000). Использование данной модели позволило впервые показать роль ядрышка в регуляции процесса сегрегации всего генома в митозе. 1.2 Цели и задачи
Целью настоящего исследования является изучение роли конденсина в обеспечении митотической стабильности хроматина на примере хромосомного локуса ядрышкового организатора. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. Определить, как влияет перераспределение рибосомной ДНК, основного сайта связывания конденсина в митозе, из хромосомы в эписому на сегрегацию хромосом и поддержание стабильности генома.
2. Исследовать влияние транскрипционной активности на взаимодействие конденсина с рДНК и выяснить роль функционального взаимодействия конденсина и транскрипции при сегрегации ядрышка в митозе.
3. Оценить функциональную роль хромосомных сайтов связывания конденсина (вне рДНК) в поддержании высокой митотической стабильности хромосом и минихромосом.
Конденсин: структура
Конденсин, открытый в 1995 у S. cerevisiae (Strunnikov et al., 1995), был позднее охарактеризован и у других организмов: дрозофилы (Bhat et al., 1996), Xenopus laevis (Hirano et al., 1997) и других эукариот (см. обзор Losada, Hirano, 2006). Первоначально был открыт один комплекс, дальнейшие исследования обнаружили, что у позвоночных присутствует два комплекса конденсина, отличающихся хромосомной локализацией и динамикой связывания с хроматином при прохождении клеточного цикла (Onoetal.,2001).
Основа конденсина - белки SMC семейства: Smc2p и Smc4p. Кроме них в состав комплекса входят еще так называемые регуляторные субъеденицы: у дрожжей это Ycs4p, Ycs5p, Brnlp, которые, скорее всего, обеспечивают специфичность связывания конденсина с хроматином. Все субъеденицы необходимы для полноценной работы комплекса (Lavoie et al., 2004). Состав конденсиновых комплексов у эукариот кратко представлен в таблице 1. У всех многоклеточных модельных эукариот обнаружены два конденсиновых комплекса (конденсин I и конденсин II), у которых общими оказываются белки smc семейства, а регуляторные белки отличаются. Исключением из этого правила является C.elegans, у этой нематоды было открыто существование ещё одного конденсинового комплекса: конденсина l-DC (Csankovszki et al., 2009; Tsai et al., 2008). Таким образом, на данный момент Caenorhabditis elegans является рекордсменом по разнообразию конденсина: у неё обнаружено 3 комплекса конденсина.
Все компоненты конденсина находятся во фракции, выделяемой биохимически и представляющие из себя «скелетом» хромосомы -chromosome scaffold, (Hudson et al. 2003; Maeshima, Laemmli 2003; Gassmann et al. 2005). Данные световой и электронной микроскопии также показывают, что в клетках млекопитающих конденсин локализован во внутренних доменах метафазных хромосом (Laemmli 1985; Maeshima et al., 2005).
Детальные исследования компактизации хромосом в митозе дают основания полагать, что структурные изменения хромосом в раннем и позднем митозе могут отличаться (Kireeva et al., 2004). Данные о динамике различных конденсиновых комплексов в митотических клетках млекопитающих (Ono et al., 2001) позволяют предположить, что конденсин II инициирует начальную стадию конденсации хроматина, так как данный комплекс находится постоянно в ядре. После разрушения ядерной оболочки в профазе митоза конденсин I может взаимодействовать с конденсином II и хроматином, стабилизируя их структуру и образуя «центр организации» хроматид. И действительно, при истощении по субъединице конденсина II конденсация профазного ядра задерживается (Hirota et al., 2004). Истощение по одному из конденсинов в метафазе у клеток млекопитающих имеет собственный отчетливый фенотип, однако при истощении обоих комплексов наблюдается четкий аддитивный эффект по степени конденсации хроматина в митозе (Ono et al., 2003), что подтверждает функциональное взаимодействие обоих комплексов.
Различная роль конденсина I и конденсина II в процессе организации хромосом также была убедительно продемонстрирована и на безклеточных системах ооцитов X. laevis (Hirano 2005, Gassmann et al., 2004).
