Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Этиопатогенез ишемического инсульта и факторы риска 8
1.2. Генетические факторы предрасположенности к ИИ 11
1.2.1. Моногенные формы ИИ 12
1.2.2. Полигенные формы ИИ 13
1.2.3. Экспериментальные модели ИИ 14
1.3. Поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ 15
1.3.1. Результаты полного геномного сканирования 16
1.3.2. Данные, полученные с использованием подхода «ген-кандидат » 17
1.3.3. Результаты применения метода мета-анализа 36
1.3.4. Результаты исследования сочетанных ассоциаций 37
2. Материалы и методы
2.1. Объект исследования 3 9
2.2. Использованные реактивы 41
2.3. Выделение геномной ДНК из периферической крови 42
2.4. Геномное типирование 43
2.4.1. Анализ полиморфизма A4266G (Thr312Ala) гена альфа-фибриногена (ПЦР-ПДРФ) 43
2.4.2. Анализ полиморфных участков С-249Т и С-148Т в гене бета-фибриногена (ПЦР-ПДРФ) 44
2.4.3. Анализ полиморфного участка А-491Т гена АРОЕ (ПЦР-SSP) 45
2.4.4. Анализ полиморфного участка Т-427С гена АРОЕ (ПЦР-ПДРФ) 46
2.4.5. Геномное типирование эпсилон-полиморфизма гена АРОЕ (ПЦР-ПДРФ) 47
2.4.6. Анализ полиморфного участка T495G гена LPL (ПЦР-ПДРФ) 48
2.4.7. Анализ полиморфизма C1595G (Ser447Ter) гена LPL (ПЦР-ПДРФ) 49
2.4.8. Анализ полиморфизма I/D гена АСЕ 50
2.4.9. Анализ полиморфизма G-1903А (СМА/В) гена СМА (ПЦР-ПДРФ) 50
2.5. Статистический анализ 51
3. Результаты и обсуждение
3.1. Выбор генов и их полиморфных участков для анализа ассоциации с ИИ 53
3.1.1. Полиморфизм генов FGA и FGB 53
3.1.2 Полиморфизм генов АРОЕ и LPL 54
3.1.3. Полиморфизм генов АСЕ и СМА 62
3.2. Анализ этнических различий в распределении аллелей и генотипов проанализированных полиморфных участков у русских и якутов 65
3.3. Анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с ИИ у русских и якутов 70
3.4. Комплексный анализ генетической предрасположенности к ИИ с учетом пола и возраста с использованием алгоритма APSampler 71
3.5. Комплексный анализ связи носительства аллелей, генотипов и их сочетаний с тяжестью АГ, предшествующей развитию ИИ 78
Заключение 83
Выводы 85
Список литературы 87
- Данные, полученные с использованием подхода «ген-кандидат
- Результаты исследования сочетанных ассоциаций
- Статистический анализ
- Полиморфизм генов АРОЕ и LPL
Введение к работе
Актуальность проблемы. Во всем мире, в том числе и в России, инсульты являются одной из самых важных проблем здравоохранения. По материалам ВОЗ, частота инсультов колеблется от 1.5 до 7.4 случаев на 1000 человек населения, нарастая с возрастом, поскольку для этого заболевания характерно позднее развитие.
По данным регистра мозгового инсульта, в России заболеваемость составляет 3.36 на 1000 человек. В целом в России регистрируется ежегодно более 400 000 случаев инсульта, при этом на долю Москвы приходится более 24 000 случаев в год. В Якутске заболеваемость составляет 2.88 на 1000 человек (без разделения по национальностям), что несколько ниже общероссийского показателя. В России, как и в большинстве развитых стран мира, инсульт занимает второе-третье место в структуре причин общей смертности (21,4%) (после ишемической болезни сердца и онкологических заболеваний). При этом смертность от инсульта в России – одна из самых высоких в мире. Инвалидизация после перенесенного инсульта достигает показателя 3.2 на 10 000 населения, занимая первое место среди всех причин первичной инвалидности. Социально-экономическая значимость этого заболевания связана еще и с тем, что среди заболевших инсультом 1/3 - люди трудоспособного возраста, а к труду возвращается не более 20 % больных [Гусев ЕИ, 2003]. В нашей стране, как и в большинстве стран мира, преобладают ишемические инсульты (ИИ), доля которых в структуре заболевания составляет до 80%.
