Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 7
1.1. Теории старения клеток 7
1.2. Ограниченность пролиферативного потенциала клеток 24
1.3. Гетерогенность клеточной популяции 36
ГЛАВА 2. Материал и методы 39
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждения 46
3.1. Подбор питательных сред, условии взятия биопсии и методик клонирования 46
3.2. Пролиферативная способность клеток при длительном культивировании 54
3.3. Пролиферативный потенциал клеток разного тканевого происхождения 71
3.4. Клональная гетерогенность фибробластов человека. 74
3.5. Индивидуальная изменчивость лролиферативного потенциала диплоидных фибробластов человека . 84
3.6. Пролиферативный потенциал клеток от долгожителей 89
3аключение 100
Выводы 108
Список использованной литературы 111
- Ограниченность пролиферативного потенциала клеток
- Гетерогенность клеточной популяции
- Пролиферативный потенциал клеток разного тканевого происхождения
- Индивидуальная изменчивость лролиферативного потенциала диплоидных фибробластов человека
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Старение одно из основных свойств живых организмов. При всей спорности вопроса о сущности этого феномена ( является ли старение запрограммированным процессом или следствием накопления повреждающих факторов ), в конечном итоге оно проявляется определенными изменениями функциональных способностей, как отдельных клеток, так и организма в целом. При этом остаётся неясным, обусловлены ли возникающие в отдельных клетках и органах изменения старением самих клеток и органов или же они являются следствием общего процесса старения.
Изучение процесса старения на тканевом, клеточном и субклеточном уровне технически сложно и полученные данные трудно интерпретировать, тем не менее, эти исследования имеют большое значение, так как старение целого организма, повидимому, обусловлено изменениями, происходящими на низких уровнях организации. Поэтому изучение процесса старения клеток и возможного значения этого факта для старения целостного организма является актуальной проблемой современной геронтологии.
Исследованиями показано, что продолжительность жизни диплоидных клеток человека їй, уіЬго и 'v.v^ ;1ЇО не только ограничена [2, 39, 60, 88, 104, Ю6, 129, 138, 207] , но имеется определённая связь между потенциалом деления клеток в культуре и старением на клеточном уровне [105, inQ
В пользу аналогии этих процессов ік v\fcao и tw v\vro указыва' ют следующие данные: I. Положительная корреляция между продолжительностью жизни вида и потенциалом удвоения клеток [ПО, 151, 217] ; 2. Обратное соотношение между потенциалом удвоения клеток
і 4 **
и возрастом особи [36, 109, 149, 160, 226, 228]; 3. Снижение потенциала удвоения клеток у лиц с наследственными заболеваниями, главным фенотипическим проявлением которых являются признаки преждевременного старения [44, 59, 86, 89, 222, 227, 239, 240J ; 4. Идентичность потенциала удвоения и особенности роста клеток в парах монозиготных близнецов [2б] ; 5. Многие изменения, наблюдаемые цитологами и биохимиками при старении организма,обнаружены и в культурах клеток [lI2] .
Оценивая в сопоставительном плане позитивные и негативные стороны исследований клеточных штаммов в культуре для изучения старения клеток W v\.fen-o, можно считать, что клеточные культуры в дальнейшем послужат хорошим объектом для проведения множества интересных экспериментов.
Среди таких поисков следует выделить информацию, полученную в лонгитудинальном аспекте и от клеточных культур, полученных от индивидуумов разного возраста и особенно от долгожителей, .лиц, достигших предела максимальной продолжительности жизни человека.
В связи с вышеизложенным ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ ЯВЛЯЕТСЯ: I. Изучение пролиферативной способности (индекс меченьзх клеток, эффективность клонирования, продолжительность жизни) диплоидных фибробластов человека, выделенных из медицинских абортусов 8 -- 12 недель, из биопсии кожи доноров в возрасте 25 - 35 лет и долгожителей, людей максимально реализовавших видовую продолжительность жизни человека; 2. Исследование динамики изменения этой способности при длительном культивировании Ih. vuti.o ; з. Выяснение масштабов изменчивости этого показателя в зависимости от тканевого происхождения штамма и онтогенетической стадии донора; 4. Изучение масштаба индивидуальной, межштаммовой изменчивости
этого показателя ; 5. Установление стабильности изучаемых признаков в ряду клеточных поколений.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. В представленной работе впервые проведено исследование пролиферативного потенциала культивируемых фибробластов долгожителей и сравнение способности клеток к пролиферации у лиц молодого возраста и долгожителей в стандартных условиях. В работе использован наиболее информативный и точный показатель пролиферативного потенциала - эффективность клонирования и впервые показано, что эксперименты по клонированию клеток могут быть проведены с использованием отечественных кулыуральных сред при добавлении пуповинной сыворотки человека.
