Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Мембранный потенциал. пассивный и активный транспорт ионов в растительных клетках 10
1.2. Энергообеспечение ионных насосов IS
1.2.1. АТФазы в шіазмалемме растительных клеток. Воз- 20 можность участия АТФ в электрогенезе
1.2.2. Окислительно-восстановительные компоненты плазматических мембран растительных клеток и их возможное участие в электрогенезе . 26
1.3. Светоиццуцированные изменения мембранного потен циала растительных клеток 30
1.3.1. Связь светоиндуцированных потенциалов с фотосинтезом 35
1.3.2. Гипотезы, объясняющие природу светоиндуцированных потенциалов растений 38
Глава 2. Объекты и методы исследований 41
2.1. Объекты исследований 41
2.2. Методы регистрации электшческих параметров 44
2.2.1. Микроэлектродное измерение мембранного потенциала 44
2.2.2. Внеклеточная регистрация светоиндуцированной биоэлектрической реакции 44
2.2.3. Регистрация электрического сопротивления полоски листа растения 46
2.3. РАстаош 46
2.4. Освещение 48
2.5. Измерение спектра действия и эффекта эмерсона дня мембранного потенциала ' 48
2.6. Регистрация фотосинтетического вьщеления кислорода 49
2.7. Методы исследования окислительно-восстановительных свойств ішазмалемш с применением рещокс-аген-тов нитро-ст и нади 50
2.7.1. Гистохимические методы определения НАДН^НАДЙ^-оксидоредуктазной и цитохромоксидазной активности плазмалеммы 51
2.7.2. Определение интенсивности окраски листьев и степени плазмолиза клеток при действии нитро-СТ и нади 52
2.7.3. Определение влияния нитро-СТ и нади на транспорт ионов и р0~ 53
2.8. Статистическая обработка результатов 54
Глава 3. Природа светоиндуцированной гиперпсжяризации плазмалеммы клеток пресноводных растений 56
3.1. Светоиндуцированные изменения мембранного потенциала элодеи и валлиснерии в сравнении с нитеялой 57
3.2. Связь светоибдуцированных изменений мембранного потенциала с фотосинтезом 61
3.3. Роль этц хлорошіастов, фотофосфорижрования и цикла кальвина в генерации светоибдуцированного мембранного потенциала 66
3.4. что происходит на цитопяазматической мембране (рабочая гипотеза) 74
3.5. Исследование локализации окислительно-восстанови тельных реакций в пдазмалемме 77
3.5.1. Гистохимические исследования с реактивами-индикаторами на окислительно-восстановительные реакции 7?
3.5.2. Зависимость окраски листьев реактивами нитро-СТ и нади от условий эксперимента 79
3.5.3. Действие нитро-СТ и нади на плазмолиз клеток... 82
3.5.4. Влияние нитро-СТ и нади на мембранный потенциал, транспорт ионов, фотосинтез и дыхание 85
Глава 4. Сравнительные исследования светоибдуцированных по тенциалов растении 98
4.1. Взаимосвязь медду светоиндуцированной внутриклеточной и внеклеточной биоэлектрической реакцией растений 99
4.2. Природа светоибдуцированной бюэлектшческом реакции растений при внеклеточном отведении 107
4.2.1. Локализация СЕР 107
4.2.2. СВР, как результат межклеточного электрохимического взаимодействия в растениях 116
4.3. Светоиндуцированные потенциалы разных видов растений 125
Заключение 133
Выводы 144
Литература 148
- АТФазы в шіазмалемме растительных клеток. Воз- 20 можность участия АТФ в электрогенезе
- Внеклеточная регистрация светоиндуцированной биоэлектрической реакции
- Связь светоибдуцированных изменений мембранного потенциала с фотосинтезом
- Природа светоибдуцированной бюэлектшческом реакции растений при внеклеточном отведении
Введение к работе
Первые исследования по электрофизиологии растений были проведены сравнительно давно, в конце прошлого столетия Хааком /120/ и Кляйном /139/. Но в отличие от электрофизиологии животных, электрофизиология растений развивалась более медленно. До 70-х годов нынешнего столетия электрическим потенциалам растительных объектов было посвящено немногим более 30 работ. Заметное развитие электрофизиология растений получила в последние годы. Увеличилось количество публикаций и резко изменилось содержание работ. Прежде большое внимание уделялось феноменологии электрических явлений в растении, описанию самого факта существования электрических потенциалов на мембранах растительных клеток, электрических градиентов между различными частями растения, описанию фактов изменения этих потенциалов в ответ на какие-то внешние воздействия. В последнее время основное внимание исследователей, работающих в области электрофизиологии растений, приковано к интимным механизмам электрогенеза, к природе тех процессов, которые протекают в мембранах растительных клеток и обусловливают существование и изменение разности электрических потенциалов на этих мембранах.
