Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 12
2. Строение и функции нейтрофилов 15
3. Фагоцитоз и уничтожение фагоцитированных бактерий нейтрофилами
4. Гранулы и бактерицидные агенты нейтрофилов
5. Адгезионные рецепторы нейтрофилов и регуляция адгезии нейтрофилов к стенкам сосудов
6. Вытягивание мембранных цилиндров из тела нейтрофилов и их слущивание под действием потока.
7. Вытягивание мембранных цилиндров из тела нейтрофилов под действием локально приложенной силы
8. «Экстраклеточные уздечки» нейтрофилов 29
9. Микровезикулы и эктосомы, секретируемые нейтрофилами 31
10.Адгезионные взаимодействия клеток и внутриклеточный рН 33
11.Образование цитонем в эмбриональных клетках, клетках крови и других клетках эукариот
12.Роль метаболизма глюкозы и АТФаз вакуолярного типа в 39
процессах слияния/разделения клеточных мембран
13.Роль актинового цитоскелета в образовании цитонем в 44
нейтрофилах человека и в других клетках
14.Окись азота как физиологический регулятор образования цитонем в нейтрофилах
15.Синтез NO как точка приложения факторов, ответственных за тубуляцию/везикуляцию мембран
16.Паразитические простейшие индуцируют образование в нейтрофилах тубулярных филоподий, способных связывать паразитов 52
17.Цитонемы паразитических простейших 53
18.Перспективы дальнейшего изучения цитонем
19.Цитонемы бактерий 55
20.Мембранные тубовезикулярные структуры, создаваемые бактериями или паразитическими простейшими внутри клетки хозяина
21.Перспективы дальнейшего изучения цитонем
Материалы и методы 61
1. Материалы 61
2. Клетки 62
3. Бактерии 63
4. Адгезия нейтрофилов к субстрату 64
5. Количественная оценка числа прикрепившихся нейтрофилов 65
6. Определение рецепторов, вовлеченных в адгезию нейтрофилов 65
7. Измерение степени распластывания клеток 67
8. Оценка жизнеспособности нейтрофилов 66
9. Измерение внутриклеточного рН 66
10.Взаимодействие нейтрофилов с бактериями 67
11.Опсонизация зимозана и бактерий 68
12.Флуоресцентная микроскопия 68
13.Сканирующая электронная микроскопия 68
14.Трансмиссионная электронная микроскопия 69
15.Определение белкового состава цитонем 69
16.Концентрирование белков 70
17.Электрофорез белков в полиакриламидном геле 71
18. Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле 71
19.Подготовка образцов для масс-спектрометрии 71
20.Получение масс-спектров 72
21.Идентификация белков по «пептидному фингерпринту» 72
22.Хроматография высокого разрешения 72
23.Масс-спектрометрическое определение дефензинов 72
24.Определение бактерицидной активности продуктов, содержащихся в цитонемах
25.Статистическая обработка результатов 74
Результаты
1. Влияние окиси азота, супероксиданионрадикалов и 75 пероксинитрита на адгезию нейтрофилов человека к монослою клеток эндотелия человека
2. Изучение механизмов адгезии нейтрофилов человека к твердому субстрату, покрытому белками экстраклеточного матрикса
3. Влияние межклеточной адгезии нейтрофилов и фибробластов человека на величину внутриклеточного рН клеток
4. Выявление метаболических процессов, регулирующих внутриклеточный рН и образование цитонем при адгезии нейтрофилов к фибронектину
5. Выявление ионообменных процессов, контролирующих внутриклеточный рН и морфологию нейтрофилов при адгезии к фибронектину
6. Роль деполимеризации актинового цитоскелета в образовании мембранных тубуловезикулярных структур нейтрофилов
7. Роль NO в адгезионных взаимодействия нейтрофилов с клетками, дрожжами и бактериями
8. Изучение механизма связывания бактерий цитонемами нейтрофилов человека
9. Протеомный анализ состава цитонем 143
10. Доказательство мембранной природы тубулярных структур, 159 связывающих бактерии с клетками эукариот и с другими бактериями в биопленках
11. Обсуждение результатов 172
12. Выводы 180
13. Список цитируемой литературы 181
- «Экстраклеточные уздечки» нейтрофилов
- Адгезия нейтрофилов к субстрату
- Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле
- Протеомный анализ состава цитонем
Введение к работе
Актуальность проблемы. Нейтрофилы (полиморфно-ядерные лейкоциты, или нейтрофильные гранулоциты) составляют основную массу лейкоцитов крови и играют ключевую роль в защите организма от бактериальных инфекций. В процессе созревания нейтрофилов в костном мозге в клетках синтезируется целый ряд бактерицидных агентов, которые в зрелых нейтрофилах локализованы в гранулах (Faurschou, Borregaard, 2003; Rrvig, et al., 2013). Нейтрофилы обладают способностью мигрировать из кровеносного русла в очаг воспаления и там фагоцитировать (поглощать) и уничтожать бактерии бактерицидными агентами, попадающими в фагосому из гранул в результате так называемой секреторной дегрануляции. Важную роль в уничтожении патогенов играют также активированные формы кислорода, генерируемые комплексом НАДФН-оксидазы, собирающимся на мембранах активированных нейтрофилов (Segal, 2005; . В определенных условиях продуцируемые нейтрофилами агрессивные бактерицидные агенты и реактивныe формы кислорода попадают в окружающее нейтрофилы пространство, вызывая воспалительные реакции.