После того, как в 1961 г Хейфликом была установлена корреляция между продолжительностью жизни клеток в культуре и возрастом донора, культивируемые фибробласты стали одним из основных объектов в экспериментальной геронтологии. Однако, несмотря на большое количество публикации в данной области, многие результаты являются противоречивыми. Это связано, в частности , с небольшим количеством исследованных штаммов, в особенности клеточных штаммов, полученных от долгожителей, а также с тем, что не учитывается индивидуальная изменчивость по пролиферативному потенциалу клеток, которая в свете современных данных должна рассматриваться как генетически детерминированный признак и, следовательно, может варьировать в популяции, как любой другой наследственный признак. В связи с этим, можно сказать, что в данной работе впервые показано наличие довольно широкого размаха индивидуальной изменчивости изучаемых показателей, как среди штаммов эмбрионального происхождения, так и среди штаммов клеток, полу-
ченных от лиц молодого возраста и долгожителей.
Показано, что пролиферативный потенциал клеток долгожителей не отличается от пролиферативного потенциала фиОробластов от лиц молодого возраста.
Впервые охарактеризована первичная культура и ранние пассажи культивирования эмбриональных фибробластов и установлен факт отбора наиболее активно пролиферирующих клеток на ранних этапах культивирования.
Продемонстрирована гетерогенность популяции культивируемых клеток по пролиферативный, морфологическим и цитохимическим характеристикам и поназан клональный характер этой гетерогенности.
Высказано теоретическое предположение о том, что пролиферативный потенциал фибробластов человека находится в корреляции не с возрастом, а с генетической конституцией донора.
Практическое значение полученных данных состоит в том, что показатели пролиферативного потенциала вероятно, можно использовать, наряду с другими , для объективной характеристики биологического возраста.
Ограниченность пролиферативного потенциала клеток
Еще в 1881 г Вейссман предсказал, 4TD соматические клетки высших животных имеют ограниченный потенциал деления [l32] . В 1907 г Мечников предложил гипотезу, объясняющую старение организма истощением способности клеток к делению [іб] .
В 1912 г Эбелинг и Каррель опубликовали статью "О перманентной жизни тканей вне организма", в которой они сообщали, что фибробласты цыплёнка непрерывно размножаются в среде, содержащей экстракт клеток цыплёнка. Позже они сделали выводы, что продолжительность латентного периода, предшествующего миграции клеток из эксплантата связана с возрастом организма от которого взята ткань и что сыворотка старых доноров менее эффективно поддерживает рост ткани, чем сыворотка молодых доноров. В 1935 г Каррель писал, что фибробласты, выделенные в 1912 г из сердца цыплёнка живут и активно размножаются уже 23 г. Все это наводило на мысль, что клетки, освобождённые от физиологического контроля организма могут жить неопределенно долго и что их ограниченная продолжительность жизни зависит от факторов, присущих организму. Результаты этих работ не удалось воспроизвести. Мнение Керреля о бессмертности соматических клеток доминировало до 1957 г [iV].
В 1957 г Свим и Паркер показали, что фибробласты, полученные из различных тканей человека пролиферируют только в течение ограниченного времени, после чего погибают. Эти авторы, однако, не выяснили, сохраняют ли клетки в культуре свой нормальные свойства и не решились предположить, что их ограниченная способность к пролиферации связана со старением. Позже (1961 г ) аналогичные исследования были широко развернуты в лаборатории Нау- ticM . Hcuj-f&ok oo»cl JM#LU,U [IO53 установили, что культивируемые диплоидные клетки человека обладают ограниченной жизнеспособностью. Результаты Карреля по видимому, были вызваны внесением в среду вместе с экстрактом цыплёнка свежих клеток или как объясняет Хейфлик, трансформацией этих клеток, так как позже было установлено, что клетки в культуре иногда приобретают патологические черты, у них меняется число хромосом и такие клетки способны непрерывно делиться. Гипотеза Хейфлика подтвердилась во многих лабораториях на разных типах клеток и на фибробластах целого ряда животных.
