Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные взгляды на роль ядер ствола мозга в сердечно-сосудистой регуляции (обзор литературы) 20
1.1. Функциональная организация, анатомические связи и нейрохимические системы, воздействующие на пара вентрикулярное гипоталамическое ядро 20
1.1.1. Функциональная цито- и хемоархитектоника паравентрикулярного гипоталамического ядра 20
1.1.2. Паравентрикулярное гипоталамическое ядро как интегратор интероцептивной и гуморальной информации 22
1.1.3. Нейрохимическая регуляция активности нейронов паравентрикулярного ядра 24
1.2. Паравентрикулярное ядро гипоталамуса как генератор паттерна эндокринного и автономного ответа на стрессорное воздействие 26
1.2.1. Активация коры надпочечников 27
1.2.2. Секреция вазопрессина 28
1.2.3. Координация ответа автономной нервной системы 29
1.2.4. Активация паравентрикулярного гипоталамиче ского ядра при стрессе 31
1.3. Клинические приложения 32
1.3.1. Конгестивная сердечная недостаточность 32
1.3.2. Стресс, артериальная гипертензия и метаболический синдром 34
Заключение
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Взятие образцов, фиксация и предварительная
обработка 39
2.2. Иммуногистохимия 42
2.3. Гибридизация in situ 43
2.4. Подсчет количества нейронов 44
2.5. Измерение площади, занимаемой иммунореактивными волокнами 45
2.6. Статистический анализ 45
Глава 3. Результаты собственных исследований 46
3.1. Организация и взаимодействие основных нейрохимических систем ствола мозга у здоровых людей и больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями 46
3.1.1. Вазопрессин-, вазоактивный интестинальный полипептид- и нейротензин-синтезирующие нейроны 46
3.1.2. Кортикотропин-рилизинг гормон-синтезирующие нейроны 53
3.1.3. Взаимодействие кортикотропин-рилизинг гормон-синтезирующих нейронов и вазопрессин-синтезирующих нейронов 76
3.1.4. Нитрергические нейроны 83
3.1.5. Нейропептид FF синтезирующие нейроны 111
3.1.6. Нейроны, экспрессирующие рецепторы FF1 и FF2
кнейропептиду FF 122
3.1.7. Взаимодействие нейропептид FF-эргической и нитрергической нейрохимических систем 139
3.1.8. Взаимодействие нейропептид FF-эргической и вазопрессин-эргической систем 142
3.1.9. Нейроны, экспрессирующие нейропептид Y,
ангиотензин, соматостатин и вещество Р 144
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 145
Заключение 167
Выводы ." 171
Практические рекомендации 173
Список литературы
- Функциональная цито- и хемоархитектоника паравентрикулярного гипоталамического ядра
- Секреция вазопрессина
- Измерение площади, занимаемой иммунореактивными волокнами
- Взаимодействие кортикотропин-рилизинг гормон-синтезирующих нейронов и вазопрессин-синтезирующих нейронов
Введение к работе
Вопрос о роли центральных отделов нервной и эндокринной
регуляции в этиологии первичной гипертензии впервые был поставлен и
традиционно рассматривается в отечественной науке (Павлов, Ланг,
Богомолец, Мясников, Чазов). Выдающийся русский клиницист Г.Т.Ланг на
основе собственных фундаментальных исследований и критического
анализа наблюдений зарубежных исследователей еще в середине прошлого
века утверждал: "...мы имеем полное право предположить, что лежащее в
основе гипертонической болезни нарушение функции аппарата,
регулирующего кровяное давление, имеет место прежде всего в
соответствующих гипоталамических центрах и заключается в состоянии
повышенной возбудимости этих центров". И далее: "Наши знания о связи
между функцией высших вегетативных центров в гипоталамусе и
эндокринной системой еще недостаточно полны и точны. Неясна, между
прочим, и роль нейрокринии, т.е. внутренней секреции некоторых ядер
гипоталамуса (например, nuclei paraventricularii)" (Ланг, 1950). Следует
отметить, что признаки повышенной секреции нейронов
паравентрикулярных ядер (nuclei paraventricularii) гипоталамуса у больных
первичной гипертензией впервые были продемонстрированы спустя
четверть века в патоморфологических исследованиях Ю.В.Постнова
(Postnov et al., 1974). К сожалению, эти исследования не были продолжены,
однако, теоретические воззрения Г.Т.Ланга получили блестящее
подтверждение в последующих клинических наблюдениях и
экспериментальных исследованиях. Создание новых методов суточного
мониторирования артериального давления, неинвазивного метода
определения уровня кортизола, прямой регистрации