Подавляющее большинство ИИ относится к комплексным (мультифакториальным) заболеваниям, и их развитие, клиническое течение и исход обусловлены как влиянием факторов внешней среды, так и наследственной предрасположенностью. Определенные успехи в понимании роли отдельных генов в молекулярных механизмах реализации повреждения мозга достигнуты лишь в рамках моногенных патологических состояний. В исследованиях же, посвященных генетике ИИ как комплексного полигенного заболевания, как правило, не учитывали совместный вклад множества независимо действующих и/или взаимодействующих полиморфных генов. Даже при анализе роли отдельных генов в развитии ИИ результаты опубликованных исследований трудно сопоставлять из-за недостаточного внимания, которое уделяли до последнего времени этнической гомогенности исследуемых групп.
До настоящего времени исследований генетической предрасположенности к ИИ для якутской популяции не проводили, а для русской популяции они касались роли отдельных генов-кандидатов, из которых с нашим исследованием в основном перекрывается только анализ инсерционно-делеционного полиморфизма гена АСЕ [Скворцова ВИ и др., 2003].
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлся комплексный анализ совместного вклада в предрасположенность к ИИ ряда генов, белковые продукты которых вовлечены в развитие основных сердечно-сосудистых заболеваний. Исследование проводили в двух российских этносах - у русских и якутов, представляющих расы европеоидов и монголоидов, соответственно.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Провести геномное типирование выбранных на основе анализа литературы полиморфных участков генов-кандидатов (FGA, FGB, APOE, LPL, ACE и CMA) для русских и якутов, перенесших ИИ, а также для индивидов без ИИ в анамнезе, совпадающих с больными по этнической принадлежности, полу и возрасту.
2. Изучить этнические различия в распределении аллелей и генотипов проанализированных полиморфных участков у русских и якутов, как в группах больных ИИ, так и в контрольных группах.
3. Провести комплексный анализ генетической предрасположенности к ИИ методом “случай-контроль” отдельно для русских и якутов с учетом пола и возраста.
4. Отдельно в группах русских и якутов провести комплексный анализ связи носительства аллелей, генотипов и их сочетаний с тяжестью артериальной гипертензии (АГ), предшествующей развитию ИИ.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые для двух популяций России, русских и якутов, проведен комплексный анализ связи носительства аллелей, генотипов и сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов FGA, FGB, APOE, LPL, ACE и CMA с ИИ и тяжестью АГ до развития ИИ с учетом пола и возраста рассматриваемых индивидов.
Выявлены высокодостоверные различия частот большинства аллелей и генотипов исследованных полиморфных участков между индивидами русской и якутской национальности, а также существенные этнические различия во вкладе отдельных полиморфных участков генов в восприимчивость к ИИ, диктующие необходимость этнической гомогенности групп при исследовании факторов генетической предрасположенности к полигенным заболеваниям. Впервые показано участие в развитии ИИ генов, кодирующих компоненты систем гемостаза (FGB) и липидного обмена (APOE и LPL) в двух этнических группах, а также гена ACE ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) только у якутов.
При разделении больных ИИ на подгруппы в зависимости от предшествующего заболеванию уровня артериального давления впервые выявлена ассоциация тяжести АГ с носительством аллеля -249C FGB у русских и аллеля 495T LPL у якутов. Кроме того, у якутов выявлена ассоциация тяжести АГ с носительством сочетания трех аллелей: -249C FGB, e4 APOE и -1903A CMA. Таким образом, выявлены факторы генетической предрасположенности к АГ у индивидов русской и якутской этнической принадлежности, перенесших ИИ.
Проведенная работа создает основу для выявления группы риска ИИ, опираясь на скрининговые исследования населения. Ее практическая значимость определяется возможностью проводить превентивную терапию, компенсирующую генетически обусловленные неблагоприятные особенности функционирования систем гемостаза, липидного обмена и РААС для тех лиц, у которых выявлена наследственная предрасположенность к ИИ и предшествующей ему АГ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых ученых-кардиологов, июнь, 2005 г., Москва; Российском национальном конгрессе кардиологов, октябрь 2005 г., Москва; Московской международной конференции "Биотехнология и медицина", март 2006 г., Москва; Межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы клинической неврологии", январь 2007 г., Иркутск; межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава, апрель 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 6 тезисных сообщений.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы" и "Список литературы". Работа изложена на 117 страницах и включает 12 рисунков, 8 таблиц. Список литературы содержит 260 ссылок.