Показано, что ограниченный потенциал деления имеют клетки печени, почки, мышцы, кератиноциты, клетки стромы костного мозга человека, Т-лимфоциты, эритроциты, эндотелиальные клетки аорты и т.д. [32, 43, 74, 128, 171, 181, 172, 241, 267] . Хейфлик сообщал, что легочные фибробласты эмбриона человека проходят в культуре 50 ± 10 удвоении и потом погибают. В настоящее время выделены штаммы, продолжительность жизни которых достигает 100 удвоении Гзі, 201] .
В культуре нормальных фи,бробластов всегда отмечаются три последовательные фазы развития. 1-я - первичная культура, состоящая из свежеизолированных клеток донора; 2 - растущая культура, состоящая изіфрлифериругощихклеток; 3 - культура в фазе инволюции, состоящая из "старых" клеток, которые больше не делятся или делятся редко.
Ограниченность жизни культуры может зависеть от разных причин. Одно из самых простых объяснений - неадекватность среды, например, дефицит каких-то необходимых метаболитов, присутствие токсических веществ, заражение вирусами или микоплазмой. Но все эти причины, по-видимому, маловероятны, так как Хейфлик передал образцы своих культур, замороженные на ранних пассажах во многие лаборатории и оказалось, что несмотря на различия в средах и условиях культивирования, они неизбежно деградировали [22 \ .
Дальнейшие данные в пользу того, что клетки имеют ограниченный потенциал деления были получены в опытах по смешиванию клеток, полученных из эмбиронов мужского пола и находившихся в фазе Ш и клеток, полученных из эмбриона женского пола и находив-—шихся в ранней фазе П. Если бы за дегенерацию клеток в фазе были ответственны латентные микроорганизмы и состав среды, можно было ожидать, что молодые клетки будут испытывать неблагоприятное влияние старых и погибнут раньше, чем в несмешанной контрольной культуре. Однако, смешанная культура вступила в фазу Ш одновременно с контрольной. Исследовав хромосомы клеток в смешанной культуре было показано, что "старые" мужские клетки исчезли быстрее, и к тому времени, когда культура вступила в фазу Ш в ней оставались только женские клетки I08j
В результате этих и других экспериментов Хейфлик пришел к выводу, что в культуральных условиях клетки способны пройти лишь ограниченное число удвоений и что это внутреннее свойство самих клеток, а не следствие неадекватных условий культивирования»
Хорошим доказательством того, что ограниченный пролифера-тивный потенциал свойство самих клеток, а не артефакт культивирования культуры - серийная трансплантация меченых клеток инб-редным животным. Результаты опытов, где ткань молочной железы [ 61, 124-3»кожу [l37 и незрелые клетки крови [98] серийно пересаживали крысам, показывают, что пересаженные клетки стареют и гибнут так же, как при культивировании i . vttao. В некоторых случаях календарное время, прошедшее до гибели этих клеток превышало максимальную продолжительность жизни данного вида. Это можно объяснить тем, что пересаженные клетки не растут так быстро, как в культуре, а большую часть времени находятся в состоянии покоя. Если они росли бы так же быстро, как в культуре, то трансплантат в течение нескольких месяцев достиг бы размеров , во много раз превышающих размер хозяина.
Гетерогенность клеточной популяции
Данные, полученные $ауіі\л.іклг. (34, 135, 153, 254] при изучении фибробластов крыс в первичной культуре и при использовании клонального анализа позволяют предположить, что клеточное старение диплоидных фибробластов - результат трехстадийной дифференцировки, во время которой происходит последовательное превращение фибробластов и фиброциты I, а позже в фиброциты П.
Используя фибробласты, полученные из костного мозга доноров разного возраста было показано существование в клеточной популяции 2 типов рбробластов. Фибробласты типа I являлись стволовыми клетками и могли образовывать очень большие колонии, при дифференцировке они превращались в клетки типа П, обладающие небольшим митотическим потенциалом (JE70, 17Ґ) .
Хейфлик считает, что процессы дифференцировки и старения тесно связаны,и можно рассматривать старение, как следствие физиологических изменений, вызванных дифференцировкой. Факт, что нормальные клетки, культивируемые in- vlbio или серийно трансплантированные Ъ и і/І 1го имеют ограниченный лролиферативный потенциал, претерпевают ряд изменений и в конце концов погибают. Рассмотрение этого процесса как "старения" или "дифференцировки к смерти" является семантическим вопросомрЦ] В ранних исследованиях Хейфлик хотел доказать, что все клетки имеют одинаковый потенциал удвоения ГіОбЗ . Он выделил 3 клона и показал, что продолжительность жизни штаммов, полученных из этих клонов не отличаются друг от друга. Но эксперимент Хейфлика не подтвердили дальнейшие исследования.
