Введение к работе
Актуальность проблемы
Важнейшей проблемой клеточной биологии является изучение стабильности генома и,как один из се главных аспектов.исслсдованис репарации ДНК.
К настоящему времени известно, что механизмы репарации ДНК на всех уровнях клеточной организации являются важнейшим фактором, определяющим резистентность клетки к действию УФ-света, ионизирующей радиации, химическим мутагенам и канцерогенам. Вместе с тем, действие репарационных систем тесно связано с такими важнейшими матричными процессами как репликация ДНК, транскрипция, рекомбинация ( Sancar, 1995). Основные представления о механизмах репарации ДНК в клетках млекопитающих сложились в результате изучения процессинга повреждений ДНК в составе целого генома. Тот факт, что в геноме эукариот лишь незначительная часть ДНК представляет собой кодирующие последовательности и что как у прокариот, так и у эукариот многие гены проявляют свою транскрипционную активность только при определенных условиях, натолкнул исследователей на мысль, что репарация ДНК должна осуществляться прежде всего именно в этих последователыгостях. Существенным этапом в решении данной проблемы стала разработка мйода количественного определения индукции и репарации повреждений ДНК в специфических геномных сегментах в зависимости от того, являются ли они транскрибируемыми или нстранскрибирусмыми. Впервые такой метод предложен в лаборатории Ханаволта (Bohr et al„ 1985), который позволил выявить более быструю репарацию УФ-индуцированных пиримидиновых димсров в активном гене, в сравнении с замедленной репарацией во фланкирующих нетранскрибирусмых участках ДНК или в геноме в целом. Позднее такая ускоренная репарация была покачана для мнопіх активно транскрибируемых генов в клетках человека, грызунов и Б. coli (Bohr ct al., 1987, Lchmann ct a!.. 1992. Hanawalt, 1987). Подобный феномен наблюдали не только при формировании пиримидиновых димсров, но и (б-4)-фотопродуктов и разноооразных аддуктои канцерогенов (Snydervinc, Bohr, 1992). Наряду с гсноспсцифичсской репарацией обнаружено, что при образовании пиримш .новых димсров, внутриинтспых сшивок и др. в активных генах преимущественно рспарирустся транскрибируемая ннгь ДНК
(Hanawalt, 1989, Lehmann ct al., 1992). Таким образом, подводя итог исследований последних лет, можно сказать, что существует по меньшей мере три уровня репарации ДНК с УФ-индуцированными пиримидиновыми димерами: медленная репарация неактивных генов, быстрая репарация активных генов и еще более быстрая репарация транскрибируемых нитей активных генов (Hanawalt, 1995). Вместе с тем, репарация радиационпо индуцированных разрывов нитей ДНК в транскрипциоппо активном и инертном хроматине изучена крайне недостаточно. Немногочисленные исследования по данному вопросу дали противоречивые результаты, не позволяющие сделать обобщающего вывода о наличии или отсутствии преимущественной репарации радиоиндуцированных повреждений нитей ДНК в жизненно важных последовательностях генома эукариот. Однако тот факт, что внеплановый синтез ДНК после действия ионизирующей радиации, равно как и УФ-облучения, инициируется на ядерном матрнксе (Газисв и др., 1985), с которым ассоциипована транскрибируемая ДНК, позволяет предположить, что радиоиндуцируемые разрывы нитей ДНК в клетках млекопитающих должны сепарироваться преимущественно в транскрибируемой ДНК. В связи с этим представлялось интересным разработать модельную систему, позволяющую анализировать индукцию и репарацию у-индуцированных однонитевых разрывов как в геноме в целом, так и в генных последовательностях с разной транскрипционной активностью.
Репарация как фундаммгтальный матричный процесс тесно связана с клеточной пролиферацией.' Имеющиеся данные указывают, что в регуляции репарации ДНК могут принимать участие естественные клеточные метаболиты, влияющие на процессы пролиферации клетки. Специфическими регуляторами клеточной пролиферации являются факторы роста, в частости ^энидермальпый фактор роста (ЭФР). Ранее было показано, что ЭФР совместно с инсулином ускоряет репарацию однонитевых разрывов ДНК в т/-облученных покоящихся клетках мышей Swiss ЗТб (Бильдим, 1990). Учитывая тот факт, что ЭФР, будучи важным звеном в активации генома, служит стимулятором транскрипции, и тот факт, что в регуляции клеточной пролиферации важная роль принадлежит факторам роста, представлялось интересным исследовать, в какой мере стимулирующее влияние ЭФР на процесс репарации связано с элиминацией повреждений в активных іі инертных участках генома.