Изучение адгезионных взаимодействий нейтрофилов с бактериями может внести существенный вклад в разработку новых методов защиты от инфекций, направленных на повышение роли нейтрофилов в борьбе с бактериями. Понимание механизмов адгезии нейтрофилов к клеткам является актуальным для выработки мероприятий по предотвращению и лечению сосудистых патологий, в основе которых лежит аномальная адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов.
В норме нейтрофилы движутся вдоль сосудов, выстланных клетками
эндотелия, временно прикрепляясь к эндотелию при помощи рецепторов
семейства селектинов. В очаге воспаления под действием хемоаттрактантов
происходит слущивание селектинов и возрастает экспозиция рецепторов
семейства 2-интегринов на поверхности нейтрофилов (Moore, et al., 1995;
Kolaczkowska and . Это приводит к интегрин-зависимому
прикреплению нейтрофилов к стенкам сосудов и создает возможность
дальнейшей миграции в очаг инфекции. Интегрин-зависимая адгезия
нейтрофилов сопровождается секрецией агрессивных бактерицидных агентов и активированных форм кислорода, разрушающих эндотелий и вызывающих развитие воспаления.
Адгезия нейтрофилов к стенкам сосудов наблюдается и в отсутствие
инфекции. Воспалительные реакции в сосудах при восстановлении
кровообращения после временной остановки (при реперфузии после ишемии) также связывают с нарушением адгезионных взаимодействий нейтрофилов с клетками эндотелия (Schofield et al., 2013). Считается, что при реперфузии нейтрофилы привлекаются в миокард хемотактическими факторами, такими как фактор некроза опухолей-, интерлейкин-8, интерлейкин-6 и фактор активации тромбоцитов. Эти факторы стимулируют 2-интегрин-зависимую адгезию нейтрофилов, сопряженную с секрецией активированных форм кислорода и протеолитических энзимов, содержащихся в гранулах нейтрофилов, которые и вызывают воспалительный процесс.
При экспериментальном сахарном диабете у крыс, а также при исследовании аутопсийного материала больных сахарным диабетом, на гистологических срезах показано, что капилляры сетчатки глаза заполнены моноцитами и нейтрофилами (Schroder, et al., 1991; McLeod, et al., 1995). Установлено также, что в нейтрофилах, выделенных из крови больных сахарным диабетом, повышена экспрессия интегринов (Barouch, et al., 2000). Интегрин-зависимую адгезию нейтрофилов и связанную с ней секрецию агрессивных бактерицидных агентов нейтрофилами авторы многих современных исследований считают причиной развития ранних стадий ретинопатий (Hirata, et al., 2006; Mastej, Adamiec, 2008; Patel, 2009) и нефропатий (Takahashi, et al., 2000; Fardon, et al., 2002) у больных сахарным диабетом.
Однако вопросы о том, какие фундаментальные клеточные процессы контролируют адгезионные взаимодействия нейтрофилов с другими клетками, как метаболические дисфункции влияют на эти взаимодействия, и каким образом адгезионные взаимодействия нейтрофилов сопряжены с процессом секреции бактерицидных агентов, содержащихся в секреторных гранулах нейтрофилов, остаются открытыми.
В кровеносных сосудах давление кровотока и сеть медиаторов, среди которых
особое место занимает окись азота (NO) (Moncada, et al., 1991), препятствуют
интегрин-зависимой адгезии лейкоцитов. В сосудах NO продуцируется как
клетками эндотелия, так и нейтрофилами при помощи постоянно
экспонированных NO синтетаз (Sessa, 1994; Wallerath, et al., 1997). Механизм действия NO на адгезию нейтрофилов остается неизвестным, несмотря на то, что
во многих работах отмечается защитное действие NO на сосуды при ишемии после реперфузии (Roberts, et al., 2013), при сахарном диабете (Sharma, Khanna, 2013) и при сердечно-сосудистых заболеваниях (Tsutsui et al., 2009).
NO является также важным фактором защиты организма человека от
бактериальных инфекций. Известно, что в очагах инфекции происходит
триггерная стимуляция синтеза NO (Pasher, 2007). О важности роли NO в борьбе с
бактериями свидетельствует тот факт, что многие бактерии, включая бактерии
Salmonella, экспрессируют флавогемоглобин Hmp, фермент, метаболизирующий
NO (Stevanin , et al., 2002; Bang, et al., 2006). Бактерии мутантных линий,
утерявших этот фермент, теряют и вирулентность. Однако механизм
противомикробного действия NO не выяснен. Можно предположить, что и
противобактериальный эффект NO связан с влиянием этого природного агента на
механизмы адгезионных взаимодействий нейтрофилов с патогенными
бактериями.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение механизмов адгезионных взаимодействий нейтрофилов человека с клетками и бактериями, а также механизма влияния окиси азота (NO) на эти процессы.
Задачи исследования:
-
Изучить при помощи сканирующей электронной микроскопии морфологию нейтрофилов человека при адгезии к твердому субстрату в различных условиях, в том числе в присутствии NO.
-
Изучить влияние адгезионных взаимодействий нейтрофилов с субстратами и клетками на величину внутриклеточного рН нейтрофилов при помощи метода микрофлуориметрии. Определить ионообменные механизмы, ответственные за изменения внутриклеточного рН при адгезии нейтрофилов.