электрофизиологической активности в симпатических нервах позволили подробно документировать нарушения суточного ритма артериального давления при эссенциальной гипертензии, выявить среди молодых здоровых
людей лиц, отличающихся повышенной реакцией гипоталамо-гипофизарно-
надпочечниковой и симпатической нервной системы на
психоэмоциональный стресс ("гиперреакторов" по Лангу), а последующие многолетние эпидемиологические исследования дали возможность проследить развитие гипертензии у большинства из них. Применение современных иммуногистохимиче-ских методов позволило выявить нервные клетки различной нейрохимической модальности, входящие в состав паравентрикуляргаого гипоталамического ядра, других ядер гипоталамуса, а также ядер среднего и продолговатого мозга. Использование транссинаптического антероградного транспорта меченых вирусов позволило в эксперимен-тах на животных установить анатомические связи между ядрами, а применение электрофизиологических методов и микродиализа дало возможность изучать взаимодействие ядер при экспериментальном моделировании сердечно-сосудистой недостаточости, гипертензии и, более широко, метаболического сидрома.
Было установлено, что паравентрикулярное гипоталамическое ядро (Ра) играет решающую роль в организации ответа симпатической нервной системы и реакции эндокринной системы на действие стрессогенного фактора. Сложный комплекс афферентных входов, внутренней нейрохимической регуляции, а также обширная система эфферентных выходов делают это ядро ключевой структурой, обеспечивающей поддержание гомеостаза в норме и при адаптации к изменяющимся условиям. Взаимодействие Ра с другими ядрами гипоталамуса, ядрами среднего и продолговатого мозга обеспечивает широкий спектр реакций организма, различающихся в зависимости от специфики параметров стимула. Нарушение функции Ра, в частности при генетической предрасположенности, может стать существенным элементом патогенеза конгестиальной сердечной недостаточности, а также гипертензии и других компонентов метаболического синдрома (Sawchenko et al., 1998; Patel 2000;
Kenney et al., 2003; Benarroch, 2005). Таким образом, Pa может быть терапевтической мишенью при этих заболеваниях.
Необходимо подчеркнуть, что сведения о морфофункциональіном статусе ядер ствола мозга у больных эссенциальной гипертезией, за единственным исключением давней работы Ю.В.Постнова (Postnov et al., 1974), практически отсутствуют. В то же время, объективные клинические показатели однозначно указывают на то, что функция этих ядер может быть изменена при этом заболевании. Например, некоторые молодые здоровые люди, находясь в условиях психоэмоционального стресса, реагируют особенно высоким выбросом кортизола, что свидетельствует о повышенной возбудимости гипотала14мо-1гипофизарно-надпочечниковой системы (HPА, hypothalamo-pituiary-adrenal axis) (Roy et al., 2001), Эти люди также характеризуются более высоким уровнем подъема артериального давления и повышенной реакцией симпатической нервной системы (Matthews et al., 2004; Flaa et al., 2006). Многолетние наблюдения показали, что, как правило, в среднем возрасте эти лица ("гиперреакторы", по Лангу) становятся гипертониками (Matthews et al., 2004). Больные эссенциальной гипертензией демонстрируют нарушения суточных ритмов многих физиологических показателей, что указывает на функциональную недостаточность основного водителя суточных ритмов, локализованного, как известно, в супрахиазматическом ядре. Подавляющее большинство сердечнососудистых катастроф у этих больных, в том числе и с летальным исходом, наблюдаются, как правило, в утренние часы, в момент перехода от сна к бодрствованию, что свидетельствует об особой уязвимости организма в это время. Отсутствие оптимального баланса суточных ритмов активности многих систем в эти часы характерно для больных ЭГ. В отношении ядер продолговатого мозга известно, например, что механическое раздражение области А1/С1, вызванное врожденным дефектом задней нижней мозжечковой артерии, ведет к активации постганглионарных волокон симпатических нервов (Schobel et al., 2002; Smith et al., 2004) и стойкому
повышению артериального давления (Morimoto et al., 1997; Geiger et al., 1998; Schobel et al., 2002; Smith et al., 2004). С учетом изложенного нами было проведено сравнительное морфо-функциональное исследование ядер ствола мозга больных эссенциальной гипертензией, погибших от острого нарушения кровообращения, и здоровых людей, погибших от механической травмы или гипотермии.
