Введение к работе
Актуальность проблемы. Аллергические заболевания (АЗ) являются одними из наиболее распространенных хронических заболеваний, в основе которых лежит повышенная чувствительность организма к воздействию некоторых факторов внешней среды, которые принимаются им за потенциально опасные. По данным Всемирной организации аллергии, около 30-40% населения мира страдают различными АЗ (World Allergy Organisation, ). Бронхиальная астма, аллергический ринит и атопический дерматит (атопическая триада) – три распространенных, взаимосвязанных между собой аллергических заболевания, часто трансформирующихся из одного в другое и сопутствующих друг другу.
Бронхиальная астма (БА) - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором играют роль многие клетки и клеточные элементы (GINA, 2010). БА относится к числу наиболее распространенных, тяжелых и инвалидизирующих хронических заболеваний, значительно изменяющих образ и качество жизни больных. В мире насчитывается около 300 млн. больных БА, распространенность данной патологии в разных странах варьирует от 1 до 18% (GINA, 2010). Согласно данным Российского респираторного общества, в России распространенность БА среди детей составляет от 5,6 до 12,1%, среди взрослых – 5,6-7,3%, а общее количество больных БА в России приближается к 7 млн. (Глобальная стратегия по лечению и профилактике бронхиальной астмы. Пересмотр 2006 г.; ФЦП РФ «Бронхиальная астма» на 2011-2015 годы). Аллергический ринит (АР) – заболевание, характеризующееся IgE-опосредованным воспалением, развивающимся в результате попадания аллергенов на слизистую оболочку носа. В мире АР страдают 10-30% взрослых и до 40% детей (Pawankar et al., 2011), в России распространенность АР в различных регионах колеблется от 18 до 38% (http://www.pediatr-russia.ru). Симптомы, развивающиеся при AР, не являются угрожающими для жизни, однако они создают значительный дискомфорт, резко снижают работоспособность и качество жизни человека. Поздняя диагностика АР и несвоевременное назначение патогенетической терапии могут привести к появлению осложнений и развитию БА. Атопический дерматит (АД) – хроническое воспалительное заболевание кожи, которое чаще всего является первым проявлением аллергии у ребенка, может продолжаться в зрелом возрасте и приводит к физической и эмоциональной дезадаптации пациента. Почти у половины детей на фоне АД в последующем формируется бронхиальная астма или аллергический ринит. Распространенность АД у детей составляет 15-30%, у взрослого населения – 2-10% (Pawankar et al., 2011).
Аллергические заболевания имеют сложную многофакторную природу и развиваются при взаимодействии факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Во всем мире ведется активный поиск генов, отвечающих за формирование предрасположенности к АЗ, что связано как с несомненной актуальностью изучения факторов риска развития АЗ, так и с появлением новых возможностей генетических исследований. К настоящему времени выполнены анализы ассоциации БА и других АЗ с полиморфными вариантами сотен генов. Проведено более 20 полногеномных анализов сцепления БА, атопии, АР и АД. Выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АЗ, идентифицированы позиционно-клонированные гены для БА (ADAM33, DPP10, MS4A2 (FCERIB), GPR154 (GPRA), PHF11, HLA-G, CYFIP2) и АД (COL29A1) (Van Eerdewegh et al., 2002; Allen et al., 2003; Zhang et al., 2003; Laitinen et al., 2004; Nicolae et al., 2005; Soderhall et al., 2007).
Одним из наиболее перспективных современных методов изучения сложных признаков является метод полногеномного анализа ассоциаций (Genome-wide Association Studies, GWAS), в котором проводят генотипирование и тестирование ассоциации с заболеванием сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) (Manolio et al., 2010). При первом GWAS БА обнаружена ассоциация ОНП, локализованных в области 17q12-q21 (гены ORMDL3 и GSDMB), с детской астмой в Германии и Англии (Moffat et al., 2007). За последние годы GWAS БА проведены в различных популяциях мира, обнаружены новые гены, ассоциированные с развитием БА у индивидов европейского происхождения - DENND1B, PDE4D, RAD50, IL1RL1/IL18R1, HLA-DQ, IL33, IL6R, SMAD3 и IL2RB; африканского происхождения - ADRA1B, PRNP и DPP10; мексиканцев - TLE4, корейцев - CTNNA3 (http://www.genome. gov/GWAStudies/). Опубликованы результаты двух GWAS для АД, выявивших ассоциацию с ОНП области 11q13.5 у индивидов европейского происхождения (Esparza-Gordillo et al., 2009), и ОНП, локализованными в областях 5q22.1, 20q13.33 и 1q21.3 (FLG), у китайцев (Sun et al., 2011).