Массовая культура диплоидных фибробластов человека оказалась гетерогенной в отношении многих параметров. Существенная разница была обнаружена в морфологии клеток [269J . Кинематографическое исследование выявило вариабельность времени между делениями [25, 65, 186 . СялМо{а&о показал гетерогенность клеточной популяции по способности синтеза ДНК [5l] .
Изучение клонов показало [_703 , что отдельные клетки в массовой популяции сильно отличаются по потенциалу удвоения , но репликативный потенциал клонов не превышает потенциал удвоения массовой культуры. Колонии отличаются по размеру и строению. Распределение колонии по размеру носит бимодальный характер [249] . Была обнаружена гетерогенность клеточной популяции по содержанию некоторых ферментов, по реакции на стимуляцию синтеза ДНК и т.д. [126, 127, 196, 208] . Сравнивая 20ии 40 пассажи штамма W -38 Ліа-биши - Соев&о показал JJ54; 155] , что популяция становится исключительно гетерогенной по продолжительности периода митотического цикла по мере увеличения количества популяционных удвоений. Степень вариабельности ряда параметров в массовой культуре побудила надобность исследования отдельных клеток. Сперва на штаммах диплоидных фибробластов человека [248 J , а потом на штаммах эмбриональных куриных фибробластов было установлено, что количество клеток, способных образовывать колонии больше определенного размера ( 16 клеток для человека и 64 для куриных клеток {l30]y, хорошо коррелирует с числом оставшихся до гибели культуры удвоений клеточной популяции. ScWeiA«.x с соавт. показали, что 60% клеток, полученных от молодых доноров способны давать колонии состоящие из 256 и большего числа клеток, тогда как только 2% клехок старых доноров имеют такой потенциал деления [230 .
Клоны, выделенные из клеток одного индивидуума отличаются по регуляции метаболизма коллагена с помощью глюкокортикоидов 5 219] . Исследование отдельных клонов, выделенных из линии ВаИ С- ЗТЗ, показало широкую вариабельность по показателям насыщающей плотности, по способности метаболизировать бензпи-рен и по модальным числам кариотипа [24-5]
На фибробластах кожи и легких крыс В разного возраста с помощью клонального анализа, было показано различие в морфологии, митотическом потенциале, содержанию ДНК, РНК, белков и коллагена, репаративной активности, взаимодействия с вирусами культивируемых клеток [254-3
После обнаружения клональной гетерогенности по разным параметрам, встал вопрос о наследовании гетерогенности. субклонировали на разных пассажах штамм, полученный из одного клона легочных эмбриональных фибро-бластов человека и определили пролиферативный потенциал выделенных субклонов. Они установили большую вариабельность по данному параметру в субклонах. Была обнаружена [8Ї] фенотипическая гетерогенность внутри колонии эмбриональных клеток человека, выделенных из почек и амниотической жидкости. Биохимически было показано происхождение смешанных клонов, состоящих из эпителиоидных и фибробласто-подобных клеток, из одной клетки. Различие по размерам, по времени между делениями, по способности размножаться или выходить из цикла между сестринскими клетками показали BeW с сотр. [65J . Приведенные выще данные говорят о гетерогенности клеточной популяции и о наследовании этого свойства.
Пролиферативный потенциал клеток разного тканевого происхождения
Тем не менее, ряд авторов экспериментами по клонированию подтверждают, что доля неделящихся клеток равномерно увеличивается с возрастом культивируемых эмбриональных легочных фиброб-ластов Wi -38 [42, 1683 .
Анализ характера изменений эффективности клонирования 9 штаммов в зависимости от числа пассажей, пройденных культурой LVU vlbi-o » показал, что в пределах от 5 до 40 пассажей для эмбриональных штаммов и от 5 до 15-20 пассажей для постнаталь-ных штаммов характер изменения эффективности клонирования адекватно описывается уравнением линейной регрессии ( Р с 0,01 , L = 0,97 ) ( рис. 3.5 и рис. 3.6). Коэффициенты регрессии для эмбриональных штаммов были сходны ( ИМГ 841 = -1,74, ИМГ 842 = -1,84, ИМГ 843 = -1,79 , ИМГ 795 = -1,80, ИМГ 813= 1,82).