Цель и залами исследования
Цель настоящей работы - исследовать репарацию однонитсвых разрывов. вызванных действием ионизирующей радиации в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК в нормальных клетках человека, а также в клетках больных наследственными заболеваниями - атахсисй-тслсангиэктазией и синдромом Кокейна - и возможное участие в этом процессе ЭФР. Общая задача требовала следующих конкретных исследований:
1. Разработать адекватную экспериментальную модель-систему, позволяющую
исследовать репарацию однонитсвых разрывов после действия у-облучсния в
участках ДНК с разной транскрипционной активностью генома клеток эукариот.
2. Исследовать репарацию у-индуцированных однонитевых разрывов в
транскрибируемой (протоонкоген с-тус). нетранскрибируемой ісателлит Ш
человека) и тотальной ДНК клеток HcLa.
3. Исследовать индукцию однонитсвых разрывов после действия у-облучення
в транскрибируемой (протоонкоген с-тус) и нетранскрибируемой (сателлит III
человека) ДНК клеток HcLa в условиях прямого и опосредованного действия
радиации и изучить репарацию однонитевых разрывов в этих ДНК.
-
Исследовать индукцию и репарацию однонитсвых разрывов после у-облучения в транскрибируемой и кзтрапскрибирусмой ДНК в клетках больного атахеией-телеангнэктазией.
-
Исследовать индукцию и репарацию у-имдуиироваиных однонитсвых разрывов в транскрибируемой -л нетранскрибируемой ДНК в клетках больного с синдромом Кокейна.
-
Оценить эффективность репарации у-индуцированных однонитевых разрывов в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК в покоящихся и стимулированных из состояния покоя митогеном (ЭФР) клетках HcLa.
Научная новизна и значимость работы"
Впервые предложен методический подход, поіволяюіімй анализировать воссоединение у-иидуиированных разрывов нитей ДНК в трапскрипиношю-активных и инертных участках генгча млекопитающих, основанный на гибридизации 5Н-мсчснной тотальной клеточной ДНК с "Р-мсчсннымн ЛИК
содержащими анализируемые последовательности. С помощью разработанной системы выявлено наличие преимущественной репарации у-ицдуцированных одмонитсвых разрывов (ОР) в пролиферирующих клетках HcLa. Повреждения элиминируются быстрее в транскрибируемой ДНК, чем в нстранскрибирусмой и тотальной ДНК. Анализ индукции одмонитсвых разрывов после у-облучения в присутствии перехватчика свободных радикалов днметилсульфоксила (ДМСО) показал, что повышенная индукция разрывов в транскрибирумом лротоонкогене с-тус является результатом непрямого действия ионизирующей радиации.
Впервые получены данные о репарации одмонитсвых разрывов после у-облучения в транскрибируемой и нстранскрибирусмой ДНК в клетках больного атаксией-телеангиэктазией, которые выявили два различия по сравнению с нормальными клетками: отсутствие повышенной индукции образования одмонитсвых разрывов и отчетливый дефект преимущественной репарации одмонитсвых разрывов в активно транскрибируемом протоонкогепе с-тус, что, возможно, является молекулярным дефектом, определяющим фенотипические особенности атаксии-телсаигиэктазии (AT). На клетках больного с другим наследственным заболеванием-синдромом Коксйпа (СК)-показано. что у-облученис вызывает сходный уровень индукции разрывов как в целом геноме, так и в транскрибируемой и нстранскрибирусмой ДНК. Однако, уровень репарации в транскрибируемой ДНК не превышает такового в геномной ДНК, то есть имеет место дефект преимущественной репарации в транскрибируемой ДНК у-индуцированных ОР ДНК (как и при эксцизиониой репарации УФ-индуцированных пиримидиновых лимеров и у-индуцированных изменений оснований).
При исследовании сгимулируюшего эффекта ЭФР на репарацию одмонитсвых разрывов в Активном и молчащем участках ДНК покоящихся и стимулироваинь . митогеном клетках HcLa обнаружено, что митогенпая стимуляция "заторможенных" клеток приводит к преимущественной (более быстрой) репарации однопитсвых разрывов в нстранскрибирусмой сателлитиой ДНК по сравнению с репарацией в транскрибируемо!, c-myc-содсржащсй ДНК.
Практнчсская.иенность работы
Предложенный в работе метод количественного определения индукции и репарации ОР в транскрибируемой и пстрапссрнбнрусмой ДИК существенно расширяет методические возможности анализа ироцессинга поврежденной ДИК в клетках млекопитающих после действия ионизирующей радиации. Это позволяет качественно более точно охарактеризовать течение поет радиационной репарации в клетках, различающихся рснарациопым фенотипом (как это сделано в данной работе при синдроме Коксйна и атаі:сии-телсашнзктазии). Полученные результаты открывают новые возможности целенаправленного управления процессами репарации ДНК в определенных участках генома эукариот.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на Всероссийских научных конференциях н научных семинарах лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации
