Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Проблема концевой недорепликации, структура и функции теломер
2. Фермент теломераза, и ее функция в клетке
3. Иммортализация при помощи активации теломеразы.
4. Стволовые клетки в организме человека
Материалы и методы 43
1. Культуры клеток 43
1.1 Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, культура XI .
1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культура BMSCS.
1.3 Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, культура LA.
1.4 Фетальные нейральные стволовые клетки человека, культура NSC
1.5 Клетки линии ТК-164
2. Введение гена каталитического компонента теломеразы при помощи лентивирусного вектора 46
3. Дифференцировка клеток и методы регистрации 47
3.1 Дифференцировка в адипогенном направлении и специфическое окрашивание.
3.2 Дифференциовка в остеогенном направлении и специфическое окрашивание.
3.3 Иммуноцитохимия.
3.4 Выявление белкового компонента теломеразы in situ
3.5 Доверительные интервалы (погрешности)
4. Изучение кариотипа 51
4.1 Приготовление хромосомных препаратов из митотических клеток человека
4.2 Дифференциальное R-окрашивание хромосом.
5. Определение экспрессии генов методом ОТ-ПЦР 52
5.1 Выделение РНК
5.2 Реакция обратной транскрипции и ПЦР.
5.3 Использованные в работе праймеры
6. Определение теломеразной активности 56
6.1 Приготовление клеточного экстракта
6.2 Реакция TRAP и PAG-электрофорез
7. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) теломерного повтора на хромосомах человека 59
8. Тест на наличие контактного торможения пролиферации и реакции на сывороточное голодание 59
Результаты 61
1. Введение гена hTERT в мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека,
полученные из различных типов тканей и исследование их дифференцировочного потенциала 61
1.1 Стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI и Xl-lenti-hTERT
1.2 Клетки стромы губчатой кости человека, культуры BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT.
1.3 Стромальные клетки жировой ткани человека, культуры LA и LA-lenti-hTERT
1.4 Тест на наличие контактного торможения и реакцию на сывороточное голодание, клеток BMSCS-lenti-hTERT.
2. Введение гена hTERT в нейральные стволовые клетки человека (НСК) и исследование свойств полученной линии.. 69
2.1 Клетки NSC и NSC-lenti-hTERT.
2.2 Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров дифференцировки.
2.3 Определение экспрессии маркеров дифференцировки методом ОТ-ПЦР.
2.4 Нейросферы, полученные из NSC и NSC-lenti-hTERT
2.5 Образование колоний разной морфологии.
2.6 Кариотипирование культуры NSC-lenti-hTERT.
2.7 Определение теломеразной активности методом TRAP.
2.8 Качественный анализ величины теломер клеток NSC4-lenti-hTERT.
2.9 Определение теломеразной активности иммуногистохимическим методом.
Обсуждение результатов 83
1. Образование иммортализованных культур стволовых клеток in vitro при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы человека...85
2. Сохранение механизмов дифференцировки в иммортализованных культурах клеток 88
3. Сохранение теломеразной активности 91
4. Стабильность кариотипа, сохранение способностей к контактному торможению и сохранение способности к переходу в пролиферативный покой в условиях сывороточного голодания 92
Выводы 95
Благодарности 96
Список литературы 97
- Фермент теломераза, и ее функция в клетке
- Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, культура XI
- Стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI и Xl-lenti-hTERT
- Сохранение механизмов дифференцировки в иммортализованных культурах клеток
Введение к работе
В настоящее время одним из самых перспективных и развивающихся направлений в медицине являются клеточно-замещающие технологии -клеточные трансплантации и тканевая инженерия. Эти технологии применяются для лечения заболеваний связанных с повреждением или дегенерацией различных типов тканей, например ожоги, инсульты, ишемии, травмы спинного мозга, нейродегенеративные болезни -синдромы Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Предполагается, что в качестве замещающего материала наиболее оптимальным будет использование стволовых клеток, то есть клеток способных дифференцироваться в клетки различных типов тканей.
