Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 .Миелопролиферативные заболевания 9
1.1.1. Хронический миелолейкоз 10
1.1.2. Эритремия 14 1.1.3.Сублейкемический миелоз (миелофиброз) 16
1.2. Гранулы нейтрофилов человека 17
1.2.1. Характеристика и классификация гранул нейтрофилов 18
1.2.1.1. Азурофильные (первичные) гранулы 19
1.2.1.2. Специфические (вторичные) гранулы 22
1.2.1.3. Желатиназные гранулы 23
1.2.1.4. Секреторные везикулы 24
1.2.2. Экзоцитоз гранул нейтрофилов 27
1.3. Гипотеза слипания и слияния мембран (SNARE гипотеза) 28
1.3.1. Характеристика основных белковых компонентов модели 29
1.3.1.1 .Белки семейства VAMP/синаптобревинов 29
1.3.1.2. Синтаксины 31
1.3.1.3. SNAP-25 32
1.3.1.4. NSF 33
1.3.1.5. SNAP 34
1.3.2. Механизм слипания/слияния мембран (SNARE гипотеза) 34
2. Материалы и методы исследований 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Материалы 41
2.3. Методы 43
2.3.1 Выделение нейтрофилов человека 43
2.3.2. Активация нейтрофилов 44
2.3.3. Определение активности миелопероксидазы 44
2.3.4. Определение активности лизоцима 45
2.3.5. Определение активности щелочной фосфатазы 45
2.3.6. Иммунофлуоресцентная микроскопия 46
2.3.7. Электронная микроскопия 47
2.3.8. Электрофорез белков 48
2.3.9. Иммуноблоттинг (Вестерн-блот анализ) 49
2.3.9.1. Перенос фракций из геля на фильтр 50
2.3.9.2. Иммунное выявление антигенов на фильтре 50
2.3.10. Иммунопреципитация 51
3. Результаты и их обсуждения 53
3.1. Оценка экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями 53
3.2. Идентификация белков-медиаторов экзоцитоза в лейкоцитах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями 73
3.3. Взаимодействие белков группы SNARE в нейтрофилах больных миелопролиферативными заболеваниями 87
Выводы 92
- Гранулы нейтрофилов человека
- Гипотеза слипания и слияния мембран (SNARE гипотеза)
- Материалы
- Идентификация белков-медиаторов экзоцитоза в лейкоцитах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями
Введение к работе
'*' Известно, что реализация ключевых функций нейтрофилов, главным обра-
зом защитной и воспалительной, в значительной мере обусловлена мобилизацией внутриклеточных гранул. Экзоцитоз гранул необходим для адгезии, тран-сэндотелиальной миграции и выхода клеток из кровеносных сосудов в ткани, образования реактивных метаболитов кислорода, секреции литических ферментов (Borregaard N., 1996; Lageti Е., Mocsai А., 1999).
В настоящее время установлено, что осуществление экзоцитоза в нейтрофилах периферической крови человека происходит через универсальный меха-низм слипания/слияния мембран, получивший название SNARE гипотеза. Ме-
L*i ханизм основан на взаимодействии белка везикулярной мембраны VAMP
(мембранный белок, ассоциированный с везикулами, v- SNARE) с белками плазматической мембраны, t-SNARE, - синтаксином и SNAP-25 (белок ассоциированный с синаптосомами, молекулярная масса 25 кД), образовании комплекса этих белков - SNARE комплекса - и связывании с комплексом цито-зольных белков, в конечном итоге приводящем к слиянию мембран (Gerst J., 1999). В нейтрофилах периферической крови человека вывлены множествен-
т* ные изоформы белков группы SNARE, которые, по-видимому, опосредуют эк-
зоцитоз разных типов гранул, а также исследована способность этих SNARE к
т5 белок белковым взаимодействиям (Mollinedo F., Lazo P., 1997; Nabokina S.M. et
al. 1997; Martin-Martin В et al, 1999; Mollinedo F. et al., 2003). В то время как представления о молекулярных механизмах, управляющих ходом экзоцитоза в нейтрофилах в норме постоянно расширяются и уточняются, данные по изучению экзоцитоза в нейтрофилах человека при различных формах миелоидных заболеваний, в частности при миелопролиферативных заболеваниях, практически отсутствуют в литературе.
Миелопролиферативные заболевания представляют собой группу опухо-лей кроветворной ткани, возникающих в результате злокачественной транс-
6
формации стволовой кроветворной клетки, и характеризующиеся способно-
стью клеточных элементов к дифференцировке и созреванию (Raskind W.H.,
*i' Steinmann L., Najfeld V., 1998; Tefferi A., 2001). Ранее в нейтрофилах перифе-
рической крови больных миелопролиферативными заболеваниями были выявлены как морфологические, так и функциональные дефекты, в том числе было отмечено снижение хемотаксиса, адгезии, бактерицидной активности, активности ряда ферментов внутриклеточных гранул (Гусева С.А., 1990; Borregaard N., 1993; Мацнер Я,, 1993; Wolach В. et al., 1998). Вполне вероятно, что отмеченные выше морфологические и функциональные изменения циркулирующих
нейтрофилов появляются вследствие нарушений механизмов, управляющих
экзоцитозом лейкемических нейтрофилов.
tr) Таким образом, исследования, нацеленные на изучение механиз-
мов экзоцитоза, в том числе белкового аппарата, вовлеченного в эк-зоцитоз нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями, представляются весьма важными для понимания морфофунк-ционального состояния и патофизиологии лейкемических нейтрофилов.