Данные, полученные с использованием подхода «ген-кандидат
Выяснение роли того или иного гена-кандидата в большинстве исследований проводят методом «случай-контроль», сравнивая частоты аллелей гена или генетического маркера в группах больных и здоровых индивидов из одной популяции. При этом наследование выявляемых аллелей рассматривается на уровне популяции, что придает способу большую статистическую мощность в сравнении с анализом сцепления. Другим важным преимуществом популяционного анализа является отсутствие необходимости составлять большие семейные выборки. Однако этот подход ограничен тем, что требуется предварительно выбрать целесообразные для анализа гены-кандидаты, опираясь на современные представления о роли кодируемых ими белков в развитии заболевания, которые остаются ограниченными несмотря на технологические достижения в области протеомики. Существенным также является правильный выбор функционально значимого полиморфного участка исследуемого гена, что во многих случаях остается недостижимым. При использовании анализа методом «случай-контроль» крайне важно убедиться, что наблюдаемые различия частот аллелей между больными и здоровыми индивидами действительно обусловлены ассоциацией, а не являются случайными. Это во многом зависит от размеров выборки и подбора адекватной контрольной группы. В целом, надежным методом подтверждения ассоциации является воспроизведение полученного результата во множестве независимых исследований. Полученные при анализе ассоциаций данные о роли конкретных полиморфных участков в развитии заболевания нуждаются в окончательном подтверждении методом сцепления.
Генетические исследования предрасположенности к ИИ человека в основном направлены на анализ роли генов-кандидатов, выбранных на основе их функциональной связи с патофизиологией ИИ. Как правило, гены-кандидаты для ИИ делят на пять основных групп, отвечающих названиям систем, компоненты которых эти гены кодируют. Это системы гемостаза, липидного и гомоцистеинового метаболизма, продукции оксида азота (II) и ренин-ангиотензин-альдостероновая система, участие которых в развитии ИИ в настоящее время очевидно. Кроме того, существует еще целый ряд генов, не входящих в эти системы, которые также рассматривают в качестве вероятных кандидатов на ассоциацию с этиопатогенезом ИИ.
Важно отметить, что, в целом, генетические факторы риска развития ИИ являются общими для большинства сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку все продукты этих генов вовлечены в так называемый сердечно-сосудистый континуум. Под последним понимают совокупность связанных между собой патологических процессов в сердечнососудистой системе (атеросклероз, АГ) и вариантов их исходов (инсульт, инфаркт миокарда), развивающихся на единой патофизиологической базе (нейро-эндокринная дисрегуляция, эндотелиальная дисфункция, тромбозы). Однако рамки этого обзора не позволяют останавливаться на работах, посвященных генетической предрасположенности к таким важным факторам риска развития ИИ, как атеросклероз и АГ. Современное состояние этой проблемы подробно изложено в ряде обзоров (см., например [56, 57, 58, 59]).
Результаты исследований, посвященных анализу аллельного полиморфизма генов-кандидатов для ИИ методом «случай-контроль» и выполненных на различных выборках с разнообразными клиническими и этническими характеристиками, приведены в сводной таблице 2 (см. ниже). Общее количество публикаций по теме генетической предрасположенности к ИИ при поиске в PubMed (ключевые слова: ischemic stroke OR cerebral infarction OR cerebrovascular disease AND gene AND polymorphism; отношение их только к "humans"; дата: последнее десятилетие) на 3 марта 2007 г. составляло 824 работы.
Из приведенных в таблице 2 данных видно, что указанные выше системы гомеостаза действительно вовлечены в развитие инсульта. Для системы гемостаза показаны ассоциации инсульта с полиморфными участками генов ТРА, FGB, GPIa/IIa, GPIIb/GPIIIa, Factor II, Factor V, Factor VII, Factor XII, и PAI 1. Продукты этих генов играют важную роль в регуляции свертывающих и противосвертывающих механизмов гемостаза. Нарушения последних, а также неспособность компенсировать эти нарушения часто приводят к возникновению инсульта и целого ряда других сердечно-сосудистых заболеваний.