Цель работы
При посредстве методов количественной одинарной и двойной иммуногистохимии, а также гибридизации in situ выявить различия в организации и взаимодействии основных нейрохимических систем ствола мозга больных эссенциальной гипертензией и здоровых людей. ,'
Задачи исследования
В стволе мозга больных эссенциальной гипертензией и здоровых индивидов изучить: 1. нейрохимические системы, синтезирующие
а)вазопрессин,
б)вазоактивный интестинальный полипептид,
в)нейротензин,
г)кортикотропин-рилизинг гормон,
д)оксид азота,
е)нейропептид FF,
ж)рецептор FF1 к нейропептиду FF
з) рецептор FF2 к нейропептиду FF
и)норадреналин,
й)ангиотензин,
к)соматостатин,
л)нейропептид Y, м)вещество P. 2. проанализировать морфологические корреляты взаимодействия нейрохимических систем.
Научная новизна
Нами впервые проведено систематическое исследование ядер ствола мозга у больных ЭГ, умерших от острого нарушения кровообращения, и здоровых лиц, погибших от причин, не связанных с какой-либо патологией (механическая травма, гипотермия). Выявлены различия в организации и взаимодействии важнейших нейрохимических систем ствола мозга у лиц обеих групп. Впервые в мозге человека продемонстрирована нейрохимическая система, синтезирующая прессогенный нейропептид FF, и составлен атлас структур, экспрессирующих этот пептид. Впервые изучены ядра ствола, экспрессирующие рецепторы FF1 и FF2 к нейропептиду FF и выявлены различия в экспрессии этих рецепторов у больных ЭГ и здоровых лиц.
Практическая значимость
Результаты проведенного исследования показывают измене-ние функционального состояния и взаимодействия основных ней-рохимических систем ствола мозга у больных ЭГ, что является важ{ным для более глубокого понимания патогенеза заболевания. Впервые продемонстрирована новая нейрохимическая система (нейропептид FF-эргическая) в стволе мозга человека, что представляется важным с общебиологической точки зрения, продемонстрирована ее связь со структурами, имеющими отношение к сердечно-сосудистой регуляции и выявлены различия в ее организации у больных ЭГ и здоровых людей. Полученные данные позволяют оценить
действие современной терапии на центральные механизмы неироэндокриннои регуляции и наметить потенциальные мишени для разработки новых медикаментозных средств и способов терапевтического вмешательства.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
5?
І.При эссенциальной гипертензии изменения в экспрессии
нейрохимических систем ствола мозга наиболее выражены в
гипоталамусе и, в значительно меньшей степени, в продолговатом
мозге. Среди гипоталамических ядер наибольшим изменениям
подвержены супрахиазматическое и паравентрикулярное ядра.
2.При эссенциальной гипертензии в супрахиазматическом ядре
гипоталамуса значительно снижена активность трех основных
нейрональных популяций, имеющих отношение к 'регуляции
циркадных ритмов организма - вазопрессинт, вазоактивный
интестинальный полипептид- и нейротензин-эргической.
З.При эссенциальной гипертензии в паравентрикулярном
гипоталамическом ядре резко повышена активность кортикотропин-
рилизинг гормон синтезирующих нейронов, дающих проекции к
супрахиазматическому ядру и срединному возвышению.
4.В стволе мозга человека присутствует нейрохимическая система,
синтезирующая амидированный нейропептид FF. Рецепторы к
нейропептиду FF (FF1 и FF2) распределены в ядрах ствола
неравномерно. Так, FF1 экспрессируется, в основном, в гипоталамусе,
тогда как FF2 — в продолговатом мозге.