Для постнатальных штаммов коэффициенты регрессии были отличны от эмбриональных (ИМГ 853 « -2,86, ИМГ 746 = -2,40, ИМГ 868= = -2,52, ИМГ 881 = -2,80). Линии регрессии изменения эффективности клонирования эмбриональных штаммов являются практически параллельными. У постнатальных штаммов коэффициенты регрессии больше по сравнению с эмбриональными ( Р - 0,05 ), однако, между собой линии регрессии остаются параллельными.
Линейное падение количества клоногенных клеток по сравнению с индексом меченых клеток можно объяснить различными условиями постановки экспериментов по определению индекса меченых клеток и по определению эффективности клонирования. Вероятность вступления в цикл деления неодинакова для изолированных клеток и клеток, контактирующих с другими клетками. Кооперация между клетками, секреция метаболитов и влияние микроонружения могут увеличить количество коммитированных к делению клеток. Эксперименты по определению эффективности клонирования выявляют более "мощные" клетки, которые могут вступить в цикл находясь в изолированном состоянии и образовывать колонии, состоящие из 16 и большего числа клеток. Svnut-L с соавт. (2483 сравнивали линии регрессии эффективности клонирования эмбрионального штамма Wi-38 и постнаталь-ного штамма СРС-72 и показали, что они параллельны. Они указывают, что между эффективностью клонирования и количеством пассажей, которые штамм может пройти I - \п.&го , существует прямая корреляция. Однако, у нас создаётся впечатление, что подобное соответствие не абсолютно. О его правомерности можно говорить при сравнении штаммов в пределах одной группы. Так по нашим данным пост-натальный штамм ЙМГ-853 на пятом пассаже обладал 60% эффективностью клонирования, что было довольно близким к показателям эффективности клонирования эмбриональных штаммов на том же пассаже. Однако, уже на 25 пассаже эффективность клонирования штамма ЙМГ-853 составила всего 3% и он вступил в Ш фазу роста уже на 33 пассаже в отличие от эмбриональных штаммов, обладающих более 25% эффективностью клонирования на тех же пассажах и вступающих в Ш фазу роста лишь на 50-60 пассажах» Мы считали, что культура вступила в Ш фазу роста, если при пересеве 1:2 она не создавала сплошного монослоя в течение 4-недель культивирования при 3 сменах среды. Для эмбриональных штаммов это происходило на 50 - 60 пассажах, для постнатальных после 20 - 35 пассажей. В настоящее время нет общепринятых критериев гибели культуры. To psoru аю& HoW ufoj считают культуру репликативно мертвой, если клетки остаются одиночными или в виде небольших групп в течение 5-6 смен среды после пересадки и дальнейшего роста не происходит [2583 . Другие исследователи называли культуру мертвой, если число клеток не удваивалось за одну или три недели роста [62, 195 ,_ Несколько иначе сформулировали критерий гибели культуры McUteUvом S"uyx Q95J . Они считали штаммы мертвыми, если они не образовывали сплошного монослоя после 4-х недель еженедельной смены среды при пересеве 1:4. Существенной разницы между этими определениями нет. Во всех случаях клетки теряют способность к пролиферации, не размножаются и не образуют сплошного монослоя. Как было отмечено, число пассажей, которые исходная культура может пройти в наших условиях ivv VIAJ-LO , составило для эмбриональных штаммов 50 - 60 пассажей, а для постнатальных штаммов 20-35, причем для эмбриональных штаммов эти значения существенно не отличались от тех, которые были получены при использовании в качестве ростового компонента питательной среды эмбриональной телячей сыворотки, тогда как при тех же условиях в отношении постнатальных штаммов мы наблюдали значительное уменьшение этого показателя. Это может быть связано с использованием пуповинной сыворотки человека в качестве ростового компонента питательной среды. Так как было показано, что при культивировании диплоидных фибробластов человека, полученных от постнатальных доноров на среде с сывороткой крови человека культура клеток.
Индивидуальная изменчивость лролиферативного потенциала диплоидных фибробластов человека
По мере культивирования клеточных штаммов количество многоклеточных колоний уменьшается и на последних пассажах исчезает бимодальность распределения колоний по размеру. К концу "жизни" клетки способны создавать только малоклеточные колонии. Также уменьшается при старении содержание колоний I типа.
МлМ 1 Mizdonb jj[70j , изучая старение клеток стромы костного мозга W пАяо показали, что в данной культуре имеется два типа клеток - типичные фибробластоподобные клетки ( тип I ) и большие клетки, подобные эпителиальным ( тип П ) и что культура костного мозга в первой фазе состоит в основном из клеток I типа, а в Ш - почти исключительно из нлеток типа П. Они подтвердили это экспериментами по клонированию.