Конденсин у S. cerevisiae в митозе преимущественно связывается с районами ядрышкового организатора, также он необходим для сегрегации рДНК (Freeman et al., 2000; D amors et al., 2004, Sullivan et al., 2004). Два участка связывания конденсина на рДНК находятся внутри транскрибируемого РНК полимеразой I участка, другие два - в непосредственной близости от района терминации транскрипции полимеразой первого типа, сразу за RFB (replication fork block) (рис. 2Б). Возможно, что функции конденсина могут отличаться в зависимости от того, с какими последовательностями на рДНК он связывается, так было показано, что связывание конденсина с RFB способствует стабилизации рДНК, по-видимому, уменьшая частоту рекомбинации внутри рДНК (Johzuka, Horiuchi 2006).
Молекулярно-биологические и биохимические методы
Трансформацию дрожжей проводили по стандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990). В работе использовали стандартные методы генной инженерии. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей S. cerevisiae проводили по стандартной методике (Rose et al., 1990).
Изготовление экстракта дрожжевых клеток проводили, как описано ранее (Burke et al., 2000). Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия (SDS-ПААГ) проводили по стандартной методике (Laemmli, 1970). Общая концентрация акриалмида в гелях составляла 4-12%. Для окраски гель фиксировали в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 40% метанола в течении 1 ч, затем окрашивали Кумасси G-250 («Sigma-Aldrich», США) с 20% метанола. Для иммуноблоттинга после разделения белков электрофорезом, их переносили на фильтр PVDF, в соответсвии с описанной методикой (Towbin et al., 1979), с использованием электродного буфера для SDS-ПААГ с 10% метанола. Иммуноблоттинг осуществляли с использованием первичных моноклональных антител к белкам Cdc28p, Clb2p («Santa-Cruz», США) и вторичных моноклональных антител к иммуноглобулинам мыши или кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена («Bio-Rad», США). Фильтр промывали водой и блокировали места неспецифического связывания, инкубируя его с PBSween буфере (PBS рН 7.5 (Biofluids, США) и 0.1% Tween-20 (Sigma-Aldrich, США)), содержащем 0.5% обезжиренного молока. Затем фильтр инкубировали 2 ч со специфическими антителами против того или иного белка (первые антитела) в буфере PBSween, содержащем 0.5% молока, при использовании разведений, специфичных для конкретных антител. Затем мембраны отмывали в буфере PBSween 4 раза по 5 мин и инкубировали 1 ч с антителами против первых антител, коньюгированными с пероксидазой (вторые антитела), в разведении 1:3000 в буфере PBSween содержащем 5% молока. После отмывки в PBSween буфером, блот окрашивали субстратом для выявления пероксидазы (GE-Halthcare, США) и экспонировали с рентгеновской плёнкой XAR-5 (Kodak, США) согласно инструкции фирмы-производителя. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор белков MultiMark (Invitrogen, США).
Делецию MAD2 производили так как описано ранее, используя специфические праймеры (Yong-Gonzales et al., 2007). Количественную ПЦР и реакцию обратной транскрипции проводили, как описано ранее с использованием специфических праймеров к транскрибируемым и нетранскрибируемым последовательностям рДНК (Wang et al., 2006).
Иммуноблоттинг осуществляли с использованием первичных моноклональных антител к белкам Cdc28p, Clb2p («Santa-Cruz», США) и вторичных моноклональных антител к иммуноглобулинам мыши или кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена («Bio-Rad», США). Связывание антител выявляли методом хемилюминесценции с использованием наборов реактивов «ECL» («GE-Healthcare», США), согласноинструкции производителя.