Большим шагом на пути к исследованию электрических явлений в растениях на мембранном уровне явилось использование микроэлектродного способа регистрации электрических потенциалов. Но ещё задолго до того, как удалось с помощью стеклянного капилляра, введенного в гигантскую клетку харовых водорослей,
измерить разность потенциалов между внутренним содержимым и окружающей средой /101,192/, был установлен факт изменения электрических потенциалов растений в ответ на световое воздействие /120,199 и др./. С конца прошлого столетия и до наших дней све-тоиндуцированная биоэлектрическая реакция растений является предметом внимания многих исследователей.
При изучении светоиндуцированных потенциалов растений можно выделить несколько аспектов.
Исследование феноменологии явления - установление факта существования биоэлектрической реакции у растений в ответ на световое воздействие. Изучение закономерностей этой реакции в различных экспериментальных условиях при изменении функционально значимых для растения параметров внешней и внутренней среды.
Исследование взаимосвязи светоиндуцированных потенциалов с основным метаболическим процессом зеленой растительной клетки - процессом фотосинтеза.
Выявление общих закономерностей и специфических особенностей светоиндуцированной биоэлектрической реакции разных видов растений.
Изучение природы светоиндуцированных потенциалов растений. Исследование физико-химических процессов, вызывающих свето-индуцированную электрическую поляризацию цитоплазматической мембраны.
Исследование значения светоиндуцированной электрической поляризации клеточной мембраны для функционирования этой мембраны и клетки в целом.
Анализ возможностей практического использования метода регистрации светоиндуцированных электрических потенциалов для определения функционального состояния растительных клеток.
Некоторые из перечисленных вопросов довольно подробно рас-
смотрены в литературе, другие представляют предмет исследования в настоящее время.
Цель этой работы заключалась в выяснении природы светоин-дуцированного электрогенеза, поиске тех процессов и реакций в клетке, которые являются ответственными за светоиндуцированные изменения мембранного потенциала плазмалеммы; определении каким образом, через какие реакции и продукты реакций осуществляется связь метаболических процессов в клетке с изменением электрического потенциала на плазмалемме; выяснении какие изменения происходят непосредственно на плазмалемме во время светоиндуци-рованной её гиперполяризации; как преобразуются изменения электрического потенциала на клеточной мембране во внеклеточную све-тоиндуцированную биоэлектрическую реакцию.
Большинство электрофизиологических исследований проведено на гигантских клетках харовых водорослей - харе, нителле и других. Менее изучены электрические параметры клеток высших растений. В то же время электрофизиологические исследования на высших растениях являются, вероятно, необходимым этапом при переходе от фундаментальных исследований к применению результатов этих исследований в практике растеневодства, поскольку большинство хозяйственно ценных культур относится к высшим растениям.
Хорошими модельными объектами среди высших растений являются, на наш взгляд, водные растения элодея и валлиснерия, имеющие довольно крупные клетки и более высокие по сравнению с харо-выми водорослями значения мембранного потенциала.
Использование результатов электрофизиологических исследований в прикладных целях требует также расширения круга лабораторных объектов. В связи с этим, а также с целью определения правомочности перенесения закономерностей светоиндуцированного электрогенеза, установленных на элодее и валлиснерии, на другие
виды растений проводились сравнительные исследования светоинду-цированных электрических потенциалов многих видов растений из различных систематических и экологических групп.
В работе рассматривается механизм генерации активной составляющей мембранного потенциала на свету, анализируется последовательность реакций между хлоропластами и плазмалеммой при освещении растительной клетки. Впервые установлены взаимоотношения между светоиндуцированными электрическими потенциалами, регистрируемыми внутриклеточным и внеклеточным способами. Установлены общие закономерности светоиндуцированного электрогенеза 24 видов растений. На основании проведенных исследований даются методические рекомендации применения метода внеклеточного отведения электрических потенциалов растений.