Цель и задачи исследования.
т> Основной целью данной работы явилось исследование молеку-
лярных механизмов экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофи-
т} лов периферической крови человека при различных миелопролифе-
ративных заболеваниях.
Для достижения этой цели были определены следующие задачи:
оценка уровня экзоцитоза нейтрофилов периферической крови при миелопролиферативных заболеваниях;
поиск и идентификация белков-медиаторов экзоцитоза (белков группы SNARE) в нейтрофилах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями;
-'исследование способности к белок-белковым взаимодействиям между отдельными представителями группы SNARE в нейтрофилах у больных миелопролиферативными заболеваниями.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Нейтрофилы периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями являются дефектными по системе регулируемого экзоцитоза внутриклеточных гранул.
Нейтрофилы пациентов с миелопролиферативными заболеваниями экспрессируют множественные изоформы белков группы SNARE. Белок VAMP-1, играющий ключевую роль в экзоцитозе азу-рофильных гранул, отсутствует в нейтрофилах больных хроническим миелолейкозом.
Способность к образованию VAMP-2 - содержащих SNARE комплексов, определяющих состыковку и слипание/слияние мембран в нейтрофилах пациентов с хроническим миелолейкозом и миело-фиброзом, снижена.
1>' Научная новизна работы.
В настоящей работе впервые проведено систематическое иссле-
^ дование экзоцитоза нейтрофилов больных миелопролиферативнымизаболеваниями. Впервые изучена экспрессия белков медиаторов эк
зоцитоза в нейтрофилах при миелопролиферативных заболеваниях, в
частности нами было показано, что в нейтрофилах пациентов с хро
ническим миелолейкозом отсутствует белок VAMP-1, играющий
ключевую роль в процессе экзоцитоза внутриклеточных гранул ней
трофилов в норме. Также впервые установлена внутриклеточная ло
кализация синтаксина 4 и VAMP-2 в покое и в клетках, подвергну-
rf* тых стимуляции. Впервые изучена способность VAMP-2 к взаимо-действию с SNARE-белками: синтаксином 4, SNAP-23 и SNAP-25. Причем впервые продемонстрировано, что способность VAMP-2 к белок-белковым взаимодействиям с указанными выше SNARE белками в нейтрофилах пациентов с миелофиброзом и хроническим миелолейкозом значительно снижена, по сравнению с нормой.
Научно-практическая ценность работы.
Результаты могут быть использованы в фундаментальных исследованиях при изучении механизмов слипания/слияния мембран в норме и при патологии.Результаты могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных установлению роли SNARE в индукции и развитии защитных и воспалительных функций нейтро-филов пациентов с хроническим миелолейкозом и миелофиброзом.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на конференциях молодых ученых Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2000-2004 гг.), на научных конференциях «Огаревские чтения» (Саранск, 2000-2004), на всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Кипр, 2004). Работа прошла апробацию на объединенном заседании кафедр генетики биологического факультета и цитологии, гистологии и эмбриологии медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
(З
Гранулы нейтрофилов человека
Исходно внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека под- разделяли на два основных типа - содержащие миелопероксидазу азурофильные гранулы и лишенные этого фермента специфические гранулы (Bainton D.F., Farquhar M.G., 1971; Bainton D.F., 1975). Более поздние исследования показали, что такое разделение, ставшее уже традиционным, слишком простое, чтобы объяснить дифференциальный экзоцитоз компонентов гранул и объединение их мембран с плазматической мембраной нейтрофила в процессе активации (Kieldsen L., Sengelov Н., Borregaard N., 1999). Субклеточное фрак-ционирование в сочетании с иммуноэлектроннои микроскопией по- ҐЦ зволило выявить гетерогенность пероксидазопозитивных и перокси- дазонегативных гранул. При этом обнаружены новые компартменты цитоплазмы, различные по морфологии, химическому составу, физической плотности, гистогенезу, способу активации и скорости функциональной мобилизации (Borregaard N., et al.,1993). По современным представлениям, нейтрофилы человека содержат внутриклеточные гранулы четырех типов: азурофильные (пер- вичные), специфические (вторичные), желатиназные (третичные) и секреторные везикулы (Baiton D.F., 1993, Baiton D.F., 1999, Borregaard N., 1997, Sengelov H., Nielsen M.H., Borregaard N., 1992). Гранулы, принадлежащие к разным типам, формируются последовательно на различных стадиях созревания нейтрофила в костном мозге в результате агрегации и гомотипического слияния транспортных везикул, отпочковавшихся от аппарата Гольджи и содержащих белки, предназначенные для секреции путем регулируемого экзоцитоза. Принципиально, что азурофильные гранулы отпочковываются от внутренней стороны аппарата Гольджи, а специфические и желати- назные от выпуклой внешней части (Козинец Г.И., Макаров В.А., 1997, Le Cabec V., Calafat J.s Borregaard N., 1997). Синтез грануляр- ных белков происходит на протяжении всего развития от миелобла- Ч ста до сегментоядерного нейтрофила (Borregaard N., et al., 2001). Ферменты нейтрофилов, действуя совместно, могут разрушать эла стин, коллаген и различные другие белки, активировать комплемент, образовывать кинины из различных кининогенов, а также улучшать проницаемость сосудов (Белова Л.А., 1997). При этом, многие из ферментов, присутствующих в специфических гранулах, наиболее активны при нейтральном или щелочном рН, а большинство фермен тов азурофильных гранул проявляют максимальную активность при кислых значениях рН (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). 1.2.1.1. Азурофильные (первичные) гранулы.