Тест на стабильность хромосомы III проводили, как описано в (Runge К et. al., 1991). В принципе: штаммы содержали либо рДНК дикого типа, либо эписомную рДНК, а также температуро-чувствительную мутантную аллель конденсина (smc2-8) в гомозиготе, либо в гетерозиготе. Мутация smc2-8 является рецессивной. Исследуемые штаммы инкубировали в течение 3 ч при непермессивнои для мутации конденсина темпераруре (37С), после этого штаммы доращивали при температуре 23С в течение 24 ч. Затем штамм скрещивали с тестерным штаммом, перепечатывали на новую среду и выращивали еще 24 ч при 23С на полной среде YPD. Далее культуру клеток перепечатывали на среду, на которой могли расти только штаммы, успешно прошедшие коньюгацию. Чашки Петри с данной культурой выращивали в течении 2 суток при 23С и после этого фотографировали и проводили количественный анализ.
Штаммы с эписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности
Для того чтобы проверить, насколько обнаруженный эффект нестабильности генома связан с мутацией конденсина, мы провели тест на чувствительность штамма к нокодазолу - агенту, препятствующему образованию веретена деления и, соответственно, активации митотического чекпоинта (spindle checkpoint). Тест на чувствительность к нокодазолу штамма с эписомной рДНК и штамма, содержащего рДНК дикого типа, проводили с помощью метода последовательных разведений. В этом тесте равное количество клеток последовательно разводили 1:5 стерильной водой и высевали на чашки, содержащие нокодазол в концентрации 5 либо 10 мкг/мл, а также на среду YPD, не содержащую нокодазола. Далее чашки с посеянными дрожжами оставляли расти в течение 96 ч при температуре 23 С.
Тест проводили при температуре 23 С чтобы избежать различий в скорости роста, которые могут быть вызваны различным уровнем рРНК в клетках штаммов с ЭрДНК и хромосомной рДНК. Несмотря на то, что предыдущие исследования не выявили разницы в скорости роста у этих штаммов (Oakes et al., 1998), штамм с ЭрДНК демонстрировал в несколько раз более высокую чувствительность к нокодазолу, по сравнению со штаммом с рДНК дикого типа (рис. 7.). Повышенная чувствительность к нокодазолу ЭрДНК штамма свидетельствует о том, что даже при наличии конденсина дикого типа клетки испытывают трудности с успешным завершением митоза в присутствии фактора, негативно влияющего на митотический аппарат клетки.
Эти данные, вероятно, говорят о том, что в штамме с ЭрДНК снижен уровень контроля ошибок расхождения хроматина при активации митотического чекпоинта, хотя сам механизм блокировки клеточного цикла остаётся интактным (рис. 6). Следовательно, возможную природу сверхчувствительности к нокодазолу следует искать в процессе расхождения хроматид в анафазе митоза.
Одна из причин, по которым клетка с ЭрДНК может быть сверхчувствительна к митотическим ингибиторам и проявлять потерю хромосом, - это прежде неизвестный контроль динамики митоза нативным хромосомным локусом рДНК.
Для того чтобы изучать динамику веретена деления в клетках дрожжей мы воспользовались системой мечения одного из двух генов кодирующих тубулин - TUB1 с помощью GFP. Наблюдения за клетками, содержащими меченный тубулин, производили с помощью системы автоматизированной прижизненной съемки на основе конфокального микроскопа. Система была снабжена камерой с контролем показателей окружающей среды, что позволяло поддерживать постоянной температуру (23 С) на всем протяжении съемки и избежать флуктуации в скорости роста. Полученные результаты монтировали в видеофайл, анализ которого позволил определить временные показатели изменения веретена деления.
Быстрая фаза удлинения веретена является признаком начала анафазы у дрожжей. Разборка веретена деления соответствует концу телофазы и непосредственно предшествует цитокинезу (рис. 3). Таким образом, отрезок времени от начала фазы быстрого удлинения веретена до его разрушения оценивали как суммарную продолжительность анафазы и телофазы митоза.
Мы обнаружили, что продолжительность совместно анафазы и телофазы была меньше в штамме с эписомной рДНК, по сравнению со штаммом с диким типом рДНК, и составляла порядка 28 и 23 минут для штамма с wt рДНК и ЭрДНК, соответственно (рис. 8А). 1.4.2. Анализ динамики клеточного цикла в штаммах с различной рДНК. Телофаза, анафаза.