Работа имеет, в основном, теоретическое значение. Исходя из анализа полученных результатов предлагается альтернативная АТФазной концепции гипотеза участия окислительно-восстановительных реакций плазмалеммы в электрогенном транспорте Н*" из клетки» Исследование и понимание механизмов функционирования электрогенной Н^-помпы, играющей важную роль в регуляции внутриклеточного рН /163,181 и др./ и обеспечении растительной клетки необходимыми веществами /149,164,181 и др./, открывает пути управления процессами жизнедеятельности растений. Кроме того, изучение электрических свойств клеточных мембран растений, особенно тех параметров, которые зависят от процессов фотосинтеза, должно служить теоретической основой использования в сельскохозяйственной практике электрофизиологических экспресс-методов оценки состояния хозяйственно ценных культур.
АТФазы в шіазмалемме растительных клеток. Воз- 20 можность участия АТФ в электрогенезе
В животных клетках участие АТФ в ионном транспорте (функционирование На+ -К+-АТФазы) ни у кого не вызывает сомнения. Вероятно, поэтому наиболее распространенной является концепция об участии АТФ в активном транспорте через плазмалемму растительных клеток /152, 181 и др./.
Исходя из предположения об участии АТФ в активном транспорте предпринимаются попытки обнаружить в плазмалемме растительных клеток различные АТФазные системы, в том числе Na -К+-АТФазу /68, 69, 87 и др./. Сведения относительно ионстимулируемых АТФаз весьма противоречивы. Связано это, вероятно, с тем, что на растительных объектах пока еще не удается получить достаточно чистую фракцию, обогащенную плазматическими мембранами /69, 144/. При оптимальных условиях выделения получена фракция на 83% обогащенная везикулами плазмалеммы /47/. Обычно же степень обогащения фракции плазмалеммой составляет для растительных объектов 60-70% /23/. В микросомальной фракции содержатся наряду с плазмалеммой фрагменты эндоплазма-тического ретикулума и других мембран, обладающих АТФазной активностью. Кроме того, исследования механизмов активного транспорта ионов проводятся, в основном, на фотосинтезирующих водорослях и клетках высших растений, а выделение плазматических мембран и исследование АТФазы осуществляется, как правило, на корнях или запасающих тканях/68/.
Условия существования животных и растительных клеток значительно отличаются (табл.2). Животные клетки живут в среде с высоким содержанием натрия по сравнению с внутриклеточным содержанием этого элемента. Растительные клетки существуют, как правило, в среде, содержащей меньшие, по сравнению с цитоплазмой, концентрации основных ионов. Поэтому для растительной клетки стоит задача обеспечить поглощение ионов из среды в клетку против концентрационного градиента. Вполне возможно, что На -К+-АТФаза не является необходимым элементом электрогенной системы большинства растительных клеток. Исключение могут составлять галофиты и, вероятно, морские водоросли. Na+ К+-АТФаза у таких растений может выполнять функцию защиты цитоплазмы от избытка натрия /60, 70/. Не исключено, что такая система может существовать и в плазмалемме других видов растений, но ей, вероятно, в этом случае отводится второстепенная роль. Активный биосинтез їїа+ -К+ АТФазы может индуцироваться в определенных условиях питания при увеличении соотношения одновалентных катионов в пользу натрия /48,68/.
Поскольку анализ многочисленного экспериментального материала по электрогенеэу и транспорту ионов в растениях приводит многих авторов к заключению о существовании в плазмалемме системы активного транспорта Н+, наиболее перспективным считается направление по поиску и анализу работы Н+ АТФазы /17, 18, 34, 44, 184, 198/, хотя участие АТФ в активном транспорте нельзя еще считать полностью обоснованным.
Для выяснения участия АТФ в активном транспорте ионов через плазмалемму растительных клеток пользуются обычно косвенными методами, испытывая влияние разобщителей окислительного фосфо-рилирования и фотофосфорилирования, ингибиторов дыхания и фотосинтеза, ингибиторов АТФаз и т.д. на уровень мембранного потенциала и скорость поглощения ионов. Существует несколько экспериментальных приемов, с помощью которых можно добиться в фотосинтезирующих клетках функционирования только циклического транспорта электронов, когда единственным продуктом является АТФ. Достичь этого можно, освещая растение светом дальней красной области спектра, при наличии низких концентраций диу-рона и других приемов /150-152/. В таких условиях любой свето-индуцированный процесс, зависящий от АТФ, должен функционировать нормально. При использовании указанных приемов на нител-ле было показано, что поток хлора в клетку уменьшается, если работает только циклическое фотофосфорилирование /151/.