В процессе костномозгового гранулоцитопоэза азурофильные гранулы появляются на стадии промиелоцита, имеют диаметр 0,2-0,8 мкм, обладают высокой электронной плотностью, содержат кислые гидролазы, лизоцим, не ферментные катионные белки (Славинский А.А., 2002). Биосинтез миелопероксидазы - маркерного фермента азурофильных гранул - происходит в миелобластах и промиелоцитах (Borregaard N., et al., 1995; Arnljots К., Sorensen О., Lollike К., Wt Borregaard N., 1998). Азурофильные гранулы содержат ассоциированный с мембранами бактерицидный, увеличивающий проницаемость белок (BPI). Он способен связываться с липополисахаридами и оказывать бактерио-статическое и бактерицидное действие на широкий спектр грамоот-рицательных микроорганизмов. Стимуляция нейтрофилов приводит к перемещению этого белка в активированные компартменты клетки. После фагоцитоза BPI выявляется вместе с миелопероксидазой в фа- 74 госомах (Calafat J., et al., 2000). Гранулофизин (мембранный белок CD63), описанный ранее в тромбоцитах, обнаружен в азурофильных гранулах. После стимуля- ; ции нейтрофилов происходит мобилизация гранулофизина, и его экспрессия на поверхностной мембране клеток увеличивается. Этот белок рассматривается как маркер мембран азурофильных гранул и маркер активации нейтрофилов (Cham В.Р., Gerrard J.M., Bakon D.F.,1994). В состав азурофильных гранул входит синтаза оксида азота, которая связана с образованием нитротирозина вокруг фагоцитируемых бактерий. Индуцируемая форма этого фермента экспрессируется после обработки нейтрофилов человека смесью цитокинов (интер- 1J лейкин-I, фактор некроза опухолей, интерферон) и катализирует об- разование оксида азота. При его взаимодействии с кислородом образуется пероксинитрит, непосредственно участвующий в процессе нитрирования микроорганизмов (Evans T.J., et al., 1996, Fukuyama N., et al., 1996). Азурофильные гранулы нейтрофилов содержат в себе 2 семейства антимикробных катионных белков - дефенсины и серпонцидины. В группу, получившую название "серпонцидины", объединяют белки азурофильных гранул нейтрофилов, обладающих микробицидными свойствами и являющихся сериновыми протеиназами или их струк- турными гомологами, лишенными ферментативной активности. Основными представителями этой группы белков являются катепсин-G, эластаза, протеиназа-3 азуроцидин (Славинский А.А., 2002). Физиологическая роль серпонцидинов не ограничивается одним лишь участием их в обезвреживании микроорганизмов. Более того, показано, что их антимикробная активность существенно не зависит от проте-олитической активности. Белки этой группы играют важную роль в "f целом ряде физиологических процессов: в реакциях фагоцитоза, хе- мотаксиса, в активации системы комплемента, в регуляции кровяно-го давления, проницаемости сосудов, свертывании крови, в межкле- Ч точных взаимодействиях (Берлов М.Н., Лодыгин П.А., 2001). Дефенсины принимают участие в иммунной защите млекопитающих и беспозвоночных, присутствуют также в клетках кишечника и дыхательных путей (Gabay J.E., Almeida R.P., 1993). Дефенсины являются катионными белками, состоящими из 28-35 аминокислотных остатков, обогащены основными аминокислотами (аргинином, лизином), которые придают молекуле значительный положительный заряд, а также цистеином, 6 остатков которого образуют 3 внутримолекулярных дисульфидных мостика, стабилизирующих третичную i структуру пептидов. Для дефенсинов характерны выраженные бакте- рицидная, фунгицидная и антивирусная активности in vitro, что было подтверждено при морфологических исследованиях процессов фагоцитоза и воспаления. Дефенсины рассматриваются в настоящее время в качестве пептидных антибиотиков с широким спектром действия (Славинский А.А., 2002).
С помощью иммуноэлектронной микроскопии установлено, что в нейтрофилах здоровых людей только около 50% пероксидазопозитивных гранул содержат дефенсины (Огеп A., Taylor J.M., 1995). В связи с этим азурофильные гранулы л можно подразделить на крупные богатые дефенсинами гранулы и гранулы меньших размеров, не содержащие дефенсинов (Borregaard N., Cowland J.B., 1997). Четыре популяции азурофильных гранул идентифицированы в зависимости от морфологических особенностей, характеристик плотности, содержания миелопероксидазы, р-глюкуронидазы и дефенсинов. Самые мелкие гранулы (диаметр 0,15 мкм) имеют наименьшую плотность и устойчивы к ионофорной дегрануляции. Наи- более крупные (в среднем 0,3 мкм) и самые плотные гранулы отли- чаются высоким содержанием дефенсинов. (Parmley R.T., 1997). Применение моноклональных антител позволило определить 5 типов // пероксидазопозитивных гранул в циркулирующих нейтрофилах че- ловека на основе их морфологических характеристик и ультраструктурной локализации миелопероксидазы, что может быть отражением функциональной неоднородности азурофильных гранул (Saito N., et al.,1998; Nemeth К., 2001). 1.2.1.2. Специфические (вторичные) гранулы. Специфические гранулы формируются на стадии миелоцитов, имеют диаметр (0,1-0,2 мкм). содержат катионные белки, лизоцим, X) коллагеназу и гепараназу (Kosir М.А. et al., 2002). Пероксидазонегативные гранулы, по современным представлениям, классифицируются в зависимости от содержания в них лакто-феррина и желатиназы. Установлено, что 60% пероксидазонегатив-ных гранул имеют в своем составе и лактоферрин и желатиназу. Еще 15% гранул содержат лактоферрин, но лишены желатиназы. Для этих двух популяций сохранен термин "специфическая гранула" й (Borregaard N., et al., 1993; Kjeldsen L. Et al., 1993; Word P. et al., 2002). В миелоцитах и метамиелоцитах синтезируются маркеры специ- фических гранул лактоферрин и ассоциированный с желатиназой ли-покалин (NGAL). Стимуляция клеток вызывает секрецию NGAL из гранул. Этот белок легко мобилизуется в процессе активации ней-трофилов, обладает способностью связывать хемотактический фор-милпептид и служит модулятором иммунного ответа (Borregaard N., 1995; Kieldsen L., et al., 1996).