-
Провести комплексное исследование влияния ингибиторов метаболизма глюкозы и ингибиторов окислительного фосфорилирования на морфологию и внутриклеточный рН нейтрофилов при адгезии к твердому субстрату.
-
Определить при помощи препаративных биохимических методов и масс-спектрометрического анализа белковый состав секреции нейтрофилов, сопровождающей адгезию нейтрофилов к твердому субстрату в различных условиях.
-
Изучить при помощи электронномикроскопических методов механизмы адгезионных взаимодействий нейтрофилов с бактериями и влияние окиси азота на этот процесс.
-
Провести изучение влияния окиси азота (NO), супероксиданионрадикалов и их совместного действия на монослой клеток эндотелия человека и на адгезию нейтрофилов к монослою эндотелия.
-
Доказать при помощи сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии мембранную природу тубулярных структур бактерий Salmonella enterica serovar Typhimurium, которые соединяют бактерии между собой в биопленках и прикрепляют бактерии к нейтрофилам.
Научная новизна работы. Выявлен принципиально новый механизм
дистанционных адгезионных взаимодействий нейтрофилов человека.
Установлено, что нейтрофилы прикрепляются к клеткам и твердым субстратам при помощи нитевидных длинных (несколько клеточных диаметров в длину), гибких и тонких (150-250 нм в диаметре) мембранных тубуловезикулярных структур, или цитонем, прикрепляющих нейтрофилы к субстрату по селектин-зависимому механизму.
Впервые показано, что образование цитонем в нейтрофилах могут вызвать: (а) ингибиторы АТФаз вакуолярного типа (V-АТФаз); (б) ингибиторы метаболизма глюкозы; (в) ингибиторы хлорных каналов и среда с низким содержанием ионов Na+; (г) агенты, разрушающие актиновый цитоскелет, а также микробный алкалоид стауроспорин и алкилирующий агент 4-бромофенацилбромид.
Впервые проведен протеомный анализ состава цитонем с применением препаративных биохимических методов, хроматографии высокого разрешения и масс-спектрометрии. Цитонемы содержат белки, типичные для азурофильных и специфических секреторных гранул нейтрофилов, а также ряд цитозольных белков. Состав цитонем не зависит от агента, инициировавшего образование этих структур.
Методом сканирующей электронной микроскопии впервые
продемонстрировано, что цитонемы связывают на значительном удалении от клеточного тела нейтрофилов патогенные бактерии Salmonella Тyphimurium. Экстраклеточное связывание бактерий при помощи цитонем представляет собой принципиально новый, альтернативный фагоцитозу, механизм взаимодействия нейтрофилов с патогенами. Уничтожение бактерий при этом происходит при помощи бактерицидов, высвобождающихся из цитонем в результате лизиса этих структур. Цитонемы, длина которых может превышать диаметр нейтрофилов в несколько раз, многократно расширяют пространство, где нейтрофилы могут захватить и уничтожить бактерии.
Впервые обнаружено, что NO, природный регулятор адгезии лейкоцитов, индуцирует образование цитонем в нейтрофилах и регулирует образование этих тубуловезикулярных структур под действием других агентов. NO инициирует экстраклеточное связывание бактерий нейтрофилами, а подавление синтеза NO стимулирует фагоцитоз бактерий.
Показано, что окись не оказывает токсического действия на монослой клеток эндотелия человека ни сама по себе, ни при совместном действии с супероксиданионрадикалами. Окись азота снижает интегрин-зависимую адгезию нейтрофилов к эндотелию, стимулированную супероксидными радикалами.
Образование контактов между клетками при помощи мембранных трубочек является универсальным механизмом дистанционных взаимодействий эукариот и прокариот. Сочетанием методов сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии в работе впервые продемонстрировано, что длинные тубулярные структуры с диаметром 60-90 нм, которые соединяют бактерии Salmonella enterica serovar Typhimurium в биопленках и прикрепляют бактерии к нейтрофилам человека, представляют собой мембранные трубочки, формирующиеся из наружной мембраны грамотрицательных бактерий.
Научно-практическое значение работы. Настоящая работа представляет
собой комплексное научное исследование фундаментальных клеточных
процессов, вовлеченных в адгезионные взаимодействия нейтрофилов с клетками и бактериями и во многом определяющих механизмы этих взаимодействий. Полученные данные позволяют расширить существующие представления о способах взаимодействия между клетками, расположенными на значительном удалении друг от друга, о механизмах клеточной секреции и роли секреторных мембранных структур в установлении дистанционных контактов между клетками.
Полученные в работе результаты могут внести существенный вклад в разработку новых методов предотвращения и лечения бактериальных инфекций, основанных на повышении роли нейтрофилов в связывании и уничтожении бактериальных патогенов. Новая стратегия борьбы с инфекциями может быть направлена на стимуляцию образования цитонем и связывания патогенных бактерий цитонемами нейтрофилов при помощи NO или фармакологических агентов.