5.При эссенциальной гипертензии изменяется взаимодействие
нейрохимических систем ствола мозга. Прежде всего наблюдается
усиление воздействия кортикотропин-рилизинг гормон
синтезирующих нейронов паравентрикулярного гипоталамического
ядра на вазопрессин- и неиротензин синтезирующие нейроны супрахиазматического ядра, а также воздействия нейропептид FF синтезирующих нейронов на гипоталамические нейроны, синтезирующие оксид азота.
6.При эссенциальной гипертензии снижение или повышение активности нейрохимической системы той или иной модальности сопровождается параллельным изменением плотности иннервации микрососудов паренхимы мозга.
Функциональная цито- и хемоархитектоника паравентрикулярного гипоталамического ядра
Каждое из двух, симметрично расположенных в боковых стенках 3-го мозгового желудочка паравентрикулярных ядер гипоталамуса (ПВЯ) состоит из нескольких субъядер, различающихся по цитоархитектонике, нейрохимическим свойствам и выполняющих различные функции. Экспериментальные исследования, выполненные, в основном, на крысах показали, что некоторые субъядра содержат крупные нейроны, диаметром более 20 мкм, которые синтезируют вазопрессин (ВП, известный также как антидиуретический гормон) и окситоцин (О). Эти клетки являются центральным звеном гипоталамо-нейрогипофизарной системы (ГНС), так как посылают аксоны к задней доле гипофиза (нейрогипофизу), где выделяют ВП или О в кровеносное русло. Медиальное мелкоклеточное субъядро содержит мелкие нейроны диаметром до 20 мкм, которые синтезируют кортикотропин рилизинг гормон (КРГ), соматостатин (СОМ) и некоторые другие регуляторные пептиды и посылают аксоны к нейрогемальной зоне срединного возвышения, где регулируют секрецию гормонов клетками передней доли гипофиза (аденогипофиза). В частности, КРГ-синтезирующие нейроны этого субъядра регулируют секрецию аденокортикотропного гормона (АКТГ), в свою очередь, стимулирующего гуморально секрецию гормонов клетками коркового слоя надпочечников. Было показано, что эта гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система (ГГНС) реагирует повышенной секрецией гормона надпочечников кортизола (у животных кортикостерона) в ответ на любое стрессорное воздействие. Переднее, вентральное и заднее субъядра содержат мелкие нейроны, которые в различных пропорциях синтезируют КРГ, ВП, О, тирозин гидроксилазу (ТГ), ангиотензин (АНГ), соматостатин (СОМ), энкефалин (ЭНК), динорфин (ДН), нейротензин (НТ), оксид азота (ОА), нейропептид FF (НПФФ) и посылают аксоны в продолговатый и спинной мозг к центрам симпатической и парасимпатической регуляции (Cechetto, Saper, 1988; Swanson, 1991; Jansen et al, 1995; Sawchenko et al., 1996; Hallbeck et al., 2001; Goncharuk et al., 2006).
В ПВЯ человека идентифицированы крупно- и мелкоклеточные субъядра, гомологичные обнаруженным у крысы. Большое крупноклеточное субъядро, находящееся в вентролатеральном квадранте ПВЯ человека, содержащее ВП- и ацетилхолинергические (АХ) нейроны, и дорзальное субъядро, содержащее О-, ТГ- и АХ-эргические нервные клетки,, являются гомологами крупноклеточных субъядер ПВЯ крысы. Расположенное медиально мелкоклеточное субъядро, прилежащее к стенке, третьего желудочка, содержит КРГ-синтезирующие нейроны и может соответствовать медиальному мелкоклеточному субъядру ПВЯ крысы, контролирующему синтез АКТГ кортикотрофами аденогипофиза. Нейрохимический комплекс заднего субъядра, состоящий из крупных ТГ-, ВП-, О- и АХ-эргических нейронов и мелких КРГ-синтезирующих нейронов, гомологичен субъядрам ПВЯ крысы, дающим проекции к центрам автономной нервной системы в продолговатом и спинном мозге (Koutcherov et al., 2000).