Во избежание иммунных конфликтов для подобного рода трансплантаций наиболее целесообразно использовать аутологичные стволовые клетки человека. Поэтому в настоящий момент во всем мире проводится очень много исследований, связанных с поиском способов получения, культивирования и наращивания аутологичного донорского клеточного материала in vitro, изучением механизмов дифференцировки, способов создания специфичных тканевых трансплантатов для их дальнейшего использования в медицине.
Одной из главных проблем, связанных с культивированием стволовых клеток in vitro является то, что практически все первичные культуры клеток, получаемые из тканей взрослого человека имеют ограниченный пролиферативный потенциал и быстро теряют способность к дифференцировке.
В то же время, множество работ во всем мире, в том числе и в нашей лаборатории, показали, что введение в культивируемые клетки гена каталитического компонента теломеразы hTERT, восстанавливает
теломеразную активность внутри клетки, стабилизирует теломерные участки хромосом и увеличивает время жизни клеток в культуре, позволяя получать иммортализованные клеточные линии. Полученные при этом теломеризованные клетки, как правило, сохраняют нормальные механизмы регуляции пролиферации.
Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения иммортализованных линий стволовых клеток при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы и проследить каким образом может влиять экспрессия гена hTERT на способности теломеризованных клеток к дифференцировке.
Фермент теломераза, и ее функция в клетке
Теломераза - это рибонуклеиновый фермент. РНК-компонент теломеразы содержит короткую матрицу, комплементарную одному повтору (часто матрица бывает длинней, чем один повтор) G-богатой цепи теломерной ДНК (Blasco et al., 1995).
РНК-компонент теломеразы человека составляет 430 н. в длину, и экспрессируется в большинстве клеток человека, независимо от теломеразной активности (Feng et al., 1995, Avilion et al., 1996, Chen et al., 2000) (рис. 5.) . Интересным фактом является то что, матричный район в мышиной РНК составляет всего 8 нуклеотидов, а в РНК человека 11 нуклеотидов, несмотря на то, что обе они кодируют одну и ту же последовательность. Таким образом, было выяснено, что матрица длинее чем один теломерный повтор (Blasco et al., 1995).
РНК-компоненты теломеразы из разных организмов довольно сильно отличаются, как по первичной структуре, таки по длине. Даже у таких эволюционно близких видов как мышь и человек гомология составляет всего 65% (Blasco et al., 1995). Тем не менее консервативность РНК довольно высока на уровне вторичной структуры (Romero and Blackburn, 1991). Относительно хорошо изучены вторичные структуры РНК теломеразы простейших (в основном тетрахимен) и позвоночных (Romero and Blackburn, 1991, Chen et al., 2000). На основе сравнительного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей и компьютерного моделирования укладки цепи этих РНК, была предложена схема их эволюции (Chen et al., 2000).
Теломераза была обнаружена в большинстве исследованных видов эукариот, имеющих линейные хромосомы. В 1997 году были клонированы гены РНК-компонента теломеразы (Feng et al., 1997) и ген каталитической белковой субъединицы теломеразы человека (Nakamura et al., 1997, Meyerson et al., 1997). В конце этого же года удалось реконструировать теломеразную активность в лизате клеток. Оказалось, что для этого достаточно присутствие двух компонентов — каталитического компонента теломеразы (hTERT) и РНК-компонента (hTR) (Weinrich et al., 1997).