В работах, посвященных инсульту и системе липидного метаболизма, показана роль в заболевании генов АРОЕ, ALOX5AP, LPL, LDLR и PON1. Эти гены кодируют белки, участвующие в регуляции липидного профиля плазмы крови. Патологические изменения в процессах обмена липидов (в том числе холестерина и его эфиров) во многих случаях приводят к развитию как эссенциальной гипертензии и гипертензии при атеросклерозе, так и самого атеросклероза. А они, в свою очередь, лежат в основе большинства случаев инсульта.
Атеросклероз может также являться следствием нарушений в системе метаболизма гомоцистеина, поскольку последний представляет собой атерогенный и протромботический фактор. Кроме того, такие нарушения могут приводить к тяжелой гомоцистеинемии и гомоцистеинурии, являющихся факторами риска развития инсульта и других сосудистых заболеваний. Вклад в формирование предрасположенности к инсульту показан для следующих генов этой системы: MTHFR, MS и CBS.
Относительно малоизученной остается система продукции оксида азота (II). Результаты представленных в таблице работ свидетельствуют о роли в развитии инсульта гена eNOS. Кодируемая им эндотелиальная синтаза N0 оказывает влияние на тонус, целостность, рост и тромбогенные свойства кровеносных сосудов. Соответственно, она играет важную роль в развитии одного из главных факторов риска инсульта -артериальной гипертензии.
Результаты исследования сочетанных ассоциаций
В результате исследования сочетанных ассоциаций с ИИ были выявлены не только аллели, показанные в работах по одиночным ассоциациям и в мета-анализе, но также и ряд новых. Так, в отдельности не была выявлена связь полиморфизма гена АРОВ с ИИ. Однако в сочетании с аллелем є4 АРОЕ он вносит вклад в предрасположенность к заболеванию [101]. Можно отметить, что белки, кодируемые обоими генами, относятся к одной и той же системе метаболизма липидов. Подобная картина наблюдается и для полиморфизма гена eNOS, аллели и генотипы которого поодиночке оказались не связанными с ИИ в большинстве исследований. При этом сочетание ряда генотипов eNOS с определенными генотипами MTHFR и АСЕ значительно повышает риск развития заболевания [193]. В этом случае продукты генов представляют три различных системы гомеостаза. Также резко повышает вероятность возникновения заболевания сочетание определенных аллелей/генотипов двух генов, кодирующих предсердный натрийуретический пептид (ANP) и его рецептор (NPRA) [159]. Если для рассматриваемого полиморфизма ANP была показана связь с ИИ и по отдельности, то для одиночных аллелей NPRA ассоциацию с заболеванием не наблюдали. Для остальных генов, аллели которых входят в выявленные сочетания, связь с ИИ была показана как в исследовании отдельных ассоциаций (LPL, tPA и PAI-1) [107, 60, 97], так и в мета-анализе (АРОЕ, MTHFR и АСЕ) [183, 190, 191]. Это служит еще одним подтверждением того, что они действительно играют роль в патогенезе ИИ. Следует заметить, что однозначного объяснения эффектов выявленных в указанных работах сочетаний на данный момент нет. По-видимому, в этих случаях может играть роль как межгенное взаимодействие (включая косвенное взаимодействие посредством их белковых продуктов [195]) (например, для генов ANP и NPRA), так и аддитивный вклад независимо ассоциированных с ИИ аллелей различных генов или аллелей полиморфных участков одного и того же гена (например, в случае MTHFR).