Гипотеза слипания и слияния мембран (SNARE гипотеза)
В настоящее время установлено, что экзоцитоз внутриклеточных гранул в нейтрофилах человека происходит по механизму слипа ния/слияния мембран, описанному в модели, получившей название SNARE гипотеза (Набокина СМ., 2001; Mollinedo F., et al., 2003). Эта гипотеза основана на взаимодействии цитозольных белков NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF attachment protein) с их рецепторами, названными SNARE. Исходно SNARE ги- І потеза была предложена для экзоцитоза синаптических пузырьков (Sollner T.et al., 1993), но в настоящее время известно, что она носит универсальный характер, поскольку гомологи мембранных белков V синаптических пузырьков идентифицированы во многих клетках, способных как к регулируемому, так и к конститутивному экзоцито- Роль белков SNARE в процессах секреции была подтверждена тремя линиями доказательств: 1)эти белки взаимодействуют с цитозольными белками SNAP и NSF; 2) мутации по любому SNARE белку летальны и приводят к блокированию секреции; 3) SNARE являются мишенями для протеолитической дегра- дации клостридиальными нейротоксинами, которые блокируют высвобождение нейротрансмиттера в синапсах (Hay J.С, 2001; Lawrence G., Dolly J., 2002). Под термином SNARE в настоящее время объединяют три груп пы белков: синаптобревины/VAMP, синтаксины, SNAP-25 (Gaisano Н. Et al., 1994; Schiavo G. et al., 1997; Galli T. et al., 1998; Shukla A ""& et al., 2000; Chen Y.A., Sheller R.H., 2001; Ungar D., Hughson F., 2003). 1.3.1. Характеристика основных белковых компонентов модели 1.3.1.1.Белки семейства VAMP/синаптобревшіов Данное семейство белков включает в себя интегральные мембранные белки с молекулярной массой 18 кДа. Два представителя этого семейства (VAMP-1 и VAMP-2) впервые были выявлены в ве- ; зо зикулах нейрональных клеток (Baumert M. et al., 1989; Elferrit L.A. et al., 1989). " , В молекулярной структуре этого семейства можно выделить NH2- концевой район, обогащенный остатками аспарагина, центральный гидрофильный участок, состоящий из 70 аминокислотных остатков и СООН-концевой домен. В NH2 -концевом районе сконцентрированы аминокислотные замены, отличающие белки этого семейства, а гидрофильная часть незначительно меняется при переходе из одной изоформы к другой, т.е. является консервативной частью белка (Chin А.С. et al., 1993; Calakos N., Sceller R.H., 1996). Известно, что экспрессия VAMP-1 ограничена в основном ней- ,) рональными и нейроэндокринными тканями (Trimble W.S., 1993).
Напротив, VAMP-2 экспрессируется как в нейрональных так и в ненейрональных клетках, для которых характерен регулируемый транспорт мембранных структур по типу экзоцитоза (Calhoun B.C., Goldenring J., 1997; Yang R., et al., 2004). Следует отметить, что УАМРгЗ/селлюбревин характерен только для ненейрональных клеток и экспрессируется в самых различных клетках и тканях и, по- " видимому, имеет повсеместный образец распространения. Этот бе- лок локализован в эндосомных пузырьках фибробластов и предпола- гается, что он является, маркером путей челночного перемещения транспортных везикул между различными внутриклеточными мембранами и плазмалеммой (Mahon М. et al., 1993). В настоящее время белки, гомологичные VAMP обнаружены не только в везикулах нейрональных клеток, но и во многих других клетках, способных как к конститутивной, так и к регулируемой секреции, так в частности эти белки идентифицированы в адипоцитах (Cheatham В. et al., 1996; Prior P. et al., 2004), зимогенных гранулах поджелудочной железы крысы (Gaisano H.Y. et al., 1996), инсулин- содержащих гранулах [3-клеток островков Лангерганса поджелудоч- ной железы крысы (Wheeler М.В. et ah, 1996), тубуловезикулах при- Л стеночных клеток желудка (Calhaum B.C., Goldenring J.R., 1997), в мембранах гранул нейтрофилов человека (Набокина СМ., 2001), ак-росомальных везикулах сперматозоидов (Schultz J.В. et al., 1997), кортикальных гранулах яйцеклеток морского ежа (Conner S., et al., 1997). 1.3.1.2. Синтакснмы Синтаксины представляют собой мультигенное семейство инте-тральных мембранных белков с молекулярной массой около 35 кДа. & Первый представитель этого семейства синтаксин 1А/1В, был обна- ружен и охарактеризован в плазматической мембране нейронов крысы (Bennet М.К., et al. 1992). Синтаксины являются достаточно консервативными белками с общими чертами структурной организации молекул. Молекулы этих белков протяженностью в 288-301 аминокислотных остатков содержат на карбоксильном конце трансмембранный домен, играющий важную роль в "заякоривании" белка в мембране и, по-видимому, в детерминировании внутриклеточной ло- кализации белка (Masaki R. et al., 1998; Fernandes I. et al., 1998). t Кроме того, каждый член семейства синтаксинов содержит несколь- ко доменов, способных к образованию различных а-спиралей, структур, которые, по-видимому, участвуют в межмолекулярных белок-белковых взаимодействиях. В клетках, способных к регулируемому экзоцитозу, все синтак сины, кроме синтаксина 11, ассоциированы с плазматической мем браной, являющейся мишенью для транспортной везикулы. Поэтому синтаксины относят к t-SNARE (от английского слова у target=MHineHb). В настоящее время гомологи этого белка, с избирательным ха-рактером распространения отдельных представителей, идентифици- -\ рованы в самых разных организмах от дрожжей до человека (Bennet М.К. et al., 1993; Calakos N., Scheller R.H., 1996; Nagamutsu S. et al., 1997; Nickols B.L, Pelham H.R., 1998; Kuliawant R. et al., 2004). Сек-венирование генома человека позволило идентифицировать 15 членов семейства синтаксинов. Было выявлено, что гены, кодирующие различные синтаксины расположены, главным образом,, на разных хромосомах. Синтаксины 3 и 5 найдены на 11-й хромосоме, но в разных локусах.