В соответствии с теорией Оловникова, теломеразная активность (ТАК) должна присутствовать в клетках половой линии и раковых клетках. Действительно, теломераза активна в половых и в ряде стволовых клеток, но не активна в большинстве соматических клеток (Harley, 1991, Harley et al., 1990). На определенной стадии развития, приходящейся на ранний эмбриогенез, происходит выключение гена, теломеразы в подавляющем большинстве соматических клеток человека. Выключение теломеразного гена есть этап онтогенеза, совершающийся в определенный момент жизни организма и не во всех типах клеток. ТАК была обнаружена в некоторых соматических клетках костного мозга, лейкоцитах периферической крови, в Т- и В- лимфоцитах (Zhang et al., 1996, Weng et al., 1996., Igarashi and Sakaguchi, 1996), в семенниках, эпидермисе кожи и эпидермисе шейки матки (Pao et al., 1997, Kyo et al., 1997) в клетках нижней части крипт толстой кишки (Kuniyasu, 1997), в клетках эндометрия матки (Kyo et al., 1997, Saito et al., 1997). Все эти ткани характеризуются высокими темпами обновления. Важно отметить, что ТАК в пересчете на одну клетку в этих нормальных популяциях существенно ниже, чем в популяциях раковых клеток (Wright et al., 1996). Теломеразная активность детектируется у многих иммортальных клеточных культур, например, ТАК была обнаружена в экстрактах опухолевых иммортальных клеток человека линии HeLa (Morin, 1989), и затем еще в других опухолевых культурах. Было примерно подсчитано, что ТАК присутствует в 85% различных опухолевых клеток (Kim et al., 1994). Кроме того, оказалось, что в большинстве раковых клеток теломеры довольно короткие, обычно короче тех, которые имеют место в клетках тех тканей, из которых они возникли (Counter et al., 1992, Shay and Wright, 1996, Hastie et al., 1990). Поскольку примерно 85% опухолей человека обладают теломеразной активностью, то можно утверждать, что активация теломеразы участвует в онкогенезе. Следовательно, увеличение надежности репрессии этого фермента должно резко уменьшать вероятность развития опухоли. Можно предположить, что особенности регуляции теломеразы у человека связаны с тем, что репрессия теломеразы имеет еще одну функцию - защиту от опухолей.
Если полагать, что клетки человека способны в среднем на 50 удвоений, то из одной клетки может образоваться 2-10 клеток, которые будут весить около 1000 кг. Очевидно, что при весе опухоли в 1т говорить о защите организма поздно. Однако, на самом деле, такой расчет неверен. Эпидемиологическая статистика позволила рассчитать, что в среднем для превращения нормальной клетки в опухолевую требуется от трех до семи независимых случайных событий (Альберте, 1994). Таким образом, при развитии опухоли происходит несколько этапов клонирования. Если положить, что в среднем частота мутаций 1 на 10 клеток, то каждое такое событие потребует примерно 20 генераций (220 10б). Значит, для образования опухоли потребуется в среднем от 60 до 140 генераций. Как видно, ограничения в 50 удвоений вполне достаточно для остановки роста большинства опухолей на еще не диагностируемых стадиях. Кроме того, посылка о том, что клетка организма способна в среднем на 50 делений, сомнительна, поскольку к такому количеству делений способна только малая доля клеток. К сожалению, трудно установить пролиферативный потенциал отдельных клеток в составе организма. Опыты, проведенные в культуре клеток, свидетельствуют, что даже внутри одного клона клеток существует огромная гетерогенность клеток по пролиферативному потенциалу.
Частота спонтанной реактивации теломеразы в диплоидных фибробластах человека, трансформированных вирусом SV40, после прохождения ими дополнительных раундов репликации, составляет 3 10 -5 10"8 (Shay and Wright, 1996). В нормальных нетрансформированных фибробластах человека спонтанная реактивация теломеразы (иммортализация) настолько редка, что, подобные случаи невоспроизводимы. Столь низкая вероятность указывает на то, что, скорее всего, реактивация теломеразы требует как минимум двух мутационных событий.
Все воспроизводимые случаи иммортализации фибробластов человека в культуре происходят после того, как клетки пройдут дополнительные раунды репликации, а это значит, что реактивации теломеразы предшествует чрезмерное укорачивание теломер.
Возможной причиной увеличения вероятности реактивации теломеразы при чрезмерном укорачивании теломер является резкое увеличение генетической нестабильности хромосом с короткими теломерами.