В целом, генетические исследования показали, что в этиопатогенезе АЗ принимает участие множество функционально взаимосвязанных генов. Идентифицировано более 150 генов-кандидатов АЗ, однако только около 40 из них ассоциированы с АЗ более чем в пяти независимых исследованиях (Dvila et al., 2009; Holloway et al., 2010; Meng et al., 2010; Michel et al., 2010; Boguniewicz et al., 2011; March, 2011). Среди них гены цитокинов (IL4, IL4RА, IL12B, IL13, TNFA, CCL5), главного комплекса гистосовместимости (HLA-DRB1), 2-адренорецепторов (ADRB2), ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTP1 и GSTT1); гены, белковые продукты которых участвуют в распознавании консервативных структур микроорганизмов (CD14, TLR2, TLR4, CD14, CARD15), в регуляции барьерной функции эпителия (FLG, SPINK5), позиционно-клонированные гены (ADAM33, DPP10, GPR154), гены ORMDL3 и GSDMB, обнаруженные при GWAS.
В России несколькими группами исследователей проводилось изучение полиморфных вариантов генов цитокинов и генов системы биотрансформации у больных АЗ (Иващенко и др., 2000-2002; Ляхович и др., 2002; Макарова и др., 2002, 2011; Фрейдин и др., 2002, 2003, 2007, 2010; Казначеев, 2005; Келембет и др., 2008; Полоников и др., 2006; 2009; Тюменцева, 2011). Проведен GWAS АЗ у русских жителей Западной Сибири: выявлены новые гены-кандидаты детской БА, АЗ, АР и атопической сенсибилизации (YWHAB, PPP1R12B, KCNE4, BAT1, MAGI2, ACPL2) (Фрейдин и др., 2011).
Несмотря на многочисленность генетических исследований АЗ, полученные результаты противоречивы, плохо воспроизводятся в последующих работах и характеризуются наличием выраженных межэтнических различий. Широкая вариабельность клинических проявлений АЗ свидетельствует о необходимости изучения как общих генетических факторов риска развития АЗ, так и специфических факторов, предрасполагающих к определенным клинико-патогенетическим вариантам течения АЗ. В связи с этим актуальной является идентификация этноспецифических факторов риска развития АЗ – БА, АР, АД и их сочетанного проявления, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболеваний и разрабатывать профилактические мероприятия с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.
На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.
Цель исследования
Комплексный анализ генетической предрасположенности к развитию трех распространенных аллергических заболеваний - бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита.
Задачи исследования
-
Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов-кандидатов аллергических заболеваний - цитокинов (IL4, IL4RA, IL10, IL13, CCL11, TNFA), дизинтегрина и металлопротеазы 33 (ADAM33), ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2) у больных аллергическими заболеваниями и в контрольной группе индивидов.
-
Провести анализ частоты встречаемости мутаций гена профилаггрина (FLG) у больных аллергическими заболеваниями и в контрольной группе индивидов.
-
Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов и мутаций генов с предрасположенностью к различным клинико-патогенетическим вариантам течения аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов.
-
Провести полногеномный анализ ассоциации 610000 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием бронхиальной астмы с учетом этнической принадлежности индивидов и тяжести течения заболевания.
-
Провести исследование ассоциированных с бронхиальной астмой по данным полногеномного анализа полиморфных локусов на расширенных выборках больных бронхиальной астмой, аллергическим ринитом и атопическим дерматитом.