Дополнительное разнообразие в семействе синтаксинов генерируется за счет альтернативного сплайсинга для синтаксинов p. 1А, 2, 3, 5 и 16 (Teng F., et al., 2001). 1.3.1.3. SNAP-25 SNAP-25 - эволюционно консервативный белок, играющий клю чевую роль в процессе экзоцитоза (Hodel А., 1998; Grahan М. et al., 2002). SNAP-25 был исходно обнаружен в пресинаптической мем бране синаптосом (Oyler G.A., et al., 1989), в связи, с чем его отно- Ь сят к t-SNARE. SNAP-25 не является интегральным мембранным белком. Моле- ., кулы SNAP-25 ассоциированы с мембраной, по-видимому, за счет жирнокислотных групп, модифицирующих остатки цистеина в цен тральной части молекулы (Hess D.T. et al., 1992; Lane S.R., Liu Y., 1997). В молекуле SNAP-25 на N-концевом участке находится син- таксин-связывающий участок, а на С-конце синаптобревин- связывающий участок (Qrensen J.D., 2002; Koticha К., 2002; Freed- man S. et al., 2003). Для SNAP-25 характерна исключительно мем бранная топология (Hess D., 1992; Lane S.R., Liu Y., 1997). Ранее -1 считалось, что экспрессия SNAP-25 носит крайне ограниченный тка- неспецифичный характер. Белок обнаруживался преимущественно в нейрональных и нейроэндокринных клетках и отсутствовал в боль- "У шинстве исследованных ненейрональных объектах (Oyler G.A. et al., 1989; Wheeler M.B. et al., 1996). Однако дальнейшими исследованиями белки этого семейства были идентифицированы в хромафин-ных клетках надпочечников (Quintahar J.L. et al., 1998), клетках семенников, энтерохромаффинных клетках желудка (Hohne-Zell В, et al., 1997; Zhao СМ., et al., 1997). Также экспрессия белка обнаружена в скелетных мышцах (Jagadish M.N. et al., 1996) и в нейтрофилах человека (Mollinedo F., et al., 1997). Изоформа SNAP-25, SNAP-23 с 72% гомологией по аминокислотной последовательности, была об- 4 наружена во всех исследованных тканях крысы, причем в двух изо- формах (SNAP-23A и SNAP-23B) (Ravichandran V. et al., 1996). 1.3.1.4. NSF NSF (фактор чувствительный к N-этилмалеимиду) - цитозольный белок с молекулярной массой - 76 кДа, содержащий в своем составе 2 АТФ-связывающих домена, обладающих АТФ-азной активностью (Whiteheart S.W., Kupabaiek E.W., 1995). Мутации по различным уча сткам АТФ-связывающих доменов приводят к нарушениям в секре ті, ции (Whiteheart S.W. et al., 1994). NSF, как было установлено мето дом аналитического ультрацентрифугирования и методом, основан ном на сшивании субъединиц бифункциональными реагентами, обра зует гомотримерный комплекс (Whiteheart S.W. et al., 1992).
