Введение к работе
Актуальность проблемы. Приобретение белком уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Сворачивание белка остаётся самым непонятным в настоящее время этапом в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку. Механизм этого процесса и управляющие им законы не выяснены, несмотря на разнообразные экспериментальные и теоретические подходы, применяемые для его изучения и моделирования. Таким образом, актуальность темы исследований следует из фундаментальной значимости проблемы. Кроме того, пристальный интерес к механизмам сворачивания обеспечен важностью их понимания для медицины и биотехнологии. Наиболее актуальны в решении проблемы сворачивания экспериментальные работы, в которых сворачивание белков исследуется в условиях максимального приближения к природной ситуации, к сворачиванию синтезированных de novo белков в клетках и бесклеточных экстрактах. Работа направлена на изучение сворачивания синтезированного de novo белка и определению этапа биосинтеза, на котором синтезируемая полипептидная цепь приобретает пространственную структуру нативного биологически активного белка.
Цель и задачи работы. В настоящее время принято считать, что котрансляционное сворачивание многодоменного белка происходит подоменно (Netzer and Hartl, 1997), т.е. пространственная структура каждого домена формируется только после его синтеза и появления из рибосомы. Следствием этой концепции является вывод о пост-трансляционном сворачивании однодоменных белков. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы выяснить, возможно ли формирование незавершенным однодоменным белком, находящимся на рибосоме, пространственной структуры, идентичной или близкой соответствующей части нативной структуры правильно свёрнутого домена. Были поставлены следующие задачи: 1) определить, связывают ли растущие цепи а-глобина человека гемин, добавленный в бесклеточную систему трансляции; 2) выяснить, могут ли растущие полипептиды связывать свободный гем, не находящийся в составе эндогенного гемоглобина; 3) определить, по достижении какой длины растущие полипептиды приобретают компетентность к специфичному связыванию гема; 4) выяснить, можно ли синтезировать в бактериальной бесклеточной системе функционально активный белок, содержащий дисульфидные связи - проинсулин человека; 5) подобрать условия синтеза, при которых сворачивание проинсулина в нативную структуру происходит с высоким выходом. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые показано, что однодоменный белок (а-глобин человека) способен приобретать конформацию,
компетентную к связыванию лиганда (гема), в процессе синтеза на рибосоме, т.е. котрансляционно. При этом обнаружено, что третичная структура растущей цепи а-глобина, компетентная к связыванию гема, формируется задолго до построения полноразмерной цепи этого белка. Также были получены свидетельства в пользу того, что формирование структуры гем-связывающего центра глобина происходит в непосредственной близости от пептидилтрансферазного центра рибосомы. Кроме того, в работе показано, что в бесклеточной системе трансляции можно синтезировать функционально активный белок, содержащий дисульфидные связи -проинсулин человека, а также найдены условия для получения высокого выхода правильно свёрнутого новосинтезированного проинсулина.
Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы», «Методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа содержит 15 рисунков и 9 таблиц.
