Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в молекулярной и клеточной биологии большое внимание уделяется изучению процессов, связанных с репродукцией клеток и передачей генетической информации от материнской клетки к дочерним. Двумя такими процессами у эукариотических организмов являются вегетативное клеточное деление или митоз и генеративное деление, приводящее к образованию половых клеток - мейоз. В результате этих процессов происходит распределение содержащих генетическую информацию молекул ДНК, ассоциированных в сложные надмолекулярные структуры - хромосомы. Оба эти процесса являются регулярными и служат как средством передачи идентичной генетической информации в ряду поколений вегетативных клеток (митоз), так и средством осуществления генетического многообразия популяции (мейоз). Механизмы репликации и сегрегации эукариотических хромосом в митозе и мейозе остаются малоизученными. Основные трудности их изучения заключаются в а) огромных размерах эукариотических хромосом, б) значительном числе с/5-актив-ных элементов, принимающих участие в репликации и сегрегации хромосом, и в) в сложности организации митотического и мейотического аппарата, число trans-активных элементов которого (как структурных, так и регуляторных) к настоящему времени ещё не поддаётся точному определению.
Пекарские дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, являются чрезвычайно удобным объектом для изучения репликации и сегрегации хромосом. Именно у этого объекта впервые были выделены и исследованы cis-активные молекулярные структуры, необходимые для осуществления названых выше процессов. К их числу принадлежат хромосомные репликаторы или ARS-элементы, центромеры, и теломеры. Клонирование этих последовательностей открыло широкий спектр возможностей для изучения процессов митоза и мейоза, позволяя создавать высоко избирательные селекционные системы для идентификации frans-активных элементов этих процессов, давая возможность моделировать эти процессы, в том числе создавать искусственные хромосомоподобные конструкции с заданными параметрами, как, например, искусственные кольцевые или линейные минихромосомы с устойчивой структурой. Другим преимуществом S. cerevisiae как объекта для изучения процессов репликации и сегрегации хромосом является то, что дрожжевые клетки, в отличие от клеток высших эукариот, способны к вегетативному делению как в гаплоидном так и в ди- или полиплоидном состоянии, а также, в большинстве случаев, легко переносят анеуплоидное состояние. Эти замечательные осо-
бенности пекарских дрожжей делают данный организм удобной моделью для исследования событий, связанных как с потерями хромосом, так и с их нерасхождением в митозе или мейозе.
К настоящему времени известно значительное число генов, контролирующих процесс сегрегации хромосом у S.cerevisiae. Одним из таких генов является ген CHL4, мутанты по которому впервые были получены в Лаборатории генетики митоза ИЦ РАН. Замечательной особенностью одной из мутаций в этом гене, chl4-1, является относительно стабильное поддержание мутантными клетками дицентрических плазмид без перестроек. Эта особенность делает CHL4 особенно ценным объектом для изучения контроля митотическои сегрегации хромосом. Продукт гена CHL4 предположительно является компонентом дрожжевого кинетохора.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является изучение природы мутации chl4-1, а также более детальное выяснение места CHL4 в митозе путём поиска клеточных компонентов, взаимодействующих с продуктом гена CHL4.
В связи с этим, задачи исследования определены следующим образом:
1) клонировать мутантную аллель гена CHL4 (ch!4-1), определить при
роду мутации и её влияние на состав и структуру экспрессируемого белка;
2) получить коллекцию мутантов, проявляющий фенотип син
тетической летальности в сочетании с мутацией сп14-1;
-
провести генетический анализ синтетических леталей, выявив их основные характеристики;
-
провести более детальный анализ мутанта с наиболее ярким и устойчивым фенотипом синтетической летальности, охарактеризовав его на уровне ДНК и аминокислотной последовательности.
Научная новизна полученных результатов
Клонирована мутантная аллель гена CHL4 - chl4-1, проведена точная локализация сайта мутации, показано, что мутация представляет собой делецию одного основания, вызывающую сдвиг рамки считывания, который приводит к экспрессии укороченного белка, лишённого участка, содержащего гипотетический сайт связывания с ДНК.
Получена коллекция из трёх мутантов ccl (от chl4 co-lethality), проявляющих фенотип синтетической летальности в сочетании с мутацией chl4-1. Для всех трёх мутаций показана моногенная природа, а также принадлежность их к разным группам комплементации.
Клонирован и секвенирован один из генов, принадлежащих к ccl коллекции - CCL1. Показано, что данному гену соответствует открытая рамка
считывания длиной 1392 п.о., кодирующая белок с молекулярным весом 53433 Дальтон, содержащий вероятные сайты фосфориляции протеин киназами (казеин-киназой II, протеин-киназой С и тирозин-киназой), а также две последовательности, возможно формирующие структуры типа лейциновых молний.
Установлено, что ген CCL1 является необходимым для жизнедеятельности клетки, поскольку полная его делеция ведёт к гибели клеток. Сделаны наблюдения свидетельствующие в пользу того, что мутация в гене CCL1 ведёт к несогласованию процессов почкообразования и митоза, которое приводит к гибели клеток в отсутствие продукта гена CHL4.
Показано, что мутация в гене CCL1 (сс11-1) ведёт к снижению стабильности поддержания центромерных плазмид, что позволяет сделать предположение о вовлечённости продукта данного гена в митоз, а также фенотипически сближает этот ген с CHL генами.
Практическая ценность работы
В работе получена коллекция мутантов по генам, вовлечённым в процесс репродукции дрожжевых клеток. Из самого метода селекции мутантов следует вывод о функциональной связи соответствующих генов с CHL4, продукт которого, предположительно, является компонентом кинетохора и, таким образом, непосредственно вовлечён в процесс сегрегации хромосом. Обнаружение мутантов no CCL генам, по крайней мере, один из которых, CCL1, описан впервые, расширяет поле исследования процессов митоза.
Дрожжевые штаммы, несущие точковые и делеционные мутации в гене CCL1, могут быть использованы в изучении процессов регуляции и координации клеточного цикла дрожжей, а именно почкообразования и сегрегации хромосом.
Апробация работы
Всего по теме дисертации опубликовано 4 работы. Главные результаты исследований публикуются в международном журнале. Результаты отдельных экспериментов были доложены на Международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Вена, 1992). Апробация работы проведена на заседании Лаборатории генетики митоза Института цитологии РАН 2 ноября 1995 г.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов и результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 154 источника. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста и иллюстрирована 20 рисунками и 6 таблицами.
