Введение к работе
іктуальность проблемы
Репликация ДНК - одно из важнейших событий клеточного цикла эукариот, и зучение вопросов, связанных с этим процессом, является актуальной задачей петочной биологии. Исследование механизма удвоения генетического материала петок было начато более 30 лет назад, однако еще и сегодня многие аспекты роцесса репликации ДНК остаются далеко не ясными.
Известно, что хромосомы млекопитающих состоят из большого числа епликативных единиц - репликонов, удвоение которых осуществляется при работе дной или двух, движущихся в противоположных направлениях со средней скоростью т.п.н. в 1 мин, репликатавных вилок. Вопрос о размере основной массы репликонов о настоящего времени не решен. Широко популярной является точка зрения, что ольшинство репликонов имеют относительно малый размер (в среднем 100 т.п.н.), и сновной репликативной единицей является кластер из 20-25 репликонов, ктивируемых одновременно (Hand, 1978). Согласно этой модели среднее время епликации одного кластера малых репликонов (КМР) должно быть таким же, как ремя удвоения одного репликона, т.е. около 30 мин. Однако, имеются данные, олученные методом нитевой ДНК-радиоавтографии (НДР), которые показывают, что иачительно более длинные (со средним размером 150-900 т.п.н.) и реимущественно некластеризованные репликоны, синтез ДНК в которых занимает 3-ч, представляют собой главные единицы репликации в клетках млекопитающих Оров, Ляпунова, 1976; Liapunova, 1994).
Когда отдельные фокальные центры репликации ДНК (ФЦР) были изуализированы в клеточном ядре с применением метода иммунофлуоресценции 'Jakamura et al., 1986), они были интерпретированы, согласно общепринятой точке эения, как кластеры одновременно активированных малых репликонов. лительность синтеза ДНК в ФЦР была исследована с помощью двойной мпульсной метки (Manders et al., 1992) in vivo 5-йод-2'-дезоксиуридином (ИДУ) и 5-пор-2'-дезоксиуридином (ХДУ). Оказалось, что картина внутриядерного аспределения ФЦР меняется, если интервал между двумя импульсными двадцатиминутными метками составляет 1 ч или более, и в результате был сделан ывод о том, что средняя длительность репликации ДНК в одном ФЦР составляет 1 ч. зменение картины распределения ФЦР в течение S-фазы в опытах с двойной еткой in viva является следствием двух различных процессов апрограммированного в течение S-фазы переключения синтеза ДНК на новые эзависимые ФЦР и локального вытеснения ДНК из мест синтеза в пределах одного
ФЦР (Pardoll et al., 1980; Manders et al., 1992, 1996). Поскольку в опытах in vivo эти два процесса различить весьма трудно, указанная выше оценка среднего времени синтеза ДНК в одном ФЦР (1 ч) представляется спорной.
Структура ФЦР не была исследована ни в одной из ранее опубликованных работ. Это связано с тем, что на полученных в этих работах фотографиях ФЦР выглядели как глобулярные образования, не имеющие видимой субструктуры.
Содержание ДНК в ФЦР могло бы быть оценено с использованием недавно разработанного статистического метода изучения геометрии поведения интерфазных хромосом (van den Engh et al., 1992; Yokota et al., 1995). Этот метод основан на результатах измерений линейных расстояний между сигналами флуоресцентной гибридизации in situ (ФГИС) от большого числа пар космидных проб с известным геномным расстоянием между пробами. График зависимости среднего квадрата физического расстояния между пробами и геномного расстояния между ними состоит из двух явно выраженных линейных участков, с резким переломом в районе ~2 м.п.н. (Рис. 1).
Рис. 1. Зависимость между средним квадратом интерфазного расстояния
Проанализированы 36 пар проб в диапазоне 10-190 м.п.н. (черные кружки) и 44 пары проб в диапазоне 0.1-4 м.п.н. (белые кружки), визуализированные в результате ФГИС не ядрах фибробластов человека в фазе GD/G1 клеточного цикла, фиксированных МУІ^ после гипотонической обработки, а - график для полного диапазона геномны> расстояний; б - участок графика в более крупном масштабе для геномных расстояний дс 4 м.п.н. Каждая точка графика представляет собой среднее для 154 измерений (Из Yokota et al., 1995).
Эти результаты хорошо согласуются с моделью случайных блужданий/гигантски: петель для поведения интерфазного хроматина, согласно которой в фазе G0/G'
леточного цикла хроматин организован в петли, содержащие''несколько млн пар іукпєотидов (м.п.н.) ДНК, основания которых прикреплены'^ оси, изгибающейся лучайным образом. Таким образом, измерив линейное 'расстояние между двумя очками на интерфазнои хромосомной нити, возможно оценить соответствующее еномное расстояние между этими точками. Проблема в применении описанного іетода для анализа репликативных единиц в ядре состоит в том, что до сих пор сгается неясным вопрос, подчиняется ли поведение S-фазного хроматина писанной модели случайных блужданий/гигантских петель для G0/G1-хроматина.