Другой фундаментальной медицинской проблемой, в решении которой могут быть использованы полученные в работе результаты, является профилактика и лечение сосудистых патологий, в основе которых лежат
нарушения в адгезии нейтрофилов к стенкам сосудов. Новым направлением в решении этих задач могут быть поиски агентов, способных регулировать адгезию нейтрофилов к эндотелию, воздействуя на выявленные в работе метаболические и ионообменные процессы, определяющие механизмы адгезии нейтрофилов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Нейтрофилы устанавливают адгезионные взаимодействия с клетками,
бактериями и субстратами на дистанции при помощи длинных, тонких (150 - 250
нм в диаметре) и гибких мембранных тубуловезкулярных структур (цитонем).
2. На метаболическом уровне образование цитонем на поверхности
нейтрофилов определяется гликолитическим метаболизмом глюкозы,
активностью АТФаз вакуолярного типа, состоянием актинового цитоскелета, и
Na+- и Cl—зависимыми ионообменными процессами
-
Цитонемы представляют собой секреторные структуры нейтрофилов, состоящие из мембранных везикул и трубочек, содержащих внутри бактерицидные агенты и цитоплазматические белки нейтрофилов.
-
Связывание бактерий цитонемами на значительном удалении от клетки представляет собой новый, альтернативный фагоцитозу, механизм связывания и уничтожения бактерий нейтрофилами.
-
Окись азота является физиологическим фактором, способным индуцировать формирование цитонем на поверхности нейтрофилов и стимулировать дистанционные адгезионные взаимодействия нейтрофилов с клетками и бактериями при помощи цитонем.
-
Клетки грамотрицательных бактерий осуществляют дистанционные взаимодействия с другими бактериями, клетками эукариот и субстратами при помощи длинных и тонких (60 – 90 нм в диаметре) мембранных тубуловезикулярных структур. Эти структуры формируются из наружной мембраны бактерий и обладают теми же свойствами, что и цитонемы нейтрофилов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на
конференциях: IV International conference on Enviromental, Inductrial and Applied Microbiology, Torremolinos, Spain, 2011; Current Opinion Conference “Cellular Host-Pathogen interactions” Amsterdam, Netherlands, 2010; IV крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии", Судак, Украина, 2008; 47-, 45-, 44- and 43-rd annual meeting of the American Society for Cell biology 2007, 2005, 2004, 2003; Международная конференции "Рецепция и внутриклеточная
сигнализация", Пущино, 2003; 55th Harden conference "Dynamics of membrane traffic". Ambleside, Lake District, UK, 2002. Диссертационная работа была апробирована на заседании Ученого совета НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского 20 мая 2013 года.
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах. Из них 18 статей опубликованы в журналах, представленных в «Pubmed», и 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Еще 2 работы опубликованы в виде отдельных глав в книгах издательств «Nova Science Publishers, Inc» и «Landes Bioscience/Springer».
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». В работе представлены 43 рисунка и 11 таблиц. Список цитируемой литературы включает 287 источников.
«Экстраклеточные уздечки» нейтрофилов
Бактериостатическое действие нейтрофилов не сводится к фагоцитозу бактерий и их уничтожению внутри фагосомы. Нейтрофилы способны взаимодействовать с бактериальными или грибковыми патогенами, удаленными на значительное расстояние от тела нейтрофилов. Одним из предполагаемых способов связывания и уничтожения патогенов вне клетки является образование так называемых экстраклеточных уздечек (neutrophil extracellular traps, NETs) (Brinkmann et al., 2004; Fuchs et al., 2007). Согласно авторам, образование NETs происходит в результате гибели нейтрофилов, высвобождения хроматина из ядра разрушенных клеток и высвобождения бактерицидов из гранул нейтрофилов. «Экстраклеточные уздечки» описаны как 15 нм в диаметре тяжи, состоящие из ДНК, гистонов и адсорбированных на них гранулярных белков нейтрофилов, преимущественно эластазы и миелопероксидазы. Эти структуры не покрыты мембраной и способны убивать бактерии. «Экстраклеточные уздечки» Жихлинского формируются на дне чашек Петри без белкового покрытия из белков и ДНК, высвобождающихся из погибших в результате многочасовой (4-6 часов) инкубации нейтрофилов с форболовым эфиром (РМА). Антимикробный эффект «экстраклеточных уздечек», по мнению авторов, критически зависит от целостности структуры ДНК, так как воздействие ДНКазы приводило к потере бактерицидного потенциала «уздечек».
Вопросы о том, происходит ли образование «экстраклеточных уздечек» в живых тканях и насколько эффективны такие структуры в защите организма от бактериальных инфекций остаются открытыми (Nauseef, 2012). В чрезвычайно многочисленных работах, посвященных изучению NETs, демонстрация образования этих структур в живых тканях производится при помощи флуоресцентной или конфокальной микроскопии. Эти методы не позволяют наблюдать структуры размером 15 нм, изучение которых требует применения электронной микроскопии.