Следует учитывать, что нейроны конкретной нейрохимической модальности могут входить в разные субъядра ПВЯ, иннервирующие разные мишени, поэтому ни один нейропептид не обладает единственной функцией. Экспрессия нейропептидов в нейронах ПВЯ динамична и зависит от гормонального фона и воздействия со стороны других нервных структур. Например, КРГ-эргические нейроны медиального мелкоклеточного ядра, контролирующие через АКТГ функцию коры надпочечника, могут дополнительно синтезировать ВП (потенциальный активатор синтеза АКТГ) в ответ на адреналэктомию или снижение уровня циркулирующих кортикостероидов (Swanson, 1991).
Секреция вазопрессина
Экспериментальные данные показывают, что ПВЯ является критическим звеном механизма активации симпатического воздействия на сердечно-сосудистую систему и почки. Установлено, что эта активация характерна для конгестивной сердечной недостаточности (Fedler et al., 2003; Weiss et al., 2003). В этих условиях наблюдается уменьшение тормозного эффекта со стороны барорецепторов и рецепторов предсердий на нейроны ПВЯ, контролирующие симпатичесую активность в почечных нервах и секрецию вазопрессина в кровеносное русло. Подобное снижение тормозного эффекта может быть обусловлено нарушением механизма ГАМК-эргического и опосредованного оксидом азота торможения этих нейронов (Li and Patel, 2003; Weiss et al., 2003). При конгестивной сердечной недостаточности наблюдается также активация ренин-ангиотезин-альдостероновой системы. Как упоминалось выше, циркулирующий в крови АНГП активирует нейроны субфорникального органа, которые посылают АНГП-эргические возбуждающие проекции к ПВЯ. Ангиотензин II, действуя через рецепторы ATj, возбуждает нейроны ПВЯ, которые активируют симпатические нервы почки (Coote, 1995). В опытах на животных с экспериментальной ишемией миокарда и конгестивной сердечной недостаточностью было показано, что ангиотензин II также потенциирует запускаемую сердечными афферентами рефлекторную активацию нейронов ПВЯ, регулирующих симпатическую активность. Активация рецептора AT] может включать локальную продукцию супероксида (Lindley et al., 2004). Альдостерон, действуя через минералокортикоидные рецепторы в ПВЯ, может также повышать симпатичскую активость (Weber et al., 2003). Таким образом. ПВЯ играет ведущую роль в обеспечении прямой связи между ренин-ангиотензин-альдостероновой системой и симпатической нервной системой, совместно контролирующими секрецию ренина, ток крови и реабсорбцию ионов натрия почечными канальцами (Johns, 2005).
Поврежденный миокард может выделять такой цитокин как фактор некроза опухоли a (Zucker et al., 2004). Цикулирующие в крови цитокины могут активировать ПВЯ либо через вагальные афференты, стимулирующие катехоламинергические входы от нейронов области А1/С1, либо посредством паракринных механизмов, с использованием цитокиновых рецепторов в околожелудочковых органах, а также посредством выделения простагландина Е2
Стресс, артериальная гипертензия и метаболический синдром Стресс рассматривается как риск-фактор в патогенезе сердечнососудистых заболеваний (Hjemdahl, 2002; Rosmond, 2003). Активация ПВЯ при стрессе может включать эндокринные и нейрональные механизмы, приводящие к развитию метаболического синдрома (Imaki et al., 1998; Rosmond, 2003). Метаболический синдром включает гипертензию, ожирение, дислипидемию, гиперинсулинемию и инсулиновую резистентность, а также интолерантность глюкозы или 2-й тип диабета. Участие ПВЯ в этом синдроме доказывается демонстрацией повышенной экспрессии адренергических рецепторов в ПВЯ у мышей линии ob/ob, характеризующейся ожирением, интолерантностыо глюкозы, а также инсулиновой резистентостью (Wang, 2005).