Материалы
В настоящей работе объектом исследования являлись нейтрофи-лы, выделенные из периферической крови 34 больных МПЗ. Кровь больных миелопролиферативными заболеваниями была предоставлена гематологическим отделением 4-й клинической больницы г. Саранска. У 12 из них диагностирован ХМЛ (8 больных с развернутой (2-й) стадией заболевания и 4 пациента с терминальной (3-й) стадией), у 13 эритремия (8 больных со 2-й стадией заболевания и 5 пациентов с 3-й стадией) и у 9 миелофиброз (5 больных со 2-й стадией заболевания и 4 пациентов с 3-й стадией). Средний возраст больных составил 53,2±3,8 года. Для сравнения в качестве контроля использовали нейтрофилы периферической крови 27 здоровых доноров. Выбор указанных объектов был обусловлен тем, что 1) способность к экзоцитозу нейтрофилов больных миелопролиферативными заболеваниями практически не изучена, 2) в развернутой и терминальной стадии заболевания имеются наиболее выраженные клинико-гематологические признаки. 2.2. Материалы Антитела использованные в работе: Моноклональное антитело SMI 81, узнающее SNAP-25, было произведено Sternberger Monoclonals Inc., США. Антитело (изотип IgG) реагирует с критическим эпитопом, расположенным в С-концевой части молекулы SNAP-25 (Mehta P.P. et al., 1996). В Bec-терн-блот анализе антитело использовали в разведении 1:1000. Поликлональные антитела против SNAP-23 были произведены в Лаборатории Трансдукции Сигнала и Биологии Лейкоцита (Вальядо-лидский Университет, Испания) (Martin-Martin В., et al., 2000). В иммуноблоттинге разведение антител составляло 1:1000. Моноклональное антитело 3D 10, узнающее синтаксин 6 , было любезно предоставлено доктором Х.Б. Боком (Стэнфордский Университет, США). Антитело было получено при использовании в качестве антигена синтаксина 6, соединенного с глутатион-трансферазой. Антитело (изотип IgG) узнает 26 аминокислотных остатка, расположенных в N-концевой части молекулы синтаксина 6. В Вестерн-блот анализе антитело использовали в разведении 1:1000. Моноклональное мышиное антитело против синтаксина 4 было произведено Transduction Laboratories, США. В иммуноблоттинге и иммунофлуоресцентной микроскопии разведение антител составляло 1:1000. Поликлональные антитела кролика 18.1, полученные против ре-комбинантных VAMP-1, были любезно предоставлены доктором X. Блази. В иммуноблоттинге разведение антител 18.1 составляло 1:1000. Моноклональные мышиные антитела против VAMP-2 было произведено Synaptic Systems, Германия. Антитело реагирует с критическим эпитопом, расположенным на N-концевой части молекулы VAMP-2.
В Вестерн-блот анализе и иммунофлуоресцентной микроскопии антитело использовали в разведении 1:1000. Биотинилированные антимышиные и антикроличьи IgG (Amer-sham, Англия) использовали в иммуноблоттинге в разведении 1:1000. Кроличьи IgG против IgG мыши, конъюгированные с флуорес-цеинизо-тиоцианатом, были получены из DAKO A/S (Дания) и ис- 4 пользованы в иммунофлуоресцентной микроскопии в разведении 1:20. л " Коньюгат стрептавидин-пероксидаза хрена был произведен фир- мой Amersham (Англия) и использован в иммуноблоттинге в разведении 1:1000. 2.3. Методы і" 2.3.1 Выделение нейтрофилов человека Выделение нейтрофилов человека осуществляли по методу (Mol- linedo F. et al., 1989). Клетки выделяли из 10 мл свежей крови, взятой у здоровых доноров и больных миелопролиферативными заболеваниями. Кровь брали из вены. В качестве стабилизатора применяли гепарин (50 ЕД/мл). При выделении использовали исключительно пластиковую посуду (во избежание активации нейтрофилов при контакте со стеклом). V Для седиментации эритроцитов кровь оставляли на 30-45 минут при комнатной температуре. Верхний, светлый слой суспензии отби- рали и подвергали центрифугированию при 1200 об/мин в течение 10 минут, Супернатант отбрасывали, а осадок, обогащенный лейкоцитами, ресуспендировали в 3 мл PBS, после чего суспензию наслаивали на 3 мл Ficoll/Hypaque и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 минут. PBS содержит натрий фосфорнокислый двузаме-шенный 12-водный в концентрации 0,02 моль/л, натрий фосфорнокислый однозаме-щенный 2-водный в концентрации 0,02 моль/л и натрий хлористый в концентрации 0,1 моль/л. Осадок, обогащенный Т "V нейтрофилами, суспендировали в 2 мл PBS, переносили в предвари- тельно взвешенную коническую центрифужную пробирку, добавляли 6 мл воды и инкубировали в течение 2 минут. При этом примесные " эритроциты, присутствующие в осадке, будут разрушены, а нейтро- филы в указанных условиях гипотонического лизиса сохранят свою целостность. По истечении времени инкубации осмотическое давление восстанавливали добавлением 2 мл 3,6% раствора NaCI, после чего нейтрофилы осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут. Осадок взвешивали и определяли количество выделенных нейтрофилов из расчета, что 106 клеток имеют вес 1,22 мг. I ; ;.J 2.3.2. Активация нейтрофилов. Клеточную суспензию делили на аликвоты по 1 мл, которые либо помещали в ледяную баню (для исследования распределения антигенов в покоящихся клетках и оценки уровня цито- "f; плазматического фермента), либо подвергали воздействию агента, стимулирующего секрецию. В последнем случае клетки преинкуби- -+ ровали с различными активаторами: 4/3-форбол 12-миристат 13- ацетат (ФМА) в конечной концентрации 40 нг/мл, или F-Met-Leu-Phe (FMLP) в конечной концентрации 10_7М, либо Агзі87 в концентрации 1 О-9 М и затем инкубировали при 37 С в течение 15 минут (Mollinedo F. et al., 1989).