В целом, из анализа литературы, посвященной изучению генетической предрасположенности к ИИ, можно сделать выводы о наиболее целесообразном алгоритме проведения исследований. Так, перспективным представляется анализ выборок больных с ИИ, четко дифференцированным от других клинических форм инсульта. При этом следует разграничивать редкие моногенные ИИ и наиболее широко представленные полигенные формы заболевания. Для решения проблемы различной представленности аллелей в разных этносах исследование выгодно проводить для этнически гомогенных популяций. При этом для выявления различий в роли одних и тех же генов в развитии ИИ у индивидов с разной этнической принадлежностью целесообразно включать в исследование популяции, представляющие несколько рас, например, европеоидов и монголоидов. Необходимо также учитывать вклад в развитие ИИ других факторов, помимо наследственности. При этом важную роль могут играть как неустранимые факторы риска (например, пол и возраст), так и модифицируемые, главными из которых является АГ и атеросклероз. Таким образом, в настоящее время наибольшей эффективности можно ожидать от комплексного анализа генетической предрасположенности к полигенному мультифакториальному
Для настоящего ретроспективного исследования методом «случай-контроль» использовали образцы из коллекции крови и геномной ДНК следующих групп индивидов: 1) контрольная группа, составленная из 127 русских индивидов без анамнестических и диагностических указаний на стойкие и преходящие нарушения мозгового кровообращения, средний возраст (ср. возраст) ± SD (стандартное отклонение) - 61.2 + 13.8 лет. Из них 68 мужчин (ср. возраст - 58.4 ± 13.5) и 59 женщин (ср. возраст 64.4 ± 13.6). 2) 200 русских больных ИИ, ср. возраст - 64.1 ± 10.8 лет. Из них 123 мужчины (ср. возраст - 61.2 ± 9.8) и 77 женщин (ср. возраст - 68.7 ± 10.7). Все индивиды из русской популяции (группы 1 и 2), вошедшие в исследование, были обследованы на кафедре неврологии и нейрохирургии Российского Государственного Медицинского Университета на базе 12-го и 13-го неврологических отделений ГКБ №1 им. Н.И.Пирогова в 2004-2006 гг. Клиническое обследование включало в себя исследование неврологического и соматического статуса, проведение общеклинических исследований (электрокардиографию (ЭКГ), контроль АД, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, определение биохимических показателей крови), МРТ и/или компьютерную томографию (КТ) головного мозга. Во всех случаях диагноз ишемический инсульт был подтвержден результатами КТ и/или МРТ. Из числа больных, включенных в исследование, 125 (62.5%) пациентов перенесли ИИ впервые, 75 (37.5%) - повторно. Значительную долю составили ИИ в системе внутренней сонной артерии (у 159 (79.5%) пациентов). В вертебрально-базиляриой системе ИИ диагностирован у 41 (20.5%) больных. Образцы крови вошедших в исследование русских индивидов были предоставлены д.м.н. М.Ю. Мартыновым и сотрудниками кафедры неврологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета. Кроме того, ими для всех индивидов была предоставлена база данных, включающая следующую информацию: возраст, пол, уровень общего холестерина, курение, потребление алкоголя, индекс массы тела, наличие/отсутствие ожирения, данные по АД (более подробно см. ниже), стенозы и степень стенозов магистральных артерий головы, наличие/отсутствие сахарного диабета, другие заболевания (охарактеризованы все индивиды), уровень креатинина, уровень фибриногена, количество тромбоцитов, скорость агрегации тромбоцитов (данные продолжают собирать и уточнять). Для индивидов, перенесших ИИ, база дополнительно содержала следующие данные: возраст развития заболевания, первый или повторный случай развития ИИ, локализация очага поражения (охарактеризованы все индивиды), патогенетический механизм ИИ, размер очага, степень восстановления (данные продолжают собирать и уточнять). 3) контрольная группа, включившая в себя 108 здоровых по медицинским показаниям индивидов якутской этнической принадлежности, ср. возраст ± SD: 57.7 ± 11.3 лет. Из них 64 мужчины (ср. возраст - 55.9 ± 12.1) и 44 женщины (ср. возраст - 60.3 ± 9.6). 4) 115 якутских больных ИИ, ср. возраст - 58.1 ± 11.5. Из них 75 мужчин (ср. возраст - 55.9 ± 12.3) и 40 женщин (ср. возраст - 62.2 + 8.4). Клиническое обследование включало в себя исследование неврологического и соматического статуса, проведение общеклинических исследований (ЭКГ, контроль АД, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, определение биохимических показателей крови), МРТ и/или КТ головного мозга (для больных). Диагноз ишемический инсульт был поставлен на основании анамнестических сведений, результатов клинического осмотра и данных дополнительных методов исследования (МРТ, КТ головного мозга, люмбальная пункция). У всех пациентов инсульт был зарегистрирован впервые. Во всех случаях ИИ развивался в системе внутренней сонной артерии.
