Введение к работе
Актуальность работы.
Прогресс в познании деятельности мозга привел к пересмотру значимости нейроглиальных клеток, которые стали рассматриваться не только как клетки «поддерживающие» функцию нейронов, но и как равноправные партнеры, участвующие в функциональной деятельности нейронов, а также регулирующие их развитие и дифференцировку. (Theodosis et al., 2008; Gibbs et al., 2008; Wetherington et al., 2008; et al., 2009; Krawczyk et al., 2010; Haberlandt et al., 2011).
Особое значение для клинической практики, в частности для клеточной терапии, имеет доказательство того, что клетки с иммунным фенотипом нейроглиальных являются стволовыми и могут давать начало нейронам (Belachew et al., 2003; Aguirre, Gallo, 2004; Emsley et al., 2005; Goldman, 2005 Trotter et al., 2010).
Идентификация и характеристика новых белков в нервной ткани позволили установить особый тип нейроглиальных клеток, отличных от астроцитов, олигодендроцитов, эпендимоцитов и микроглии, характеризующийся экспрессией гликопротеина семейства хондроитин сульфат протеогликанов NG2, а также a субъединицы рецептора к ростовому фактору кровяных пластинок (PDGF a R) и транскрипционного фактора Olig2, специфичного для олигодендроцитарного ростка (Chang et al., 2000; Dawson et al., 2003; Wigley et al., 2009; Kondo T., 2009; Kukley et al., 2010). Наиболее распространенное название этих клеток - NG2 клетки. Другое часто используемое название - OPC (oligodendrocytes precursor cells - предшественники олигодендроцитов), поскольку в антенатальном периоде и культуре клеток они являются стволовыми клетками для олигодендроцитов (Wigley et al., 2009;. Shen et al., 2010
Основные сведения о NG2 клетках получены на мышах и крысах, где было показано, что они являются мультиотростчатыми клетками, широко распространенны в белом и сером веществе головного мозга, их плазмалемма содержит большое количество рецепторов и ионных каналов, клетки не связаны друг с другом и с соседними клетками нексусами (низкомолекулярные красители Lycifer Yellow, Texas Red не проникают в другие клетки при их введении в NG2 клетки), аксоны нейронов образуют синапсы на NG2 клетках (Bergles et al., 2010), возбуждение которых способно вызывать постсинаптические потенциалы, регистрируемые при пэтч клампе целой клетки (Levine et al., 2001; Lin, Berges, 2002; Nishiyama et al., 2002, 2007; 2009; Ziskin et al., 2007; Bergles et al., 2010). Как было показано в экспериментах с броомдезоксиуридином (BrdU) NG2 клетки имеют высокий митотический потенциал, превосходящий аналогичный у других клеток макронейроглии (Zai, Wrathall, 2005; Tatsumi et al., 2005).
Функциональное значение клеток в зрелом мозге неизвестно и наиболее принятой является концепция, что они являются стволовыми предшественниками для олигодендроцитов и, возможно, нейронов. Так, на мышах показано, что клетки, экспрессирующие NG2, при особых условиях культивирования могут давать начало не только олигодендроцитам, но и интернейронам (Belachew et al., 2003; Aguirre, Gallo, 2004; Trotter et al., 2010).
Большое внимание уделяется возможности гликопротеина NG2 ингибировать рост аксонов, что, как полагают, имеет значение для регенерации нервной ткани (de Castro et al., 2005; Sandvig et al., 2005; Giger et al., 2010).
Данные о наличии и роли NG2 клеток в мозге человека немногочисленны (Staugaitis et al., 2009) и в основном касаются рассеянного склероза и некоторых видов опухолей (Chang et al., 2000; Chekenya et al., 2002; Chekenya, Pilkington, 2002; Stallcup et al., 2008; Wang et al., 2009).
Цель и задачи исследования:
Целью настоящей работы являлась идентификация и анализ NG2 клеток в головном мозге человека на операционном и аутопсийном материале, а также в мозге экспериментальных животных.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:
1) иммуногистохимически определить фенотип NG2 клеток и провести сравнительный анализ с другими клетками нейроглии (астроцитами, олигодендроцитами и микроглией);
2) провести ультраструктурный анализ NG2 клеток;
3) исследовать NG2 клетки в разных областях мозга (зоны гиппокампа, неокортекс);
4) проанализировать регенерационный потенциал NG2 клеток;
5) изучить морфофункциональное состояние NG2 клеток у экспериментальных животных в пилокарпиновой модели эпилепсии.