У S. cerevisiae анафаза начинается с удлинения веретена деления, а в конце анафазы, непосредственно перед цитокинезом, происходит разборка веретена (рис. 8А). Мы проводили анализ протяжённости одновременно анафазы и телофазы, начиная с характерного удлинения биполярного веретена, и заканчивая моментом его полной разборки. Также мы использовали маркер ядрышка, белок Sik1, соединённый с красным флуоресцентным белком-mRFP. У S. cerevisiae разделение ядрышка является завершающим этапом разделения хромосом в митозе (Freeman et. al., 2000), и, таким образом, является надёжным маркером окончания анафазы.
Роль рДНК в процессе регуляции точности расхождения хромосом в митозе
Для того чтобы подтвердить нашу гипотезу о взамодействии транскрипции и связывания конденсина на рДНК мы использовали минихромосому, содержащую два повтора рДНК, сравнивая ее с минихромосомой, содержащей единственный повтор рДНК (рис. 14). Введение второго повтора рДНК приводило к стабилизации минихромосомы, что согласуется с нашими предположениями о специализации повторов рДНК. При этом стабильность такой конструкции оставалась зависимой от конденсина, что говорит о том, что именно конденсин является ключевым фактором сегрегации рДНК.
В связи с дупликацией геномного участка соответствующего сайту связывания конденсина (в хромосоме и на плазмиде), прямое определение ассоциации этого комплекса с ДНК (иммунопреципитациеи) в пределах сайта малоинформативно. Исходя из этого ограничения, мы выбрали фукциональный метод анализа сайтов связвания конденсина по стабильности соответствующих минихромосом в митозе. Этот метод основан на допущении, что плазмиды, содержащие в своем составе центромер и сайт начала репликации, наследуются сходно с тем, как наследуются нормальные хромосомы дрожжей. Этот подход широко применялся для исследования вклада центромерных и теломерных последовательностей, а также ассоциированных с ними белков в стабильное поддержание хромосомного набора в дрожжах (Shero et al., 1991). Использованная нами модификация этого метода позволяет оценить вклад термочувствительных услово-летальных аллелей на этот процесс и зарекомендовала себя как надежный метод оценки хромосомной стабильности (Strunnikov et al.,1993; Hartwell et al., 1985), в том числе и в случае мутантов субъединиц конденсина (Wang et al, 2005).
Для изучения роли индивидуальных сайтов связывания конденсина в поддержании стабильности хромосом мы выбрали семь сайтов, основываясь на данных раннее опубликованного хромосомного скрининга (Wang et al., 2004). В этой работе, последовательности ДНК, полученные в результате преципитации участков хроматина, связанных с конденсином in situ, были гибридизованны на матрицы микрочипов, содержащих одноцепочечные ДНК-пробы покрывающие практически весь геном S. cerevisiae. Этот подход, упоминаемый в литературе как ChIP-on-chip, позволил выявить и охарактеризовать сайты устойчивого связывания конденсина в митозе в геноме дрожжей. Семь сайтов для данной работы были выбраны случайным образом, но с учетом прилежащих районов генома, так чтобы пик связывания был ярко выражен на участке в 10-11 тысяч пар оснований. Обогащение конденсином для каждого из сайтов было независимо подтверждено с помощью иммунопреципитации хроматина с последующим количественным ПЦР (Wang et al., 2004). После подтверждения того, что выбранные последовательности являются участками связвания конденсина в живой клетке, соответсвующие сайты были клонированны с использованием специфических праймеров, фланкирующих пик связывания конденсина в геноме. Длинна каждого клонированного участка была выбрана произвольно, но с включением фланкирующих участков ДНК длиной не менее 500 пар оснований. Далее последовательности клонировали в дрожжевой вектор pRS412, содержащий репликатор и центромерные последовательности из генома пекарских дрожжей. Наличие центромерной последовательности упорядочивает сегрегацию таких плазмид в клетках дрожжей, что позволяет классифицировать эти экстрахромосомные элементы как «минихромосомы».
Похожие диссертации на Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