Стресс вызывает значительные, опосредованные симпатической активацией сердечно-сосудистые изменения, приводящие к гипертензии, одному из ключевых показателей метаболического синдрома. Роль ПВЯ в патогенезе индуцированной" стрессом гипертензии продемонстрирована в ряде экспериментальных исследований, в частности на спонтанно гипертензивных крысах линии SHR. Показано, что ангиотензин II, действуя через рецепторы АТ[, играет важную роль в активации симпатоадреналовой системы при остром стрессе (Ku and Li. 2003). У крыс ЛИНИИ SHR, нейроны субфорникального органа, дающие проекции к ПВЯ, проявляют повышенный, по сравнению с контролем, ответ на циркулирующий АНГИ (Miyakubo et al., 2002). При экспериментальном торможении нейронов ПВЯ наблюдается драматическое снижение активности симпатической активности и, как следствие, снижение сосудистого тонуса у этих .животных (Akine et al., 2003). В последнее время появляются данные о том, что центральный гипертензивный эффект АНГИ обеспечивается запускаемой через рецептор ATi продукцией супероксидных ионов (Zimmerman МС et al., 2002). Нейроны в ростральном полюсе вентролатерального отдела продолговатого мозга (РВЛ) получают возбуждающие входы от нейронов ПВЯ (Dampney et al., 2003), экспрессируют рецептор ATj (Allen et al., 1988) и их повышенная активность обеспечивает гипертензию у крыс SHR (Ito et al., 2002). Таким образом, как ПВЯ так и РВЛ, по-видимому, являются основными ядрами, где ренин-ангиотензиновая система мозга участвует в поддержании повышенного артериального давления. Оба эти ядра являются потенциальными мишенями для антигипертензивного действия ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента и антагонистов рецептора АТЬ которые, как известно, могут проникать через гемато-энцефалический барьер (Muders et al., 1997).
Измерение площади, занимаемой иммунореактивными волокнами
Мы впервые провели систематическое иммуногистохимическое исследование нитрергической системы ствола мозга человека. У здоровых лиц, нейроны, содержащие нейроспецифическую синтазу оксида азота (nNOS, neurospecific nitric oxide synthase), были обнаружены в таких наиболее рострально расположенных ядрах как вертикальная (VDB, diagonal band Broca s, vertical limb) и горизонтальная (HDB, diagonal band Broca s, horizontal limb) ножки ядра диагональной полоски Брока, переднемедиальное предзрительное ядро (АМРО, anterior medial preoptic nucleus), медиальная (AcM, n.accumbens, medial part) и латеральная (AcL, n.accumbens, lateral part) части прилегающего ядра (Ac, n.accumbens) и ядро ложа терминальной полоски (BST, bed nucleus of the stria terminalis). Следует отметить, что во всех этих ядрах nNOS-иммунореактивные нейроны представляли собой небольшую часть общего числа нейронов, окрашенных по методу Ниссля. В некоторых гипоталамических структурах на этом уровне, таких как медиальная (АсМ) (рис 19 В) и латеральная (AcL) (рис. 19 С) части прилегающего ядра и конечных островках обонятельного бугорка (TuTl, tubercular terminal islands) (рис. 19 D, E), nNOS содержащие нейроны встречались редко и были распределены равномерно, тогда как в дорсальном перивентрикулярном ядре (DPe) (рис. 19 F), центральном отделе ядра ложа терминальной полоски (BSTC) они были более многочисленны и располагались группами (рис. 19 Н), либо, как в латеральном отделе (BSTL), были также достаточно многочисленны, но распределены равномерно (рис. 19 G). Во всех ядрах интенсивность окрашивания нейронов варьировала от слабой до сильной, но даже в слабоокрашенных нейронах можно было легко проследить контур перикариона и отростки (рис. 19 В, С, D, Е, I). По своим морфологическим признакам нитрергические нейроны не представляли собой отдельной популяции, а соответствовали нейронам тех ядер, в которых находились. Многие из них располагались группами вокруг микрососуда и иннервировали его (рис. 19 С), причем, даже расположенные вдали от сосуда одиночные нейроны могли посылать длинный аксон, проникающий в сосудистую стенку (рис. 19 В).