Детально проанализировав колонии фибробластов кожи и легких крыс, ftoAj-uvctW показал, что колонии состоят из 4- морфологически и биохимически различного типа клеток: фибробласты, фиброциты I, фиброциты П и трансформированные нлетки. Эти 4 типа клеток образуют 4- неидентичных, чистых типа колоний ( I, П, Ш и Т ) и два смешанных ( І/ІЇ и П/Ш ) [254] . Авторы допускают существование такого же типа клеток в клеточных популяциях человека и цыплёнка и считают, что старение фибробластов является процессом трехстадийной дифференцировки внутри третьей подгруппы стволовой системы фибробластов ( последовательности превращений ФБ - ФБ I -- ФБ П, контролируемой генетическими программами I, П, Ш ).
Результаты этих авторов подтверждают наши данные о клональ-ной гетерогенности клеточной популяции фибробластов человека. Цитохимический анализ танже выявил клональную гетерогенность. При окраски на щелочную фосфатазу было обнаружено, что в штаммах, полученных из кожи и мышечной ткани существуют три группы колоний: I - колонии, состоящие целиком из положительных по окраске клеток, П - колонии, состоящие из положительных и отрицательных по окраске клеток и Ш - колонии, не содержащие ни одной клетки, положительной по окраске на щелочную фосфатазу. В штаммах мышечного происхождения большинство колоний относились к первой или второй группе ( 90% ), в штаммах, полученных из кожи, частота встречаемости первой и второй групп . колоний не превышала 3%, а в легочных штаммах все колонии относились к Ш группе. В постнатальных штаммах встречались в основном отрицательные по окраске на щелочную фосфатазу колонии, только у двух штаммов были обнаружены колонии, относящиеся ко П группе по окраске на щелочную фосфатазу. Мы не обнаружили корреляции между размером клонов и их ок-рашиваемостью на щелочную фосфатазу. Положительно окрашивались как колонии с высоким пролиферативным потенциалом, так и колонии с низким пролиферативным потенциалом ( так же отрицательные и смешанные по окраске колонии ) . Ранее было показано, что при переходе клеток в Ш фазу роста, активность щелочной фосфатазы падает в культивируемых клетках человека. Существует также мнение, что большие, слаборазмножаю-щие клетки на ранних пассажах идентичны "старым" клеткам в Ш фазе роста. Если это так, то должна была выявиться корреляция между колониями с низким пролиферативным потенциалом и колониями, отрицательными по окраске на щелочную фосфатазу. Наши данные говорят в пользу того, что переход в Ш фазу роста не объясняется полностью неспособностью клетон вступать в митотический цикл. По всей вероятности, клетки, обладающие низким потенциалом на ранних пассажах,отличаются от слабораз- множающихся клеток Ш фазы роста. Сходные результаты были получены при изучении способности клеточных клонов связывать Конкана валин А [ЗОЗ После обнаружения клональной гетерогенности по пролифератив-ным, морфологическим и цитохимическим свойствам важно выяснить, наследуется ли эта гетерогенность или потомство одной клетки является гомогенной популяцией. Колонии диплоидных фибробластов человека за И - 18 дней достигают определенного размера и если оставить их в культуральной среде дольше, они уже не увеличиваются в размере иж вообще сползают со стекла, но это не значит, что они исчерпали свой проли-феративный потенциал. Мы добавляли в кулыуральную среду 3Н-тимидин на 17, 18, 19 день культивирования колоний и обнаружили, что наблюдается большая гетерогенность по включению 3Н тимидина в колонии. В колониях, состоящих с ЮО клеток, мы не находили ни одной меченой клетки (очень редко встречались по 1-2 меченые клетки во всей колонии).
Колонии большого и среднего размера (условное деление, большими считались колонии с хорошо оформленным рисунком, характерным для фибробластов, средними все остальные колонии, состоящие из 100 клеток и без характерного рисунка) сильно отличались по количеству клеток, включивших 3Н-тимидин. В колониях среднего размера можно выделить 3 условных типа колоний по включению 3Н-тимидина : I - колонии, клетки которых совсем не содержали меченый тимидин, П - колонии, в которых : 10% клеток включали 3Н-тими-дин и Ш - колонии, в которых 10% клеток включали 3Н-тимидин. П тип является преобладающим в средних колониях штаммов как эмбрионального, так и постнатального происхождения. Все большие колонии содержали меченые клетки, но отличались друг от друга по количеству клеток, включивших 3Н-тимидин.