Учитывая все вышесказанное, можно предположить (Егоров, 1997), что, в большинстве случаев, первым шагом при канцерогенезе является не реактивация теломеразы, но другие события, позволяющие клетке, прежде всего, получить селективное преимущество в росте. В пользу этой возможности свидетельствует также тот факт, что теломеры опухолевых клеток с реактивированной теломеразой почти всегда короче, чем теломеры из окружающей опухоль нормальной ткани.
Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, культура XI
Стромальные клетки костного мозга человека, полученные из трепаната костного мозга верхней челюсти, были любезно предоставлены нам С.М.Тереховым (Медико-генетический научный центр РАМН). Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% FBS (Hyclone, США), 0,32мг/мл глутамина, 40ед/мл гентамицина. После достижения монослоя клетки пересевали стандартным способом, разводя в 2-4 раза.
Мезенхимальные стромальные клетки, полученные из липоаспирата (LA) были любезно предоставлены С.М.Тереховым (МГНЦ РАМН). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 15% FBS (HyClone, США) и 0,32мг/мл глутамина, 40ед/мл гентамицина. После достижения монослоя клетки пересевали стандартным способом, разводя в 2 - 4 раза.
Первичные культуры нейральных стволовых клеток человека (NSC) были любезно предоставлены И.Н.Сабуриной (Институт биологии гена РАН). Клетки были получены из переднего отдела мозга эмбриона человека (медицинского абортуса) в возрасте 9 недель. Мозг эмбриона механически измельчали, обрабатывали растворами трипсина и Версена, пипетировали и переносили в культуральную среду. Клетки культивировали в двух различных условиях. Обычная полная ростовая среда состояла из следующих компонентов: DMEM/F12, 2% Fetal Clone III (Hyclone, США), 10 нг/мл FGF-2, 10 нг/мл EGF, 0,11 мг/мл пирувата натрия, 0,32мг/мл глутамина и 40ед/мл гентамицина, 1-кратная концентрация N2 Supplement (Invitrogen, США). (Fetal Clone III, cat.#SH30109.03 - заменитель сыворотки, производимый компанией Hyclone, США; N2 supplement - композиция цитокинов, поставляется в 100-кратной концентрации). При ведении клеток на обычной полной ростовой среде, клетки культивировали как обычную пластик-адгезивную монослойную культуру. Пересев осуществляли при достижении монослоя, при помощи растворов Версена и трипсин-Версена. В случае удаления из полной ростовой среды компонента Fetal Clone III, мы получали безсывороточную среду, на которой клетки NSC росли в виде шарообразных свободно плавающих агрегатов, называемых нейросферами. Пересевались нейросферы при помощи растворов Версена и трипсин-Версена: сферы осаждали центрифугированием, промывали Версеном, снова осаждали и ресуспендировали в растворе трипсин-Версена. Далее инкубировали 10 минут при 37С и многократно ресуспендировали до получения моноклеточной суспензии. Моноклеточную суспензию высевали в плотности порядка 104 - 105 кл на культуральный флакон 25см2, и через 3-7 дней наблюдали образование нейросфер из единичных клеток. Смену среды осуществляли при помощи осаждения центрифугированием нейросфер.
Клетки линии ТК-164 были любезно предоставлены М.Кост-Алимовой (Каролинский институт, Швеция). Клетки ТК-164 являются опухолевыми клетками почечной карциномы человека. Данная линия охарактеризована в ряде исследований (Bear et al., 1987; Kavoussi et al., 1989). Клетки ТК-164 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (HyClone, США) и 0,32мг/мл глутамина, 40ед/мл гентамицина. После достижения монослоя клетки пересевали стандартным способом, разводя в 8-16 раз. Все типы клеток культивировали в СОг-инкубаторе (Thermo Scientific, США) с вытеснением кислорода при помощи сжатого азота, в условиях +37С, 5%С02, 3%02.