Статистический анализ
У индивидов, составивших контрольные группы и группы больных ИИ, определяли аллельную частоту, частоты носительства генотипов и аллелей. Анализ отклонения наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга, анализ неравновесного сцепления и оценку частот гаплотипов у рассматриваемых индивидов проводили с помощью алгоритма максимизации математического ожидания (expectation maximization -ЕМ), с использованием свободно распространяемой программы Haploview 3.32 [206]. Исходную оценку ассоциации аллелей и гаплотипов с ИИ проводили по критерию %2 с использованием той же программы. Анализ ассоциации с ИИ носительства аллелей, генотипов и их комбинаций, совместно с присутствием- определенных фенотипических признаков проводили с помощью программного обеспечения APSampler, использующего метод Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику [207]. Силу выявленных таким образом ассоциаций оценивали в значениях относительного риска (ОР), рассчитанного как отношение шансов (odds ratio) по методу Вульфа [208] с помощью таблиц сопряженности 2x2 с использованием точного одностороннего критерия Фишера с использованием программы GraphPAD InStat 1.12а [209]. Достоверным считали различие сравниваемых величин при значении р 0.05. В случае анализа мультиаллельного эпсилон-полиморфизма АРОЕ вводили поправку Бонферрони [210]. Выбирали 95%-ный доверительный интервал (confidence interval, СІ) для OP и не рассматривали в качестве статистически значимых ассоциаций те, для которых доверительный интервал включал 1. Если при анализе ассоциации с тяжестью АГ наблюдали монотонную зависимость уровня АД от носительства выявленного сочетания аллелей, применяли таблицу сопряженности 2x4, а значение ОР не оценивали. результаты и обсуждение
В наше исследование генетической предрасположенности к развитию ИИ мы включили гены, которые кодируют компоненты систем, играющих ключевую роль в поддержании гомеостаза, а именно системы гемостаза (гены FGA и FGB), системы липидного метаболизма (гены АРОЕ и LPL) и РААС (гены АСЕ и СМА). Такой выбор был сделан на том основании, что, как уже обсуждалось в обзоре литературы, эти системы действительно имеют большое значение в формировании восприимчивости к ИИ. Для полиморфных вариантов генов FGB, АРОЕ, LPL и АСЕ в ряде работ было показано участие в развитии ИИ, однако в других исследованиях такой связи выявлено не было. Кроме того, в разных популяциях вклад конкретных генов в развитие заболевания может значительно отличаться, поэтому исследование генетической предрасположенности к развитию ИИ необходимо проводить отдельно для каждой популяции. Для русских же единичные работы по изучению ассоциации с ИИ были проведены только для двух из этих генов (FGB и АСЕ), а для якутов таких исследований вообще не проводили. Важно также отметить, что, насколько нам известно из опубликованных данных, связь с ИИ полиморфизма гена СМА еще не изучали, а для гена FGA была выполнена всего одна работа, в которой не выявили ассоциаций полиморфных вариантов с заболеванием (см. табл. 2). Однако роль продуктов генов СМА и FGA в регуляции АД и процессов гемостаза, соответственно, так же значительна, как и продуктов других генов, которым уже были посвящены многочисленные исследования. Поэтому вполне вероятно, что полиморфизм этих двух генов также вносит вклад в риск развития ИИ, и их следует учитывать при анализе генетической предрасположенности к заболеванию. Для анализа мы предпочтительно выбирали функционально значимые полиморфные участки, расположенные в кодирующей или в регуляторных областях генов.
Три полипептидные цепи фибриногена (альфа-, бета- и гамма-) кодируются тремя независимыми генами, FGA, FGB и FGG, соответственно. Они сгруппированы в кластер, занимающий около 50 т.п.н. на хромосоме 4q23 [211]. В работе Roy et al. [212] на гепатоцитах было продемонстрировано, что синтез бета-цепи фибриногена является скорость-лимитирующей стадией в процессе синтеза зрелого белка фибриногена. Как следствие, полиморфные участки, изменяющие уровень продукции бета-полипептида, оказывают наиболее сильное влияние и в целом на уровень фибриногена в плазме крови. Помимо этого, важную роль играют полиморфные участки, влияющие на изменение структуры самих полипептидных цепей. Одним из таких является выбранный нами для анализа полиморфизм A4266G в 5-ом экзоне гена FGA, приводящей к замене Thr на Ala в положении 312 аминокислотной цепи. Это положение находится в С-концевой области белка, важной для процессов, зависимых от фактора XIII системы свертывания крови. Например, для процесса сшивок альфа-цепей в ходе образования волокон фибрина [213]. В исследованиях in vitro было показано влияние замены Thr312Ala на интенсивность образования сшивок между цепями, и, соответственно, на плотность волокон фибрина. Некоторые исследователи предполагают, что аллель 312Ala оказывает значительное влияние на структуру тромба и повышает риск возникновения эмбола как в венозной, так и в артериальной системах [214], что может приводить к увеличению риска развития ИИ.