Разрушение нейтрофилов в живых тканях и высвобождение крайне агрессивных бактерицидных агентов может вызвать воспалительный процесс в окружающих тканях, вред от которого будет несопоставим с вкладом хроматиновых «уздечек» в уничтожение бактерий. Естественным путем устранения состарившихся нейтрофилов или нейтрофилов, фагоцитировавших бактерии или другие патогены, является поглощение этих клеток макрофагами, которые фагоцитируют и переваривают их. Микровезикулы и эктосомы, секретируемые нейтрофилами Живые нейтрофилы, как и многие другие клетки, могут взаимодействовать с удаленными клетками и микроорганизмами, секретируя свои продукты во внеклеточное пространство. Функции нейтрофилов в организме не ограничивается борьбой с бактериальными или грибковыми инфекциями. Нейтрофилы вовлечены в инициацию и организацию адаптивного иммунного ответа, благодаря секреции различных цитокинов (TNF, IL-1, IL-8, TGF-1), взаимодействующих со всеми основными типами иммунных клеток и с клетками эндотелия (Cassatella, 1995; Mantovani et al., 2011). Долгое время предполагалось, что при экзоцитозе происходит слияние мембраны внутриклеточных гранул с плазматической мембраной и секретируемые вещества попадают во внеклеточное пространство в виде индивидуальных молекул. Однако в многочисленных современных работах показано, что нейтрофилы, как и многие другие клетки, секретируют свои продукты в виде слущивающихся с поверхности клеток мембранных везикул (Cocucci et al., 2009; Dalli et al., 2013; Gasser et al., 2003; Hess et al., 1999; Sadallah et al., 2011a; Stein and Luzio, 1991; Timar et al., 2013a). Клетки многих типов продуцируют микровезикулы как спонтанно, так и в ответ на активацию. Микровезикулы обнаружены в жидкостях тела, таких как кровь, моча, цереброспинальная жидкость или молоко. Размеры микровезикул варьируют в диапазоне от 30 нм до 1 м. Изучение микровезикул осуществляется, в основном, при помощи методов проточной флуориметрии и светорассеяния, которые имеют ограничения. Везикулы, имеющие размеры меньше 100 нм, не регистрируются проточными флуориметрами. Наиболее успешно производится детекция окрашенных флуоресцентными лигандами везикул, диаметр которых превышает 300 нм. Способность липидных везикул к набуханию, слиянию и разделению, а также присутствие сходных по размеру белковых агрегатов сильно осложняет изучение этих липидных структур. Секретируемые нейтрофилами мембранные везикулы различаются по размеру, составу и предназначению. В одной из первых работ, выполненных на выделенных из крови нейтрофилах, было показано, что активация нейтрофилов при помощи fMLP, PMA или иономицина индуцирует слущивание эктосом, содержащих рецепторы CR1, локализованные совместно с бактерицидными агентами первичных гранул нейтрофилов. Такие эктосомы эффективно связывались через СR1 с опсонизированными бактериями и уничтожали связанные бактерии при помощи эластазы и миелопероксидазы (Hess et al., 1999). Размеры эктосом авторы при помощи электронной микроскопии оценили как 70 – 300 нм. В современных работах показано, что опсонизированные бактерии или частицы зимозана (частицы высушенных дрожжей) инициируют слущивание микровезикул значительно более эффективно, чем fMLP или цитокины (Timar et al., 2013a). Эктосомы, образование которых было инициировано опсонизированными частицами, были способны подавлять рост бактерий, в то время как эктосомы, инициированные под воздействием других факторов, не влияли на рост бактерий. Опсонизация частиц сывороткой крови была критичной в этом процессе: тепловая инактивация сыворотки приводила к утере бактерицидной активности эктосом. Механизм действия Среди слущиваемых нейтрофилами везикул (микровезикул, эктосом) различают везикулы, которые взаимодействуют с клетками иммунной системы и модулируют активность таких клеток, как моноциты и дендритные клетки, образованные из моноцитов (Dalli et al., 2013; Gasser et al., 2003; Sadallah et al., 2011a). Эктосомы нейтрофилов, образование которых было стимулировано бактериями Mycobacterium tuberculosis, снижали активацию макофагов и способствовали выживаемости бактерий (Duarte et al., 2012). Все эти эксперименты проводились in vitro, с использованием выделенных из крови и культивируемых клеток. На вопрос о том, продуцируются ли микровезикулы нейтрофилами in vivo можно дать положительный ответ. Продуцированные нейтрофилами микровезикулы были обнаружены в сыворотке крови здоровых доноров. Более того, число таких везикул было многократно повышено в сыворотке крови пациентов с активной формой инфекции, вызванной S aureus (Timar et al., 2013a) Сходные результаты описаны для больных менингококковым сепсисом (Nieuwland et al., 2000), а также для больных перитонитом (Prakash et al., 2012).
Адгезия нейтрофилов к субстрату
Адгезия нейтрофилов к субстрату. Для проведения экспериментов по адгезии нейтрофилов к субстрату, покрытому фибронектином, покровные стекла или поверхность лунок в планшетах покрывали фибронектином, инкубируя их в буфере, содержащем 5 г/мл фибронектина в течение 2 часов при комнатной температуре, и промывали. Нейтрофилам (106 клеток/мл) давали прикрепиться к поверхности субстрата в течение 20 мин при 370С в растворе Хенкса, содержащего 10 мМ HEPES при рН 7,35. Все испытуемые вещества растворяли в растворе Хенкса, спирте или ДМСО перед экспериментом. Соответствующие количества спирта или ДМСО (не более 5мл/мл) добавляли к контрольным клеткам. Прикрепившиеся клетки либо фиксировали для электронной микроскопии, либо исследовали при помощи фазового контраста на микроскопе Opton III (Германия). Количественная оценка количества прикрепившихся нейтрофилов. Оценка количества нейтрофилов, прикрепившихся к эндотелию или к покрытому фибронектином субстрату, производилась по измерению миелопероксидазной активности прикрепившихся нейтрофилов. Нейтрофилы (5х106 клеток на лунку) добавляли в лунки 24-луночных планшетов, на дне которых был выращен монослой клеток эндотелия или у которых дно было покрыто фибронектином. Клетки инкубировали 30 мин при 370С. После отмывания неприкрепившихся клеток, добавляли детергент (0,1 % Triton X100) и субстрат миелопероксидазы (5,5 мМ орто-фенилендиамин и 4 мМ Н2О2). Через 4 мин реакция останавливалась добавлением равного объема 1 М H2SO4. Стандартные разведения клеток были использованы для калибровки. Затем измеряли оптическую плотность содержимого лунок на длине волны 492 нм и, в соответствии с калибровкой, определяли, какой процент от общего числа добавленных нейтрофилов составляют прикрепившиеся клетки.