Активированные нейтрофилы использовали для оценки уровня экзоцитоза и изучения транслокации SNARE при помощи иммунофлуоресцентной микроскопии. У, Измерение миелопероксидазной активности проводили по методу Моллинедо (Mollinedo F. et al., 1989). Объем исследуемой пробы (250 мкл) доводили до 1мл фосфатным буфером (см. пункт 2.3.2.), а затем добавляли к пробе 0,5 мл 0,2 М раствора ортофенилендиамина (0,4 мг/мл). Реакцию запускали добавлением перекиси водорода до конечной концентрации, равной 0,03%. Реакционную смесь выдерживали в темноте при комнатной температуре в течении 10-45 минут до развития соломенно-желтой окраски. Реакцию останавливали добавлением НС1 до конечной концентрации З М, после чего измеряли оптическую плотность при длине волны, равной 490 нм. Окраска, развивающаяся в течении фиксированного времени инкубации, прямо пропорциональна количеству пероксидазы в пробе. За единицу активности фермента принимали увеличение оптической плотности раствора на 0,001 за 1 минуту. 2.3.4. Определение активности лизоцима Для определения активности лизоцима объем исследуемой пробы (250 мкл) доводили до 1мл дистилированной водой, затем к пробе добавляли 1 мл суспензии Micrococcus lysodekticus в конечной концентрации 0,3 мг/мл, а затем инкубировали пробу при 37С на водяной бане в течении 10-15 минут. Оптическую плотность измеряли при длине волны, равной 450 нм. Концентрацию освободившегося фермента расчитывали, используя калибровочную прямую, построенную по раствору лизоцима. За единицу активности фермента принимали количество нг лизоцима/107 клеток/минуту (Mollinedo F. et al., 1989). 2.3.5. Определение активности щелочной фосфатазы Измерение активности щелочной фосфатазы проводили по мето- V- ду Бодански (Камышников B.C. 2000). В 2-х пробирках (1 опытная - для исследования активности щелочной фосфатазы и 1 контрольная - для оценки уровня фосфора в пробе) объем исследуемой пробы (0,1 мл) доводили щелочным раствором jS-глицерофосфата (0,5%) до 1 мл и инкубировали 1-ю пробирку во льду, а 2-ю при 37 С на водяной бане в течении часа. Затем добавляли по 1 мл молибденового реак тива (2,5% молибденовый аммоний, 7,5% H2SO4) и 1 мл раствора ас корбиновой кислоты (0,1% аскорбиновая кислота; 0,1 Н НС1). Через 10 мин фотометрировали на ФЭКе при красном светофильтре в кю- вете с толщиной слоя 5 мм. Концентрацию освободившегося фер- \ мента расчитывали используя калибровочную прямую, построенную по раствору неорганического фосфора.
Идентификация белков-медиаторов экзоцитоза в лейкоцитах пациентов с миелопролиферативными заболеваниями
Для поиска и идентификации отдельных белков группы SNARE в нейтрофилах периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями мы воспользовались следующим подходом. Выделенные нейтрофилы разрушали в лизисном буфере и состав лизатов анализировали при помощи электрофореза в 12% ПААГ- SDS и последующего иммуноблоттинга с применением антител, узнающих SNARE. Ранее было продемонстрировано, что нейтрофилы человека экспрессиру-ют набор белков семейства синтаксинов, а именно синтаксины 1а, За, ЗЬ, 4, 5, 6, 7, 9, 11 и 16. Наиболее изученными из них являются синтаксины 4 и 6. Установлено, что эти белки в норме локализованы в плазматической мембране и, по-видимому, функционируют в качестве t-SNARE при экзоцитозе (Martin-Martin В. et al., 2000). В экстракте нейтрофилов периферической крови больных миелопролиферативными заболеваниями моноклональное антитело против синтаксина 4 узнает единственную полосу, соответствующую белку с молекулярной массой и 32 кДа (рис. 7а). Результаты иммуноблоттинга с использованием моноклопального антитела, направленного против синтаксина 6, показывают, что другой представитель семейства синтаксинов - синтаксин 6 (белок с молекулярной массой и 31 кДа) также присутствует в экстрактах нейтрофилов пациентов с миелопролиферативными заболеваниями (рис. 76). Ранее было установлено, что нейтрофилы человека экспрессируют два белка семейства синаптобревинов - VAMP-1 и VAMP-2, которые ассоциированы с мембранами внутриклеточных мобилизуемых гранул и участвуют в процессах экзоцитоза в качестве v-SNARE (Набокина СМ., 2001; Brumell J.H. et al., 1995 и данная работа). Одновременное присутствие в полиморфноядерных лейкоцитах двух различных белков семейства VAMP, по-видимому, отражает их участие в механизмах, обеспечивающих специфичность при дегрануляции. Мы исследовали экспрессию VAMP-белков в нейтрофилах человека при миелопролиферативных заболеваниях. Иммунодетекция с применением VAMP-2-специфических антител демонстрирует присутствие иммунореактив-ной полосы, соответствующей белку с молекулярной массой «18 кДа как в контроле, так и при всех формах миелопролиферативных заболеваний (рис. 86).