В данной работе мы исследовали организацию ФЦР в клетках млекопитающих : помощью метода иммунофлуоресценции. Для этого исследования были выбраны летки человека, как типичного представителя класса млекопитающих.
(ель и задачи исследования
Целью данного исследования было проведение количественного іммунофлуоресцентного анализа репликативных единиц в ядрах клеток человека. В іастоящей работе были поставлены следующие конкретные задачи:
-
Усовершенствовать метод визуализации ФЦР в ядрах клеток человека после включения в ДНК нерадиоактивно меченных предшественников в ходе S-фазы клеточного цикла и последующего иммунофлуоресцентного окрашивания сайтов включения метки, таким образом, чтобы получить высококачественные изображения реплицированных участков хромосомных фибрилл при максимальном оптическом разрешении.
-
Провести морфометрический анализ указанных фибрилл в S-фазных клетках, позволяющий выяснить соответствие их конформации модели случайных блужданий и определить коэффициент упаковки ДНК в этих фибриллах.
-
Используя полученный коэффициент упаковки ДНК в S-фазных хромосомных фибриллах, провести количественный анализ среднего содержания ДНК в репликативных фокусах различных линий культивируемых клеток человека.
-
С помощью метода ФГИС изучить распределение всех уникальных последовательностей Х-хромосомы в S-фазных ядрах клеток человека и выяснить, не меняется ли макроструктура хромосом при репликации, и существуют ли гигантские петли хроматиновых фибрилл в S-фазе.
-
Провести временной анализ картины ФЦР в клеточном ядре после импульсного включения одиночной релликативной метки in viva или длительного последовательного включения двух различных меток, первая из которых вводилась бы in vivo, а вторая - либо in vivo, либо in vitro, что позволило бы
оценить длительность полной репликации основной массы ФЦР в клетках человека и дать независимое цитологическое подтверждение той или иной концепции в вопросе о размерах и кластеризации репликативных единиц.
Научная новизна результатов
В данной работе усовершенствован метод иммунофлуоресцентной визуализации ФЦР после включения в ДНК нерадиоактивно меченных предшественников в ходе S-фазы клеточного цикла, что позволило анализировать структуру элементарных хромосомных фибрилл в ядрах клеток млекопитающих.
Обнаружено, что ФЦР состоят из субъединиц, и показано, что эти субъединицы являются структурными единицами организации хроматина, по содержанию ДНК (<260 т.п.н.) соответствующими известным микропетлевым доменам хроматина.
Впервые проведен анализ локальной конформации реплицированных хроматиновых фибрилл и показано, что модель случайных блужданий, предложенная для локального поведения G0/G1 -хроматина, справедлива и для S-фазного хроматина. Выявлено, что размеры Х-хромосом не отличаются в S-фазных клетках и в GO/GI-клетках, что показывает, что гигантские петли хроматиновых фибрилл, известные для G0/G1-клеток, существуют в S-фазе клеточного цикла. Таким образом, впервые показано, что модель случайных блужданий/гигантских петель, описывающая конформацию G0/G1-хроматина, применима и для S-фазного хроматина.
Определен коэффициент локальной упаковки ДНК во вновь реплицированном хроматине, позволяющий оценивать содержание ДНК в ФЦР. Сделана оценка средневесового содержания ДНК в ФЦР клеток ранней S-фазы.
Впервые показано, что длительность репликации ДНК в основной массе ФЦР составляет 1.5-3 ч, что противоречит общепринятой модели кластеров малых синхронно активируемых репликонов как основных репликативных единиц в клетках млекопитающих, но хорошо согласуется с альтернативной моделью репликации, согласно которой основные единицы репликации представляют собой отдельные или сгруппированные большие долгоживущие репликоны.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы
Полученные в работе результаты углубляют имеющиеся представления об организации процесса репликации ДНК в клетках млекопитающих.
Предложенные усовершенствования метода иммунофлуоресцентной визуализации ФЦР расширяют методические возможности анализа структуры ФЦР в клетках.
Материалы, полученные в работе, могут быть включены в курсы лекций по клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: "Сегрегация хромосом и анеуплоидия" (Сорренто, Италия, 1995 г.); "Репликация эукариотической ДНК" (Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, США, 1995 г.), "Регуляция репликации эукариотической ДНК" (Сент-Савер, Квебек, Канада, 1996 г.); а также на научных семинарах Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН и Центра по изучению рака Университета им. МакГилла, Монреаль, Канада.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем работы