Для индукции клеток к дифференцировке в адипогенном направлении, дожидались когда клетки образуют монослой и добавляли дифференцировочную среду - полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 1мкМ дексаметазона, 0,5мМ З-изобутил-1-метилксантина и 1 мкг/мл инсулина. Среду меняли через каждые 3-4 дня. Образование характерных жировых клеток начиналось через 7-10 дней с начала дифференцировки. После 21 дня культивирования клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 4% формальдегидом (на PBS) 10 мин при комнатной темпераутре, после чего опять промывали PBS и окрашивали Суданом-IV, Юмин при комнатной температуре. Краситель Судан-IV разводили в 70% этаноле до насыщения (ярко-красный цвет), после чего фильтровали.
Фотографии клеток выполняли при помощи инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diaphot ("Nikon", Япония) и цифрового фотоаппарата Nikon D70 («Nikon», Япония).
Для индукции клеток к дифференцировке в остеогенном направлении добавляли дифференцировочную среду - полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением ОДмкМ дексаметазона, ЮмМ Р-глицерофосфата, ЮОмкМ аскорбиновой кислоты. Среду меняли каждые 3-4 дня. Косвенным признаком дифференцировки является усиление цитоскелета клеток, в результате чего возможны образование стяжек и узлов напряжения внутри конфлюэнтного монослоя клеток. После 14 дней культивирования клетки промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом (на PBS) 10 мин при комнатной температуре, опять промывали PBS и красили 2%-ым Ализариновым красным (рН 4.2) 10 мин при комнатной температуре. Ализариновый красный разводили в дистиллированной воде, 2 г на 100мл и доводили рН до 4.1-4.3 при помощи гидроксида аммония.
Клетки высаживали на покровные стекла, в 6-луночных или 24-луночных планшетах (Costar, США). Перед фиксацией стекла с клетками дважды промывали PBS или раствором Хэнкса, фиксировали 4% формальдегидом на PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, затем дважды промывали PBS и окрашивали. При необходимости препараты хранили в PBS при +4С до окрашивания, не более 7 суток.
Перед окрашиванием антителами стекла в течение 2 часов при комнатной температуре обрабатывали блокирующим раствором (БР, см.ниже). Далее наносили первые моноклональные антитела (концентрация 1/100-1/300 в БР от первоначальной) и инкубировали 2 часа при +37С, отмывали 3 раза по 5 минут БР, при комнатной температуре. Затем наносили вторые антитела (концентрация 1/500-1/1000 в БР от первоначальной) с флуоресцентным красителем, инкубировали 1 час при +37С, отмывали 3 раза по 5 минут БР, при комнатной температуре. Препараты с клетками окрашивали раствором Хехста 33258 (Змкг/мл на PBS) или DAPI (1,5 мкг/мл на PBS) 15 мин при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой и заключали в 85% глицерин на PBS. Фотографировали препараты с помощью прямого флуоресцентного микроскопа Olympus ВХ61 и инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus СКХ41 («OLYMPUS», США).
Для иммуногистохимического анализа клеток на экспрессию белка каталитического компонента теломеразы использовались моноклональные мышиные IgM антитела аЬ5181 фирмы Abeam (Англия). Процедура иммуноцитохимическои окраски антителами на каталитический компонент теломеразы (hTERT) несколько отличалась от стандартно принятой методики, поэтому приводится в этом разделе отдельно.
Клетки для фиксации и окраски наращивали на покровных стеклах, в плотности, не превышающей 50 тыс.кл./см2. Перед фиксацией клетки дважды ополаскивали раствором PBS и фиксировали ледяным раствором метанола-ацетона (1:1) при -20С в течении 10 минут (осторожно, ацетон растворяет полистирол - фиксацию надо проводить в стеклянной посуде). На этом этапе, в случае необходимости можно залить стекла 100% этанолом и хранить препараты при -20С, но не более 48 часов. Далее для окраски - удаляли раствор метанола-ацетона (или этанола) и заливали раствором 2N НС1, инкубировали 20 мин при комнатной температуре, удаляли НС1 и нейтрализовывали остатки 0.1М боратом натрия. Инкубировали 5 мин при комнатной температуре, удаляли борат натрия и добавляли блокирующий раствор #2 (См.ниже).
Стромальные клетки костного мозга человека, культуры XI и Xl-lenti-hTERT
Полученная первичная культура клеток BMSCS, выделенная из трепаната губчатой кости человека была фенотипически гомогенна, клетки имели фибробластоподобную морфологию и хорошо прикреплялись к пластиковой подложке. Лентивирусную трансфекцию гена hTERT провели на втором пассаже после начала культивирования клеток. Трансфицированную культуру назвали BMSCS-lenti-/77E/?r, она практически не отличались от контрольной морфологически, кроме того, что на короткий отрезок времени (5-10дней) сразу после введения гена, замедлила темп пролиферации, что можно объяснить воздействием самого метода лентивирусной трансфекции.
Было проведено сравнение способностей клеток BMSCS и BMSCS-lenti-hTERT к дифференцировкам. Мы выяснили что при индукции соответствующими средами клетки обеих культур не были способны к дифференцировке в адипогенном направлении, и, в то же время, обе культуры были способны к остеогенной дифференцировке: клетки образовывали отложения внеклеточного матрикса, окрашиваемые Ализариновым красным (рис. 16).
Полученная первичная культура стромальных клеток, выделенная из липоаспирата человека (LA) имела гомогенный характер, клетки имели фибробластоподобную морфологию, хорошо прикреплялись к пластиковой подложке культуральных флаконов. Трансфекцию геном hTERT провели на 3-ем пассаже после начала культивирования. Клетки после трансфекции (LA-lenti-/zZEi?7) не изменили морфологию, сохраняли способность к контактному торможению, а также прежнюю скорость роста.
Кривая роста клеток культур LA и LA-lenti-hTERT. После 100 дней параллельного культивирования обоих типов клеток (25 УП), появились различия в темпах роста, контрольные клетки LA замедлили пролиферацию и вскоре перестали делиться, приобретя стандартный фенотип стареющий культуры. Трансфицированная культура LA-lenti-hTERT наблюдалась в течение более 160 дней, и прошла за это время более 40 УП (рис. 17).
Была проверена способность клеток LA и LA-lenti-/z7 r к дифференцировке по адипо- и остеогенным направлениям. Так же как и контрольные клетки, клетки LA-\enti-hTERТ показали в обоих случаях ярко выраженную способность к дифференцировкам (рис. 18).
Дифференцировка клеток в культуре. А. Адипогенная дифференцировка клеток LA-lenti-hTERT, окраска Судан-IV. Б. Остеогенная дифференцировка клеток LA-lenti-hTERT, окраска Ализариновым красным. Фазовый контраст, цифровое контрастирование.
Поскольку иммортализация клеток может сопровождаться их злокачественной трансформацией, мы решили проверить на одной из трансфицированных культур клеток, обладают ли они качествами, присущими опухолевым клеткам, а именно: отсутствием контактного торможения при культивировании и отсутствием реакции на сывороточное 4500 4000 3500 -і 3000 2500 2000 1500 1000 500 4
Культуры клеток ТК-164 и BMSCS-lenti-hTERT. В результате теста на наличие контактного торможения (рис. 19) нами было показано, что клетки BMSCS-lenti-ZzTE r обладают способностью к контактному торможению, в отличие от клеток линии ТК-164, которые пролиферируют вне зависимости от плотности клеток в культуре.
Результаты теста на сывороточное голодание. Культуры клеток BMSCS lenti-hTERT(A) и ТК-164 (Б). Результаты теста на сывороточное голодание (рис. 20) показали, что клетки BMSCS-lenti-ZzTE/ r оказались чувствительны к наличию сыворотки в среде. Так, после удаления сыворотки в среде, доля Ki-67 клеток BMSCS-lenti-hTERT заметно упала по сравнению с долей Ki-67+ клеток, культивируемых на обычной полной ростовой среде с 10% FBS. Клетки линии ТК-164, в свою очередь, оказались нечувствительны к сывороточному голоданию, доля клеток, экспрессирующих Ki-67 в безсывороточных условиях практически не снижалась в течение 4-х дней, т.е. клетки продолжали пролиферировать с прежней скоростью.
Полученная первичная культура НСК человека (NSC) имела гетерогенный характер, внутри культуры наблюдалось несколько типов клеток, различающихся морфологически. Исходя из наблюдений, полученных при фазово-контрастном микроскопировании, можно было выделить как минимум 3 доминирующих типа клеток: распластанные эпителиальноподобные клетки, вытянутые клетки с конденсированным ядром и длинными отростками и шарообразные маленькие клетки .
В целом культура являлась пластик-адгезивной: хотя клетки последних двух типов не прикреплялись и не распластывались на пластиковой подложке, но в комплексе с клетками первого типа (эпителиальноподобные клетки образовывают подложку для других клеток), они могли расти на субстрате. Подобное гетерогенное разделение клеток внутри культуры наблюдалось нами в течение всего времени культивирования, на протяжении многих пассажей, незначительно изменяясь в процентном соотношении. Рис. 21. Первичная культура феталъных нейралъных стволовых клеток человека, NSC. Фазовый контраст, цифровое контрастирование.
Обе культуры наблюдали в течение длительного времени. После 240 дней культивирования на уровне 43 УП стали видны различия в скорости роста. Контрольные клетки NSC приобрели морфологию стареющей клеточной культуры, и перестали делиться (рис. 23). Трансфицированные клетки NSC-lenti-hTERT наблюдали более 560 дней. За это время они прошли более 80 пассажей, что соответствует более 105 циклов УП. Культура за это время не изменила свою морфологию, сохранила гетерогенный характер фенотипа и прежнюю скорость роста.
Сохранение механизмов дифференцировки в иммортализованных культурах клеток
Одной из задач нашего исследования, являлось изучение возможного влияния экспрессии гена hTERT и иммортализации культуры на такие важные характеристики стволовых клеток как способность к дифференцировке в клетки различных типов. Утрата таких способностей явилась бы важным результатом, свидетельствующим о прямой взаимосвязи функций теломеразы и состояния теломер с механизмами пластичности стволовых клеток. Для клеток мезенхимального проихсождения основополагающими типами дифференцировок являются адипо- и остеогенные направления. Кроме того, это наиболее часто встречающиеся (и соответственно изученные) в мировой литературе типы дифференцировок МСК в культуре in vitro, и которые можно было бы относительно легко воспроизвести в лабораторных условиях.
Результаты опытов по адипо- и остеогенным дифференцировкам иммортализованных культур XI-lenti-/zTERT, LA-\enti-hTERT, а также клеток-предшественников BMSCS-lenti-hTERT, показали что клетки не меняют своих характеристик относительно дифференцировочного потенциала по адипо- и остео путям развития, и, по все видимости, сохраняют свои способности в течение долгого времени, так как эксперименты по дифференцировке были поставлены несколько раз, в том числе и после того как контрольные культуры остановили пролиферацию. Эффективности дифференцировок, такие как, например, доля адипоцитов в культуре или плотность минерализованных отложений, теломеризованных клеток визуально при фазово-контрастном микроскопировании, не отличались от эффективности дифференцировки контрольных клеток ни в одном случае. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что экспрессия гена hTERT никаким образом не влияет на механизмы дифференцировок исследованных клеток, по крайне мере в поставленных условиях.
Для клеток культур NSC и NSC-\enti-hTERT основными типами дифференцировок, по которым предполагалось проследить возможные отличия, были дифференцировки по нейрональному и глиальному пути, являющиеся фундаментальными для нейральных стволовых клеток и отслеживаемых по экспрессии маркеров: (З-Ш-тубулину и GFAP, соответственно. В нашем случае при культивировании первичной культуры дифференцировка по обоим направлениям шла самопроизвольно, вызывая гетерогенность популяции. Поэтому задача по наблюдению за сохранением способностей к дифференцировке, сводилась к подсчету доли клеток содержащих маркеры р-ІП-тубулин и GFAP от общего числа клеток. Иммуноцитохимические методы, показали, что функциональная окраска по этим маркерам была взаимоисключающая — то есть, клетки, однозначно окрашиваемые на Р-П1-тубулин, никогда не окрашивались на GFAP, и наоборот, что служило одним из контролей метода. Под функциональной окраской предполагается структурное окрашивание внутренних элементов цитоскелета клетки, к числу которых принадлежат белки Р-Ш-тубулин и GFAP. В противовес функциональной окраске, также в наших исследованиях мы различали цитоплазматическую окраску клеток, когда флуоресцентный сигнал поступал от точечных гранул содержащихся в цитоплазме, и в тоже время отличался от фонового окрашивания препаратов. В этом случае, крайне редко, некоторые клетки могли окрашиваться на оба белка одновременно.