Другой представитель семейства VAMP, белок VAMP-1, выявляется в экстрактах нейтрофилов больных эритремией и миелофиброзом, а при ХМ Л не обнаруживается (рис. 8а). В связи с тем, что 1) наши эксперементальные данные показали присутствие синтаксина 4 и VAMP-2 в нейтрофилах больных миелопролиферативными заболеваниями и 2) сведения о внутриклеточной локализации этих белков в нейтрофилах периферической крови нормальных доноров достаточно не полные, мы решили исследовать локализацию этих SNARE в нейтрофилах здоровых доноров. Локализацию синтаксина 4 и VAMP-2 изучали с помощью имму-нофлуоресцентной микроскопии. Для этого покоящиеся свеже выделенные клетки после фиксации и последующей пермеабилизации были подвергнуты инкубации с первичными антителами против синтаксина 4 или VAMP-2, а затем инкубации с вторичными антителами (анти-мышиные антитела, коньюги-рованные с флуоресцеинизотиоцианатом). В случае негативных контр ол ей инкубацию с первичными антителами не проводили. Распределение синтаксина 4 в покоящихся нейтрофилах представлено на рисунке 9. В покоящихся клетках продукт иммуногистохимической реакции Мы также исследовали локализацию синтаксина 4 в стимулированных нейтрофилах. В качестве стимула использовали хемотактический пептид FMLF. Известно, что активация нейтрофилов хемотрактантами сопровождается хемотаксисом и изменениями формы клеток: клетки при этом становятся асимметричными, вытянутыми, приобретают отростки, а лидирующий край формирует зону, вовлеченную в дегрануляцшо (Roos FJ. et al., 1987). Мы обнаружили, что в таких клетках продукт иммуногистохимической реакции определялся в плазмалемме уплощенной ламеллоподии и отсутствовал (или был резко снижен) в других участках плазмалеммы (рисунок 10). По-видимому, стимуляция нейтрофилов индуцирует перемещение молекул синтаксина 4 в плазматической мембране и их предпочтительное накопление в областях интенсивной дегрануляции. Установленная нами локализация синтаксина 4 в плазматической мембране нейтрофилов человека хорошо согласуется с описанным расположением этого белка в других клетках, где синтаксин 4 был также выявлен в плазматической мембране (Bennett М.К. et al, 1993). Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии с применением антител против VAMP-2 представлены на рисунке 11. Видно, что продукт иммуногистохимической реакции локализован преимущественно в отдельных грануло-подобных структурах, равномерно присутствующих по всему объему клетки. Четко выраженного иммунного окрашивания периферии клетки не наблюдается. Таким образом в покоящихся нейтрофилах VAMP-2 находится в цитоплаз-матических гранулах и, по-видимому, отсутсвует в плазматической мембране. Обнаруженный образец распространения VAMP-2 в нейтрофилах хорошо со- гласуется с литературными данными по локализации этого белка в секретор-ных везикулах нейрональных и нейроэндокринных клеток (Trimble W.S., 1993). г Чтобы определить с каким типом внутриклеточных гранул нейтрофилов ассоциирован VAMP-2, мы исследовали субклеточное распостранение белка в покоящихся нейтрофилах при помощи иммуноэлектронной микроскопии. Свежевыделенные клетки были подвергнуты фиксации, нарезанию на тонкие срезы и инкубации вначале с моноклональными антителами, узнающими VAMP-2, а затем с белком А, связанным с коллоидным золотом. Как видно из рисунка 12, частицы коллоидного золота главным образом находятся в мембранах популяции электронноплодных гранул, которые соответствуют по мор-фологическим признакам пероксидазо-негативным гранулам. При условиях, г, использованных в эксперименте, азурофильные гранулы были подвержены частичной солюбилизации, и в исследуемых образцах эти гранулы выявляются в виде областей с пониженной электронной плотностью.
Данные о частичной солюбилизации азурофильных гранул нейтрофилов человека были получены Ганзом с соавторами (Ganz Т. et al., 1985). Однако эти авторы отмечают, что, несмотря на частичную солюбилизацию содержимого гранул, азурофильные антигены сохраняют способность к детекции. Как видно из рисунка 12, морфо- J логически детерминированные азурофильные гранулы практически не содер- жат частиц золота. Таким образом, данные по ультраструктурной локализации г VAMP-2 в покоящихся нейтрофилах демонстрируют предпочтительную ассо- циацию этого белка с мембранами пероксидазо-негативных гранул. Данные иммуно флуоресцентной микроскопии для клеток, подвергнутых активации с РМА (40 нг/мл), представлены на рисунке 13. В стимулированных нейтрофилах продукт иммуногистохимической реакции выявляется, главным образом, по всему периметру клетки; дополнительное иммунное окрашивание других областей клетки практически отсутвует. Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что экзоцитоз внутриклеточных гранул ч сопровождается транслокацией VAMP-2 к плазматической мембране. Результаты определения внутриклеточной локализации VAMP-2 в нейтрофилах человека позволяют предположить, что это белок участвует в процессах регулируемого экзоцитоза в нейтрофилах, в частности, в секреции содержимого желатиназных и специфических гранул. Ранее нами было показано, что третий белковый компонент SNARE-комплекса, белок SNAP-25, содержится в нейтрофилах человека в двух изо-формах: SNAP-23 и SNAP-25, и ассоциирован с мембранами внутриклеточных гранул (Nabokina S.M. et al., 1997; Mollinedo F., Lazo P.A., 1997). Функциональная взаимосвязь между индивидуальными белками семейства SNAP-25 в нейтрофилах человека не ясна. Предполагают, что SNAP-25 и SNAP-23 обладают разной чувствительностью к различного рода модуляциям, что в свою очередь, может индуцировать некоторые отличия в уровне их функциональной активности (Набокина СМ., 2000). Результаты иммуноблоттинга демонстрируют наличие как SNAP-25- так и SNAP-23- иммунореактивных белков в нейтрофилах больных всеми исследованными формами миелопролиферативных заболеваний (рис. 14).
Похожие диссертации на Исследование экзоцитоза в нейтрофилах человека при миелопролиферативных заболеваниях