Полиморфизм генов АРОЕ и LPL
К настоящему времени в гене АРОЕ обнаружили двадцать один полиморфный участок, включая мультиаллельный локус в 4-ом экзоне (полиморфизм эпсилон-ароЕ) [216, 217], которому исследователи уделяют наибольшее внимание. Вошедший также и в нашу работу полиморфизм эпсилон-ароЕ определяется сочетанием двух однонуклеотидных замен в положениях Т3937С и С4075Т внутри четвертого экзона гена АРОЕ [218]. Ниболее часто встречающиеся аллели этого участка называются эпсилон-2 (е2), эпсилон-3 (еЗ) и эпсилон-4 (е4). Эти аллели, имеющие кодоминантное проявление, обеспечивают существование трех изоформ белка ароЕ (Е2, ЕЗ и Е4), которые _П7п.н. -78п.н. -48л.н. -39n.H. "25 ил.
Пример генотипирования полиморфизма A4266G (Thr3l2Ala) в гене альфа-фибриногена (4q23) методом анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции продуктов ПЦР рестриктазой RsaL Справа приведены соответствующие дайны фрагментов (в п.н.). a. схема набора рестрикционных фрагментов, характеризующих рассматриваемый полиморфизм. b. фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. Дорожки геля обозначены цифрами. М (дорожка 1) - маркер молекулярной массы (pUC19/Mv/?I); генотипы образцов указаны под соответствующими дорожками (2-6). Hindlll Bspl286\ HindlU Пример генотипирования полиморфных участков С-249Т и С-148Т в гене бета-фибриногена (4q28) методом анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции продуктов ПЦР рестриктазами Bspl2H6 I (С-249Т) и МЫ III (С-148Т). Справа приведены соответствующие длины фрагментов (в п.н.). a. схема расположения сайтов рестрикции и набора рестрикционных фрагментов, характеризующих рассматриваемые полиморфные участки b. фрагменты рестрикции после электрофореза в 2% агарозном геле.
Дорожки гелей обозначены цифрами. М (дорожка 1) - маркер молекулярной массы (pUC19/\/v/ i): генотипы образцов указаны под соответствующими дорожками (2-6). различаются аминокислотными остатками в положениях Cysll2Arg и Argl58Cys, находящихся в участке связывания ароЕ с соответствующими рецепторами. Несколько других аллелей (Е1, Е5 И Є7) встречаются чрезвычайно редко. Показано, что примерно 7 % индивидуальных фенотипических вариаций в уровне сывороточного холестерина связаны с эпсилон-полиморфизмом ароЕ [190].
В наше исследование также вошел анализ полиморфных участков А-491Т и Т-427С в промоторной области гена АРОЕ. Проведенное Bullido et al. предиктивное картирование сайтов, связывающих транскрипционные факторы, основанное на использовании базы данных TFSITES (EMBL), указывает на функциональную значимость этих полиморфных участков в промоторной области [219].
Ниже приведены схемы генотипирования и примеры анализа эпсилон-полиморфизма (рис. 4), а также полиморфных участков А-491Т и Т-427С (рис. 5) гена АРОЕ. Для гена LPL, кодирующего липопротеинлипазу (LPL) - ключевой фермент в обмене липидов и липопротеинов (ЛП), выявлено несколько полиморфных участков. Как правило, наибольшее значение многие исследователи придают полиморфному маркеру Ser447Ter, который расположен в 9-ом экзоне LPL и представляет собой однонуклеотидный полиморфизм C1595G. В случае аллеля 1595G возникает стоп-кодон, и LPL становится короче на две С-концевые аминокислоты: серии и глицин [220]. При этом именно С-концевой домен обладает двумя важнейшими функциями: связыванием липидов и гепарина. Кроме того, для этого участка была показана роль в связывании LPL с белком, родственным рецептору липопротеинов низкой плотности [221]. Таким образом, рассматриваемый полиморфизм, который мы также включили в нашу работу, может оказывать значительное влияние на функционирование фермента и, соответственно, на концентрацию практически всех классов липопротеиновых частиц в плазме крови [221]. Помимо этого, в наше исследование вошел расположенный в 8-ом интроне гена LPL полиморфный участок T495G, для которого показана связь с уровнем триглицеридов в плазме [222].