Научная новизна исследования.
В результате выполненных исследований получены следующие новые данные:
Впервые установлено, что NG2 клетки составляют особую популяцию нейроглии в мозге человека и экспериментальных животных, поскольку не экспрессируют белки типичные:
- для астроцитов - глиальный кислый фибриллярный белок (ГКФБ) и глутамин синтетазу (ГК);
- для зрелых олигодендроцитов: CNP и MBP, но экспрессируют транскрипционный фактор Olig2;
- для микроглии: CD68 и LN-3;
В отличие от других клеток нейроглии NG2 клетки экспрессируют трансмембранный протеин NG2 и PDGF a R.
NG2 клетки экспрессируют кальций связывающий белок S100b, уровень иммунореактивности выше в сером веществе в сравнении с белым (p< 0.05);
NG2 клетки отличаются по форме тела от астроцитов (не имеют маленьких филаподие-подобных отростков) и от олигодендроцитов (имеют разветвленные, извитые отростки, не контактирующие с миелиновыми волокнами).
Приоритетными являются установленные закономерности локализации NG2 клеток и их межклеточные взаимоотношения с нейронами и другими клетками нейроглии.
В работе впервые показано, что аксоны нейронов образуют синаптические контакты на телах и отростках NG2 клеток.
Установлено, что реактивные NG2 клетки отличаются усиленной иммунореативностью на NG2, экспрессируют высокий уровень нестина и виментина, а часть из них экспрессирует низко-аффинный рецептор к нервному фактору роста p75NGR.
Впервые идентифицирована субпопуляция биполярных малоотростчатых NG2 клеток конститутивно экспрессирующих нестин и виментин, находящихся преимущественно в белом веществе, которые вследствие высокой степени включения BrdU в культуре, можно рассматривать как стволовые предшественники.
Результаты, полученные в данном исследовании, являются одним из подтверждений гипотезы о возможности участия NG2–клеток в процессах нейрогенеза и регенерации нервной ткани.
Научно-практическая значимость работы.
Новые сведения о структурно-функциональной организации NG2 клеток позволят определить пути их использования как стволовых клеток для олигодендроцитов и, возможно, нейронов в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний головного мозга. Кроме того, полученные данные будут способствовать разработке целенаправленного медикаментозного воздействия на NG2 клетки с целью их последующей дифференцировки в зрелые нейральные и нейроглиальные клеточные типы.
Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии и кафедры нервных болезней и психиатрии с курсом нейрохирургии Мордовского государственного университета и служат обоснованием для продолжения исследований патогенетических звеньев заболеваний органов ЦНС, с целью разработки комплексных мероприятий по их лечению и профилактике.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
NG2 клетки являются особым типом нейроглиальных клеток головного мозга млекопитающих животных и человека, отличных от астроцитов, олигодендроцитов и микроглии.
-
NG2 клетки находятся в тесных взаимоотношениях с нейронами. Аксонные терминали образуют синаптические контакты на телах и отростках NG2 клеток.
-
NG2 клетки различаются в сером, где они преобладают в перинейрональной позиции в сравнении с астроцитами и олигодендроцитами, и в белом веществе. При патологии они приобретают признаки реактивных клеток, что проявляется в усилении экспрессии гликопротеина NG2 и экспрессии белков промежуточных филаментов - виментина и нестина.
Апробация работы.
Основные положения и результаты работы доложены на: Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы» (Москва, 2003); научной конференции «Фундаментальные прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004, 2006); научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2004-2007); IX научной конференции молодых ученых (Саранск, 2004); V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); V международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (С.Петербург, 2006); научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003, 2005, 2007); Всероссийской конференции «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2006); Всероссийском научном конгрессе «В.М. Бехтерев – основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007); IX конгресс международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы функциональной межполушарной ассиметрии и нейропластичности» (Москва, 2008); VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009); X Конгрессе Международной Ассоциации Морфологов (Ярославль, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 9 публикаций в рецензируемых журналах перечня ВАК.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материала и методов исследования», «Результатов собственных исследований» «Обсуждения полученных результатов», «Заключения», «Выводов» и «Списка литературы», включающего 39 отечественных 164 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 48 рисунками (микрофотографии, электроннограммы) и документирована 2 таблицами и 2 схемами.