На харе и корнях ячменя также установлено, что транспорт хлора не зависит от АТФ /127, 167/. На клетках хлореллы показано, что уровень АТФ на свету не увеличивается и не изменяется существенно при действии ингибиторов, влияющих на поглощение фосфата /128/. У ричии стационарный уровень АТФ на свету и в темноте приблизительно одинаков - 300+9 нг АТФ/мг сух.веса /112/, в то время как свет вызывает значительную (до 220 мВ) гиперполяризацию плазмалеммы клеток этого растения /96/. На клетках харовых водорослей также показано, что снижение мембранного потенциала при выключении света или при увеличении концентрации COg в среде не сопровождается падением клеточного уровня АТФ, как это пред- полагалось, исходя из Н -АТФазной природы протонной помпы, активируемой светом /180, 181/.
При действии КЦХФ было показано, что МП клеток корня красной свеклы неоднознчно зависит от уровня АТФ в клетке /154/. При концентрации АТФ менее 50% по сравнению с контролем МП зависит от уровня АТФ, в интервале концентраций 50-100% МП не зависит от уровня АТФ. В противоречии с мнением об участии АТФ в работе электрогенных ионных транспортных систем находятся также и некоторые другие экспериментальные факты. Например, стимуляция поглощения К+ клетками хлореллы /191/ и увеличение МП нителлы /176/ при действии низких концентраций КЦХФ, а также первоначальное увеличение МП при действии высоких концентраций КЦХФ и других разобщителей - ДНФ и солей аммония /189/.
Внеклеточная регистрация светоиндуцированной биоэлектрической реакции
При внеклеточной регистрации потенциалов лист исследуемого растения помещался в плексиглассовую светонепроницаемую камеру (120 х 80 х 5 мм) с прозрачным окном для светового пучка и двумя отверстиями для электродов на противоположной световому окну стороне.
Освещение листа производилось локально над одним из электродов. Диаметр светового пучка составлял 20 мм. Отведение потенциалов от поверхности листа осуществлялось обычным способом контакта солевыми мостиками /64,103/. Регистрация потенциала освещаемой части листа велась относительно затемненной части листа. От хлорсеребряных макроэлектродов разность потенциалов подавалась на трехканальный электронный самопишущий потенциометр с высоко-омным входом /63/,
В некоторых экспериментах при регистрации СВР водных растений , исследовании локализации СВР, а также при проведении некоторых других специальных исследований использовалась камера с поперечными изолирующими вазелиновыми перегородками. Такая методика применялась ранее при исследовании электрических параметров харовых водорослей /25,138/. Плексиглассовая камера (70 х 16 х х 8 мм) разделялась поперечными вазелиновыми перегородками на четыре отсека. Ширина каждой перегородки составляла 2-3 мм. Полоску листа исследуемого растения или клетку нителлы помещали в камеру, заполненную раствором, и вмазывали в вазелиновые перегородки. Полоски из листьев наземных растений, шириной 4-5 мм и длиной 60-65 мм, вырезались параллельно продольной оси листа, не захватывая центральную жилку. Длина кусочка листа валлиснерии и клетки нителлы была такой же, как для наземных растений, ширина соответствовала естественной ширине листьев и клеток этих растений. При регистрации СВР элодеи рабочими были три или даже два отсека камеры из-за малой длины листьев элодеи. Камера снабжена светонепроницаемой шторкой, с помощью которой можно было смещать свето-темновую границу вдоль камеры. Разность потенциалов отводилась с помощью хлорсеребряных макроэлектродов от участков листа или клетки из каждого отсека камеры, относительно электрода, помещенного в крайнем, обычно четвертом, отсеке камеры.
В ряде экспериментов камера с изолирующими перегородками использовалась для параллельной регистрации СШ и СВР на одном и том же растении. При этом в клетки растения в первом отсеке камеры вводился микроэлектрод. Электродом сравнения для него служил хлорсеребряный макроэлектрод, находящийся в этом же отсеке. Регистрация потенциалов осуществлялась с помощью электронного многоканального потенциометра /63/; сигнал от микроэлектрода подавался предварительно на усилитель ЛПУ-01.