Рис. 19. Нитрергические нейроны и волокна на фронтальном срезе гипоталамуса здорового человека (#01) на уровне рострального полюса третьего мозгового желудочка. Фрагменты медиальной (АсМ) и латеральной (AcL) части прилежащего ядра, n.accumbens (А) показаны под большим увеличением, соответственно, на В и С. На D и Е показаны под большим увеличением фрагменты конечных островков обонятельного бугорка (TuTl, tubercular terminal islands). Ограниченные прямоугольниками участки дорсального перивентрикулярного ядра (DPe), латерального (BSTL) и центрального (BSTC) отделов ядра ложа терминальной полоски (А) показаны под большим увеличением, соответственно, на F,G,H- nNOS-иммунореактивный нейрон в BSTC (Н) представлен под большим увеличением на I (звездочкой указано одно и то же место препарата). nNOS-иммунореактивные нейроны различной величины, формы и плотности окрашивания представлены в виде компактных клеточных групп в BSTC (Н), в меньшей степени эти нейроны сгруппированы в DPe (F) и они распределены в случайном порядке в BSTL (G). Во всех представленных ядрах, нитрергические нейроны обладают длинными, интенсивно ветвящимися отростками (B,C,D,E,I). Некоторые из этих отростков проникают глубоко в стенку рядом расположенных кровеносных сосудов (В, С, Е, G, стрелки)
У здоровых лиц, в надпрекрестноом (супрахиазматическом) ядре (SCh) количество нитрергических нейронов (рис. 20 D) было намного меньше, чем вазопрессин (УР)-синтезирующих нейронов (рис. 20 Е). Другой важной особенностью было отсутствие nNOS содержащих нейронов в вентральном отделе супраоптического ядра (SO) (рис. 20 F). В то же время, большое количество нитрергических нейронов мы наблюдали в расположенной дорзальнее SO горизонтальной ножке ядра диагональной полоски Брока (HDB, diagonal band, horizontal limb) (рис. 20 С) Часть аксонов этих нейронов, проходя в составе медиального пучка переднего мозга (mfb, medial forebrain bundle), проникала глубоко в вентральные отделы SO, формируя синаптоподобные контакты на неокрашенных нейронах (рис. 20 F). Рис. 20. Нитрергические (nNOS)- (А) и вазопрессин (УР)-эргические j(B) нейроны на двух прилегающих фронтальных срезах гипоталамуса на уровне надперекрестроного (супрахиазматического) ядра. Ограниченные прямоугольниками участки Sch на А и В представлены под большим увеличением, соответственно, на D и Е. Наблюдаются единичные нитрергические нейроны в SCh и многочисленные VP нейроны на прилегающем срезе (Е). Ограниченный прямоугольником дорсолатеральный участок SO (А) представлен под большим увеличением на С. Область в вентральном отделе SO (А), показана под большим увеличением на F (звездочкой на А и F отмечено одно и то же место препарата). Наблюдаются скопления неокрашенных крупных нейронов в SO (С, стрелки), и на этом же срезе, многочисленные nNOS-иммунореактивные нейроны наблюдаются в диагональной полоске (db). Неокрашенный крупный нейрон, заключенный в прямоугольних (С), показан под большим увеличением во вставке на F (острия стрелок указывают его перикарион). Нитрергические волокна, входящие в состав медиального пучка (mfb), проникают в дорсолатеральную (С) и вентральную (F) части SO и некоторые из них, по-видимому, образуют контакты с перикарионами неокрашенных крупных нейронов (F, стрелка и вставка в F, острия стрелок) Масштабный отрезок - 1 мм (А,В) 20 мкм (D, Е), 50 мкм (С, F), 10 мкм (вставка на F)
Взаимодействие кортикотропин-рилизинг гормон-синтезирующих нейронов и вазопрессин-синтезирующих нейронов
Применяя метод количественной иммуногистохимии, мы обнаружили, что в супрахиазматическом ядре гипоталамуса (SCh, suprachiasmatic nucleus) у больных эссенциальной гипертензией (ЭГ) значительно снижено, по сравнению с контролем, количество нейронов трех основных, функционально различных групп — вазопрессин (VP)-, вазоактивный интестинальный полипептид (VIP)- и нейротензин (МТ)-синтезирующих. Известно, что у млекопитающих в SCh локализован основной водитель суточных ритмов (Van der Pol and Dudek, 1993; Weaver, 1998; Lowrey and Takahashi, 2000; Reppert and Weaver, 2001), поэтому полученные нами результаты представляют собой основание для возможного объяснения клинических наблюдений о нарушении суточных ритмов ряда физиологических показателей у больных ЭГ (Tuck et al., 1985; Dyer et al., 1987; O Brien et al., 1988; Pickering, 1990; Portaluppi et al., 1990; Verdecchia et al, 1990; Coca, 1994; Munakata et al., 1994; Karioetal., 1996).