Для определения рецепторов, вовлеченных в адгезию нейтрофилов, изучали влияние моноклональных антител к различным классам адгезионных рецепторов на адгезию нейтрофилов. Fc рецепторы блокировали инкубацией нейтрофилов с 5% сывороткой крови человека, инактивированной нагреванием. Затем нейтрофилы (107 клеток/мл в буфере с добавлением 0,2% инактивированного нагреванием человеческого сывороточного альбумина) инкубировали с антителами к адгезионным рецепторам нейтрофилов различных типов (20 г/мл) в течение 30 мин при комнатной температуре и добавляли в соответствующей концентрации в лунки, покрытые фибронектином или клетками эндотелия. После этого по стандартной процедуре определяли количество прикрепившихся нейтрофилов.
Степень распластывания клеток оценивали по площади, занимаемой прикрепившейся клеткой на субстрате. Площадь, занимаемую клеткой, определяли на фазово-контрастном изображении клетки при помощи программы ImageJ (Abramoff et al., 1996). Оценку жизнеспособности нейтрофилов проводили по окрашиванию нейтрофилов трипановым синим в результате инкубации клеток с 0,5 мМ красителя в растворе Хенкса в течение 15 мин. После промывания, подсчитывали процент окрашенных (мертвых) клеток по отношению к общему числу клеток. В других экспериментах оценивали жизнеспособность нейтрофилов по сохранности клеточного ядра. Клетки фиксировали в 4% растворе формальдегида при рН 7,4. После промывания клетки выдерживали в 0,1% растворе детергента Triton X-100 5 мин, снова промывали и инкубировали с 50 г/мл флуоресцентного красителя Hoechst, связывающегося с ДНК клетки, в течение 30 мин. Затем сохранность ядер анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа. Измерение внутриклеточного рН методом микрофлуориметрии Измерения внутриклеточного рН в индивидуальных клетках производили методом микрофлуориметрии с помощью микроскопа Opton III, оборудованного микрофлуориметрической приставкой ФМЕЛ-2 (ЛОМО). Нейтрофилы и фибробласты нагружали флуоресцентным рН-зависимым индикатором BCECF-AM (2,7-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester) путем 20 мин инкубации клеток с 5 М красителя при 370С. Это липофильное эфирное производное красителя легко проникает в клетки, где эфирная связь гидролизуется внутриклеточными эстеразами с высвобождением BCECF свободной кислоты, которая удерживается в клетках (Rink et al., 1982). Измерение интенсивности флуоресценции клеток на длине волны 520 нм производили при двух длинах волн возбуждения - 430нм (где интенсивность флуоресценции зависит от количества красителя в клетке и не зависит от РН) и 490 нм (где интенсивность флуоресценции зависит от рН). По соотношению интенсивностей флуоресценции при этих длинах волн возбуждающего света вычисляли рН цитоплазмы. Калибровку проводили при помощи ионофора нигерицина, способного выравнивать внутриклеточный и наружный рН в среде с высоким содержание калия (Paradiso et al., 1984). Состав калибровочной среды: 150 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 10 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES. Нигерицин использовали в концентрации 30 М.
Взаимодействие нейтрофилов с бактериями. Механизмы взаимодействия нейтрофилов с бактериями изучали при помощи сканирующей электронной микроскопии. Нейтрофилам давали прикрепиться к субстрату, покрытому фибронектином, в течение 20 мин и, затем, добавляли бактерии в соотношении 20:1 или 10:1 (бактерии: клетки). После 5 мин инкубации при 37 0С препарат фиксировали для сканирующей электронной микроскопии. В некоторых экспериментах бактерии добавляли к клетками перед прикреплением к фибронектину. В экспериментах использовали как опсонизированные сывороткой, так и неопсонизированные бактерии.