Схемы отведения потенциалов при использовании камеры с изолирующими перегородками приводятся в главе 4 при изложении фактического материала (рис.29,30,34). При исследовании локализации СБР в одной из серий экспериментов использовался модифицированный вариант этой методики. Описание и схема камеры приводятся также при изложении полученных результатов (рис.28).
Электрическое сопротивление полоски листа растения измерялось по постоянному току в описанной уже камере с изолирующими перегородками. Независимо от вида растения раствором заполнились только крайние (первый и четвертый) отсеки камеры. Участки полоски листа, расположенные в средних (второй и третий) отсеках находились в отмосфере влажного воздуха. Через дополнительную пару хлорсеребряных электродов в крайние отсеки от источника тока через большое ограничительное сопротивление (10-I08 ом) подавался постоянный ток (КГ -10"" а).. Сопротивление вычислялось по величине падения напряжения на определенной длине полоски листа.
В большинстве экспериментов в качестве омывающего растения раствора использовалась искусственная прудовая вода (ИПВ), следующего состава: 1.0 мМ хлористого натрия, ОД мМ хлористого калия и 0.1 мМ хлористого кальция. Все растворы физиологически активных веществ готовились на ИПВ. В опытах с морскими растениями омывающим раствором служила свежая морская вода. Растворы, применявшиеся при проведении гистохимических исследований, описаны в разделе 2.7.1.
В качестве омывающего раствора при проведении исследований по влиянию нитро-СТ и нади на транспорт ионов у элодеи использовался раствор хлористого калия (0.1-0.5 мМ). Ионы калия и хлора поглощаются клетками элодеи с большей скоростью, чем многие другие ионы /65/, поэтому при использовании раствора KCI легче наблюдать изменение транспорта. Растворы нитро-СТ и нади готовились на растворе KCI исходной концентрации.При исследовании локализации СВР по условиям эксперимента (для лучшего электролитического замыкания свето-темновой границы) требовались более высокие концентрации солей, чем в ИПВ, В этом случае использовался раствор хлористого калия (5 мМ) или водопроводная вода с суммарной концентрацией солей 5 мМ.
Связь светоибдуцированных изменений мембранного потенциала с фотосинтезом
Для многих видов растений показана связь СМП с процессами фотосинтеза. Не составляют исключения и выбранные нами объекты При непрерывной записи спектров действия СМП максимальные изменения потенциала обнаруживаются в фотосинтетически активной области спектра. На рисунке 6 приведены кривые спектров действия СМП элодеи (а) и нителлы (г) и спектров поглощения листа (б) и хлорофилла (в) элодеи. Как известно» у элодеи спектр действия фотосинтеза и спектр поглощения в общих чертах совпадают» поэтому характеристикой спектра действия фотосинтеза элодеи может служить спектр поглощения листа или хлорофилла. Как видно из рисунка 6, у элодеи наблюдается совпадение всех зарегистрированных спектров. Спектр действия СМП нителлы совпадает в основном со спектром действия СМП элодеи, хотя разрешается значительно слабее. Это может быть связано с большой вариабельностью ответов МП харовых водорослей на освещение /58,59,160 и др./.
В процессах фотосинтеза участвуют две фотосистемы,и для фотосинтеза характерен эффект неаддитивного усиления красным светом (эффект Эмерсона). Для СМП также наблюдается эффект, аналогичный эффекту Эмерсона для фотосинтеза. На рисунке 7 приведены результаты опыта, когда лист элодеи освещался последовательно двумя пучками света разной длины волны. При освещении элодеи светом с длиной волны 622 нм (С622) наблюдалась обычная реакция МП на включение света. Когда потенциал устанавливался на стационарном уровне, включалось дополнительное освещение, длина волны 725 нм (С725). Включение длинноволнового света вызывало дополнительное увеличение МП. Выключение С725 сопровождалось снижением МП до уровня, соответствующего С622. При полном выключении света или только при выключении С622 потенциал уменьшался до темнового уровня. Включение длинноволнового света (С725) после периода темноты не изменяло величины МП.
Эффект увеличения МП элодеи при дополнительном освещении длинноволновым светом наблюдался только в том случае, когда интенсивность С622 не была насыщающей для МП. На фоне насыщающей интенсивности С622 длинноволновый свет не оказывал действия. Никакие интенсивности одного С725 не вызывали изменения МП.