Необходимо отметить, что уменьшение количества VP-, VIP- и NT-иммунореактивных нейронов в SCh больных ЭГ сопровождалось снижением интенсивности их окрашивания. При этом следует подчеркнуть, что срезы образцов ствола мозга здоровых людей (контрольная группа) и больных ЭГ мы обрабатывали одновременно и в совершенно идентичных условиях, что является непременным условием для проведения подобных сравнительных количественных исследований. Учитывая то, что оптическая плотность конечного продукта использованной нами иммуногистохимической реакции на выявление конкретного пептида соответствует количеству этого пептида, измеренного при помощи радиоиммунологического анализа (van der Sluijs et al., 1987, 1988), можно считать, что у больных ЭГ в соответствующих нейронах SCh снижено содержание VP, VIP и NT. Следует отметить, что отростки этих нейронов также были окрашены слабо и на небольшом протяжении, что может свидетельствовать о снижении количества транспортируемого пептида. Поскольку известно, что содержание какого-либо пептида в перикарионе нервной клетки определяется разницей между скоростью его синтеза и транспорта в аксон, можно думать, что основной причиной уменьшения интенсивности окрашивания и, тем самым, уменьшения числа иммуногистохимически детектируемых VP-, VIP- и NT нейронов в SCh больных ЭГ является снижение активности синтеза этих пептидов. Необходимо также отметить, что материал для исследования был взят спустя 3-4 часа после констатации летального исхода, что, как известно (Torres et al., 1992; Lucassen et al., 1995), не влияет на содержание пептидов в гипоталамических ядрах.
Количественный анализ мы проводили при помощи широко используемого метода статистической оценки числа иммунореактивных перикарионов в замкнутом геометрическом объеме. Этот подход не предполагает получение точного числа нейронов той или иной модальности. Вместе с тем он весьма продуктивен при оценке изменений количества нейронов определенной популяции в ядрах ствола мозга (Ноппап and Swaab, 1993; Ноппап et al., 1996; Zhou et al., 1997). Следует отметить, что полученные нами количественные характеристики различных нейрональных популяций SCh здоровых лиц (контрольная группа) довольно хорошо совпадают с данными других авторов, полученными при других способах обработки ткани, окрашивания срезов и подсчета количества нейронов.
Установлено, что экспрессия вазопрессина нейронами SCh изменяется ритмически в течение суток. Причем минимум этого суточного ритма приходится на 3 часа ночи, а максимум - на 10 часов утра (Ноппап et al., 1996). С другой стороны, известно, что больные ЭГ погибают от сердечнососудистых расстройств, в основном, ранним утром. В нашем исследовании, 8 больных ЭГ погибли между 5 и 10 часами утра и в 7 контрольных случаях летальный исход был зафиксирован также в этот промежуток времени. Сравнение этих выборок показало, что у всех гипертоников в этот момент количество VP нейронов было намного меньше, чем у здоровых лиц.
Экспериментально установлено, что VP-эргическая нейрональная популяция в SCh проявляет отчетливый суточный ритм таких клеточных параметров как количество информационной РНК, кодирующей синтез вазопресснина (VPmRNA), содержание вазопрессина, биоэлектрической активности, причем амплитуда и периодичность этого ритма практически не зависит от наружного освещения или любых других параметров окружающей среды. Поэтому считается, что этот независимый суточный ритм изменения клеточных параметров VP-эргической нейрональной популяции в SCh отражает работу эндогенного водителя циркадных ритмов, клеточную и молекулярную природу которого предстоит выяснить в будущих исследованиях (Carter and Murphy, 1991; Cagamnang et al., 1994; Jin et al., 1999)
С учетом изложенного, мы рассматриваем драматическое уменьшение количества VP-эргических нейронов в SCh больных ЭГ как свидетельство серьезных нарушений в механизме эндогенного водителя суточного ритма. Причем эти изменения, по-видимому, не являются следствием общего дегенеративного процесса гипоталамической области, в которой находится SCh, так как в рядом расположенных паравентрикулярном (Ра) и супраоптическом (SO) ядрах подобные изменения VP-эргических нейронов отсутствуют. Кроме того, мы не наблюдали признаков локальной ишемии в SCh при патоморфологическом анализе прилегающих срезов.