Результаты подсчета показали, что доли клеток, уходящих в дифференцировку в обеих культурах NSC и NSC-lenti-ZzTERT достоверно не отличаются. Колебания доли дифференцированных клеток внутри культуры в зависимости от времени, возможно, объясняются факторами, неучтенными во время проведения опыта, например незначительным изменением плотности посева клеток. Во всех 5 измеренных точках времени, показатели культур NSC и NSC-lenti-hTERT перекрывались своими погрешностями, что означает практическое совпадение доли дифференцированных клеток. Кроме этого, доказательством того, что теломеризация не повлияла на механизмы дифференцировки, может служить факт образования колоний различной морфологии клетками NSC-\enti-hTERT в случае посадки в малой плотности. Общая гетерогенность культуры, и образование клонов клеток с различной морфологией, иммортализоваными клетками NSC-lenti-/z77?r, на уровне 70УП свидетельствуют о сохранении процессов самопроизвольной дифференцировки и о сохраняющемся потенциале стволовых клеток внутри культуры. Также, теломеризованные клетки NSC-lenti-hTERT были способны образовывать перевиваемую культуру нейросфер, что является одним из маркеров нейральных стволовых клеток.
Кроме иммуноцитохимических анализов и микроскопирования, мы провели проверку сохранности способности клеток к дифференцировке путем анализа мРНК с помощью ОТ-ГЩР. Результаты этого исследования, выявили сохранение способностей иммортализованных клеток к дифференцировке в обоих направлениях и сохранении экспрессии нестина - маркера нейральных стволовых клеток. Небольшие отличия в экспрессии генов тирозин-гидроксилазы (ТН) и ацетил-холин-трансферазы (CHAT) — можно объяснить тем, эти гены кодируют белки участвующие в синаптической передаче сигнала, т.е. являются маркерами зрелых нейронов, устанавливающих специфические межклеточные контакты. Для образования таких белков внутри культуры требуется определенное время, необходимое для формирования межклеточных связей. Контрольные клетки NSC взятые для выделения и анализа РНК на уровне 38УП, находились уже в конце кривой своего роста, возле выхода на плато, и скорость их пролиферации была значительно замедлена. Теломеризованные же клетки NSC-lenti-hTERT, взятые для анализа на уровне 85 УП, имели обычную для себя скорость пролиферации, и время для того чтобы нарастить тот же объем клеток, требующийся для выделения РНК, у этих клеток было меньше, чем у контрольных. Возможно, именно эта разница во времени нахождения клеток на пластике и сыграла свою роль в разнице экспрессии генов ТН и CHAT. Несмотря на это, экспрессию гена CHAT в обеих культурах, можно расценить как признак сохранения у иммортализованной культуры потенциальной способности к образованию зрелых клеток-нейронов.
Схожие результаты были получены и в работах других исследователей (Hamada et al., 2005; Jim et al., 2004; Bai et al., 2004). Авторы этих работ также пришли к выводу о том, что трансфицированные hTERT культуры обладают свойствами исходных клеток, не теряя способностей к дифференцировкам. Более того, существуют данные о том, что теломеризованные клетки не только сохраняют, но и приобретают более выраженную способность к остеогенной дифференцировке, по сравнению с контрольными клетками (Jim et al., 2004; Kang et al., 2004).