Опсонизацию зимозана и бактерий производили при помощи сыворотки того же донора, из крови которого выделяли нейтрофилы. У донора отбирали отдельный образец крови без антикоагулянта. Кровь сворачивалась и сыворотку от сгустка отделяли центрифугированием (800 g, 30 мин). Навеску частиц зимозана А из Saccharomyces cerevisiae суспендировали в буферном растворе PBS, кипятили на водяной бане в течение 5 минут и охлаждали до комнатной температуры. Затем полученную суспензию центрифугировали (800g, 10 мин) и промывали в PBS. Полученную суспензию частиц зимозана инкубировали с 25% сывороткой в течение 30 мин при 37 0C, затем промывали 3 раза в PBS и ресуспендировали в среде HBSS, содержащей 10 мМ Hepes (HBSS/Hepes). Опсонизацию бактерий проводили 10 мин инкубацией бактерий (4х108/мл) с 10% раствором сыворотки в Dulbecco-PBS. После чего бактерии промывали трехкратным ресуспендированием и осаждением в Dulbecco-PBS. Флуоресцентная микроскопия. Тонкие мембранные структуры разрушаются при фиксации клеток параформальдегидом. Поэтому флуоресцентное окрашивание клеточных структур липидными и цитозольными красителями мы наблюдали в живых клетках. Клетки либо инкубировали с красителями перед экспериментом, как например с рН-зависимым цитозольным красителем BCECF-AM, либо добавляли флуоресцентные красители на несколько минут в конце эксперимента, как, например, липидные флуоресцентные зонды BODIPY сфингомиелин или BODIPY-сульфатид. После проведения экспериментальных процедур клетки немедленно фотографировали.
Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле
Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) в 15% геле на аппарате MiniPROTEAN 3 Cell (Bio-Rad). Равные аликвоты препаратов кипятили 3 мин в лизирующем буфере (30 mM Tris-HCl, рН 6.8, 1 % SDS, З М мочевины, 10 % глицерина, 0.02 % бромфенолового синего) и наносили на гель. Гели окрашивали 0.22 % Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva).
Триптический гидролиз белка проводили в полиакриламидном геле. Для удаления красителя кусочек геля размером около 2мм3 дважды промывали в 100 мкл 40% раствора ацетонитрила в 0.1 М NH4HC03 в течение 30 мин при 37С. После удаления растворителя, добавляли к образцам по 100 мкл ацетонитрила для дегидратации геля. Удалив ацетонитрил и высушив кусочек геля, прибавляли к нему 4 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega) в 0.05 М NH4HC03 с концентрацией 12 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 6 ч при 37С, затем к раствору добавляли 6 мкл 0.5 % ТФУ в 10% растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Надгелевый раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров.
Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на мишени смешивали по 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, 20 мг/мл в 20% ацетонитриле в воде с 0.5 % ТФУ), и полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.005 %.
Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводился в базе данных NCBI среди белков млекопитающих с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом. Если параметр достоверности (score) 71, то совпадение с отысканным кандидатом считается неслучайным (p 0.05). Хроматография высокого разрешения. Хроматографическое разделение белков проводили на приборе Милихром А-02 (ECONOVA, Новосибирск, Россия) на аналитических колонках (75 x 2 mm), наполненных 5 м частицами Nucleosil C4, с размерами пор 300 A (Macherey-Nagel, Duren, Германия). Раделение проводили при 350 C с использованием двухволнового детектора (214 нм and 280 нм). Элюирующие растворы были: A (0.1% трифторуксусной кислоты в воде, pH 2.2) and B (ацетонитрил с 0.1% трифторуксусной кислотой). Линейный градиент был таким: 0–60% B в течение 35 мин и затем 60– 100% B в течение 5 мин; скорость потока 80 л/мин. Белковые фракции были отобраны для последующего масс-спектрометрического анализа.
Масс-спектрометрическое определение дефензинов. Для идентификации дефензинов Д 10 л фракции, полученной при хроматографическом разделении, были высушены на приборе SpeedVac и 10 л 10 mM раствора дитиотреитола в 200 mM NaHCO3 при рН 8,5 были добавлены на 30 мин при 370 C. Затем 1 л /5 л O.3 M раствора N-этилмалеимида (NEM) был добавлен на один час при 370 C. Окончательный раствор был обессолен при помощи C18 ziptip P10 (Millipore), белки были экстрагированы при помощи 60% ацетонитрила с 0.5% трифторуксусной кислоты и проанализированы при помощи масс-спектрометрии.
Бактерицидную активность продуктов, содержащихся в цитонемах, определяли по способности EM2, экстраклеточной среды, обогащенной продуктуми разрушения цитонем и слущенными цитонемами (см. «Определение белкового состава цитонем») подавлять рост бактерий и образовывать колонии на чашках Петри с Луриа-Бертани-агаром. Бактерии Salmonella Typhimurium штамма IE147 (4х103) инкубировали 30 мин при 37 0С в 1 мл раствора Хенкса-HEPES, содержащего исследуемые продукты секреции. Затем к суспензии добавляли 1 мл Луриа-Бертани бульона для стимуляции роста бактерий и суспензию помещали в термостат на 37 0С. Аликвоты бактериальной суспензии отбирали через 1, 2 и 3 часа и помещали на чашки с агаром. Подсчет выросших колоний (CFU – colony forming units) производили через 15 часов.