Зависимость МП исследованных водных растений от интенсивности света отличается от световой кривой фотосинтеза. Её можно охарактеризовать, как зависимость близкую к пороговой. При одних и тех же условиях эксперимента насыщающая интенсивность света для гиперполяризации плазмалеммы ниже, чем для фотосинтеза, регистрируемого по р02. У элодеи насыщающая интенсивность падающего света, измеренная в красной области спектра (KC-I3) при содержании COg в омывающем растворе 5»I0 М, что соответствует концентрации С02 в воздухе 0.03$ (рН 7.0), составляет для СМП и фотосинтеза соответственно 1-2 и 8-Ю тыс.эрг»см .сек . При увеличении концентрации С02 в растворе насыщающие интенсивности света для СМП и для фотосинтеза сдвигаются в область больших значений. Эти результаты говорят о том, что взаимосвязь СМП с фотосинтезом носит, по-видимому, сложный характер. Несмотря на это обнаруживается хорошее соответствие индукционных переходов СМП и р02 при включении и выключении света (рис.8). Условно для элодеи можно выделить шесть фаз изменений МП и р02 в ответ на включение и выключение света (рис.8,А). В первую фазу происходит быстрое выделение О? и уменьшение МП. Противоположная направленность изменений МП и р02 сохраняется во всех остальных фазах. Исключение составляет стационарное состояние (фаза 4), в котором и выделение 02 и достигнутый уровень МП могут удерживаться длительное время при неизменных условиях освещения. Соответствие фаз выделения 02 и СМП характерно также для валлионерии и нителлы (рис.8,Б,В). Фазы светоиндуцированных изменений МП всегда имеют ярко выраженный характер, в то время как из-за инерционности полярографического макрометода не всегда удается получить все фазы изменений р02, соответствующие фазам СМП. Когда речь идет об инерционности полярографического метода имеется ввиду не только инерционность платинового электрода и регистрирующих приборов, но и инерционность установления диффузионного равновесия по 02 для листа и даже отдельных клеток. Например, плохое разрешение индукционных фаз р02 для валлионерии по сравнению с элодеей объясняется, вероятно, демпфирующим действием аэренхимной системы.
Изменения МП и р02 в переходный период от темнового к световому и от светового к темновому стационарному состоянию отражают, по-видимому, сложные регуляторно-энергетические взаимоотношения между различными системами растительной клетки, такими, как хлоропласти, митохондрии и др. Установленное соответствие фаз индукционных переходов мембранного потенциала и р02 позволяет надеяться, что в дальнейшем, изучив природу СМП, взаимоотношения мембранного потенциала с различными стадиями фотосинтеза и другими процессами в клетке, можно будет использовать безинерцион-ный метод регистрации МП для экспресс-диагностики функционального состояния растительных клеток.
Используя известные экспериментальные приёмы модификации работы ЭТЦ хлоропластов, можно проанализировать необходима ли для светоиндуцированной гиперполяризации работа всей ЭТЦ или достаточно функционирования какого-то из её участков.
Ингибитор фотосинтетического транспорта электронов диурон по z -схеме действует между двумя фотосистемами, вторая фотохимическая система в таких условиях не функционирует /2,11/. При действии на клетки элодеи и валлиснерии диурона происходит полное ингибирование СМП (рис.9,а). Характер изменения СМП при действии диурона соответствует характеру изменений потенциала при выключении света. Включение и выключение света не оказывает заметного действия на МП, если в среде присутствует диурон. При этом происходит полное ингибирование светоиндударованного изменения р02 (рис.9,б). Действие диурона полностью обратимо. Восстановление исходного уровня СМП наблюдается не только при отмывании диурона раствором ИПВ, но и при введении в омывающий раствор, содержащий диурон, системы экзогенных доноров электронов для ЭТЦ хлоропластов.
Природа светоибдуцированной бюэлектшческом реакции растений при внеклеточном отведении
Уменьшение способности клеток плазмолизировать при действии нитро-СТ и нади может объясняться несколькими причинами. Кристаллы диформазанов и индофенолового синего, откладываясь в плазмалемме, могут образовывать функциональные "дыры", могут механически нарушать целостность этой мембраны. Возможно также, что нитро-СТ и нади действуют как "сшивающие" агенты, плаз-малемма в связи с этим становится жёсткой и ломается при действий гиперосмотической концентрации сахарозы, В некоторых экспериментах действительно наблюдались разрывы плазмалеммы при действии сахарозы на листья, обработанные предварительно нитро-СТ или нади.