Протеомный анализ состава цитонем
Для доказательства секреторной природы мембранных тубуловезикулярных структур мы провели протеомный анализ содержимого цитонем в нейтрофилах, прикрепившихся к фибронектину в присутствии агентов, способных индуцировать появление цитонем – донора NO диэтиламин NONOата, BPB или цитохалазина Д (Рис. 26). После 20 мин инкубации (в процессе которой формировались цитонемы) экстраклеточная среда (EM1), содержащая агенты, индуцирующие образование цитонем, была замещена на контрольный буфер. В результате такого замещения цитонемы слущивались в поверхности клеток, набухали и разрушались. После последующей 15 мин инкубации отбирали среду (EM2), обогащенную слущенными цитонемами и продуктами их разрушения. Затем ЕМ1 и ЕМ2 были проанализированы. Белки были сконцентрированы при помощи одной из двух процедур: либо при помощи Microcon центрифужных фильтров при центрифугировании при 11000 g (Beckman Coulter Microfuge), либо при помощи экстракции смесью Фолча (хлороформ : метанол в соотношении В последнем случае практически все белки попадали в хлороформенную фракцию, в то время как воднометанольная фракция содержала лишь следовые количества белков. Затем белки были разделены при помощи электрофореза в 15 % полиакриламидном геле в присутствии SDS в невосстановленных условиях (Рис. 27) или при помощи хроматографии высокого разрешения (Рис. 28). Полоски геля, соответствующие индивидуальным белкам, были вырезаны. Подвергнуты трипсиновому гидролизу в геле и идентифицированы при помощи масс-спектрометрии (Galkina et al., 2012). При адгезии к фибронектину контрольные нейтрофилы секретировали множество белков, если судить по окрашиванию гелей электрофореза серебром. Для выявления основных секретируемых белков мы применили менее чувствительное окрашивание гелей красителем Coomassie Brilliant Blue. Это позволило нам идентифицировать основные секретируемые белки и установить белковые профили секреции нейтрофилов, характерные для различных условий. Белковые профили секреции устанавливали по результатам трех аналогичных экспериментов. В белковый профиль вошли белки, выявленные в двух, по крайней мере, экспериментах.
В течение первых 20 мин адгезии к фибронектину контрольные нейтрофилы секретировали: гранулярные белки лактоферрин (LF), NGAL (белок нейтрофилов, ассоциированный с желатиназой или липокалин), лизозим и миелопероксидазу (MPO); альбумин; цитозольные S100A8 and S100A9 белки (Табл. 6). Белки были локализованы в гелях соответственно их молекулярным весам, за исключением 25-kDa белка NGAL, который был выявлен как 50-kDaбелок (Рис. 12А, EM1, полоса 5). Такое несоответствие объясняется способностью этого белка образовывать гомодимеры. Кальций связывающие белки S100A8 и S100A9 способны образовывать гетерокомплекс S100A8/A9, известный как кальпротектин, который и был обнаружен в полосе 6 (Рис.27 А, EM1; Табл. 6).
Различают 4 типа секреторных гранул нейтрофилов: азурофильные (первичные), специфические (вторичные), желатиназные (четвертичные) гранулы и секреторные везикулы (Faurschou and Borregaard, 2003; Lominadze et al., 2005). Содержание гранул в значительной степени перекрывается. Однако лактоферрин, липокалин и лизозим содержатся преимущественно во вторичных гранулах, а миелопероксидаза в первичных. Считается, что сывороточный белок альбумин содержится в секреторных везикулах, куда он попадает из крови в процессе эндоцитоза. Следовательно, при адгезии к фибронектину в контрольных условиях происходит секреция первичных и вторичных гранул и секреторных везикул. При последующей инкубации в контрольной среде нейтрофилы секретировали значительно меньше белков, и только лактоферрин секретировался в количестве, достаточном для масс-спектрометрического определения (Рис. 27 А, EM2).
В течение первых 20 минут инкубации нейтрофилов в присутствии BPB, клетки секретировали лишь следовые количества белков (Рис. 27 В, ЕМ1). Это свидетельствует о том, что подавление распластывания нейтрофилов (Рис. 26 С), сопровождается подавлением секреции. ЕМ2, отобранная через 15 минут после смены среды на контрольную и содержащая слущенные цитонемы и продукты их разрушения, содержала те же белки, что и ЕМ1 контрольных нейтрофилов (за исключением лизозима). Кроме того в ЕМ2 был идентифицирован целый ряд дополнительных белков, которые мы 146 рассматриваем как белки цитонем (Табл. 7). Эти дополнительные белки могут быть разделены на следующие группы: (i) гранулярный бактерицидный агент катепсин G, локализованный преимущественно в азурофильных гранулах; (ii) ферменты, осуществляющие энергетический метаболизм, такие как транскетолаза (TKT), глюкозо-6 фосфатдегидрогеназа (G6PDH) и гликолитические ферменты фосфоглюкозоизомераза (PGI), энолаза и GAPDH; (iii) белки актинового цитоскелета и актин, L-пластин, моезин; (iv) другие белки, в том числе аннексин 1, глютатионтрансфераза и ov-серпин (Табл. 7). Важнейшую роль в бактерицидной активности нейтрофилов играют дефензины HNP-1-3, небольшие катионные белки, характеризующиеся наличием трех дисульфидных связей, что сильно затрудняет их идентификацию. Для определения дефензинов белки ЕМ1 и ЕМ2, отобранных от контрольных и BPB-обработанных клеток, были разделены при помощи хроматографии высокого разрешения. Несколько пептидных пиков было обнаружено в ЕМ2 BPB-обработанных клеток, но не в ЕМ2 контрольных клеток (Рис. 28). Эти пики отсутствовали в ЕМ1 как BPB-обработанных, так и контрольных нейтрофилов. Масс-спектрометрический анализ пика 1 идентифицировал пептиды с молекулярной массой 3372.2, 3443.3, и 3488.3 Da (Рис. 29), что совпало с молекулярной массой дефензинов HNP-2 (3371.00 Da), HNP-1 (3442.08 Da) and HNP-3 (3486.09 Da).