Корреляция между интенсивностью окраски листьев и количеством плазмолизированных клеток в листе (рис.16) говорит о том, что при действии на растительную клетку нитро-СТ и нади изменяется состояние плазмалеммы. Однако эти результаты не являются ещё доказательством прямого действия окислительно-восстановительных реактивов на плазмалемму. Действие нитро-СТ и нади на плазмалемму может быть опосредовано влиянием этих веществ на энергопоставляющие внутриклеточные структуры, например на хлоропласти или митохондрии, поскольку известно, что в хлоропластах и митохондриях существуют окислительно-восстановительные ферментативные системы, взаимодействующие с нитро-СТ и нади. Поэтому представлялось весьма важным исследовать какие структуры (хлоропласти, митохондрии или плазмалемма) подвержены первоначальному изменению при действии на листья нитро-СТ и нади. Кроме того, локализация в плазмалемме окислительно-восстановительных реакций не является ещё доказательством причастности этих редокс-реакций к транспорту Н из клетки. Поэтому проводились исследования влияния нитро-СТ и нади на мембранный потенциал и транспорт ионов.
Нитро-СТ и нади вызывают снижение СМИ пресноводных растений (рис.17-20). Каждый из компонентов реактива нади (с -нафтол и диметил-п-фенилендиамин) не оказывает существенного влияния на мембранный потенциал. Эффект нитро-СТ и нади на мембранный потенциал необратим и увеличивается при увеличении концентрации (рис, 19) и времени действия этих веществ (рис.17, 20).
Для фотосинтезирующих растительных клеток характерно свето-индуцированное поглощение ионов, обусловленное градиентом электрохимического потенциала ионов водорода на плазмалемме /65/. Поэтому, как и ожидалось, наряду с уменьшением СМП нитро-СТ и нади подавляют также светоиндуцированный транспорт ионов в клетку. Во время действия этих веществ и в последующий период отмывания клетки теряют как катионы, так и анионы. Например, за 40 минут действия нитро-СТ и последующий 55-минутный период отмывания клетки элодеи потеряли 53,% калия, 32,8$ хлора, 24.8$ натрия по отношению к содержанию этих элементов в интактном растении (рис.21,А). На рисунке 21 (Б) приведены изменения суммарной концентрации ионов (I), определяемые при регистрации электропроводности омывающего раствора, и значения суммы потерь калия и Для выяснения первичного места действия нитро-СТ в клетке проводилась непрерывная регистрация кривых изменения р02, рН среды и нетто-транспорта ионов калия у элодеи. Мембранный потенциал регистрировался параллельно на листе, взятом с той же веточки и в тех же экспериментальных условиях, но в другой камере, р02 -суммарный показатель, однако, для фотосинтезирующих клеток на свету он отражает, в основном, интенсивность процессов фотосинтеза, в темноте р02 характеризует интенсивность дыхания.
Результаты проведенных экспериментов показали, что нитро-СТ в первую очередь уменьшает мембранный потенциал, и транспорт ионов и уже затем, судя по р02, изменяет фотосинтез и дыхание. Различия в скорости изменения указанных параметров особенно хорошо заметны при использовании малых концентраций нитро-СТ (до 0.1 мМ), Так, например, нитро-СТ (0.1 мМ) сразу после введения в камеру начинает снижать светоиндуцированный мембранный потенциал элодеи и светоиндуцированное поглощение калия. Амплитуда изменений р02 в ответ на включение и выключение света при этом не изменяется (рис.22). Мембранный потенциал уменьшается, потеря ионов калия клетками продолжается и после отмывания нитро-СТ. Изменения рН в этом случае незначительные, поэтому можно говорить, что выход катионов сопровождается эквивалентным выходом анионов. Суммарные потери калия и натрия вследствие действия нитро-СТ превышают потерю клетками ионов хлора (рис.21,А). Вероятно, кроме хлора растение теряет ещё какие-то неидентифи-цированные нами анионы. Фотосинтез и дыхание, судя по р02, начинают изменяться только через 2-3 часа после начала видимых изменений мембранного потенциала и транспорта ионов (рис.22).