-
Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию различных клинико-патогенетических вариантов течения аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов.
-
Идентифицировать маркеры повышенного риска развития бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита и сочетанных форм аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Научная новизна
Впервые молекулярно-генетическое исследование аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности проведено с использованием двух основных подходов, применяемых в настоящее время для поиска генов предрасположенности к многофакторным заболеваниям – исследования генов-кандидатов и полногеномного анализа ассоциаций. Проведен анализ ассоциации полиморфных вариантов 6 генов цитокинов (IL4, IL13, IL4RA, IL10, TNFA, CCL11), 7 генов системы ферментов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2) и гена ADAM33 с развитием БА, АР, АД и сочетанных форм аллергопатологии у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Выявлены маркеры риска развития различных клинико-патогенетических вариантов аллергических заболеваний. Установлена роль мутаций гена профилаггрина в развитии атопического дерматита и других АЗ на фоне АД.
Впервые проведен полногеномный анализ ассоциации 610 000 однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием БА у индивидов русской, татарской и башкирской этической принадлежности. Идентифицированы полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21 и ассоциированные с развитием БА с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7). Обнаружена выраженная ассоциация БА с полиморфными локусами, локализованными в областях 9р13 и 7р12.3. Выявлены этноспецифические маркеры риска развития бронхиальной астмы у русских, татар и башкир.
Определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена профилаггрина, гена ADAM33 и гена гасдермина В, предрасполагающих к развитию различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Научно-практическая значимость работы
Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к аллергическим заболеваниям - бронхиальной астме, атопическому дерматиту и аллергическому риниту. На основании результатов данной работы разработан «Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы». Патент на изобретение № 2324937. Приоретет изобретения 27.11.2006. Зарегистрирован 20 мая 2008 г. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития АЗ и разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту
-
Развитие аллергических заболеваний у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов IL4 и ADAM33, у татар - c полиморфными вариантами генов NAT2, IL13 и TNFA, у башкир - с полиморфными вариантами генов CCL11 и ADAM33. Маркерами повышенного риска тяжелого течения бронхиальной астмы у русских являются генотип А/А полиморфного локуса rs44707 гена ADAM33, у татар – генотип T/T rs1799929 гена NAT2, у башкир - генотип A/A rs1800629 гена TNFA.
-
Развитие атопического дерматита, бронхиальной астмы и аллергического ринита с сопутствующим атопическим дерматитом в объединенной выборке больных и во всех этнических группах ассоциировано с носительством мутации c.2282del4 в гене профилаггрина FLG. Полиморфный локус rs1800629 гена TNFA ассоциирован с развитием аллергических заболеваний в целом, бронхиальной астмы, аллергического ринита и их сочетанного проявления в объединенной выборке больных.
-
Полиморфные локусы, локализованные в области 17q12-q21, ассоциированы с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7) с бронхиальной астмой и тяжестью ее течения. Наиболее высокий уровень ассоциации БА установлен с полиморфным локусом rs7216389 в гене гасдермина В GSDMB (p=1,01x10-7). Полиморфные локусы, локализованные в областях 9р13 в гене бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1 и 7р12.3 в гене IGFBP3, кодирующем белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста, ассоциированы с развитием и тяжестью течения бронхиальной астмы.
-
Этноспецифическими маркерами риска развития бронхиальной астмы, идентифицированными при полногеномном анализе ассоциации у русских, являются полиморфные варианты гена муцина 19 MUC19 (12q12); у татар – полиморфные локусы, расположенные в области 15q26.3, у башкир - полиморфные варианты гена субъединицы AMPA – ионотропного рецептора глутамата GRIA1 (5q33).
-
Полиморфные локусы гена GSDMB (rs2305480, rs2290400, rs7216389) ассоциированы с развитием собственно бронхиальной астмы и БА с сопутствующими аллергическим ринитом и атопическим дерматитом. Исследованные ДНК-локусы гена GSDMB не ассоциированы с развитием атопического дерматита и аллергического ринита, не сопровождаемых развитием бронхиальной астмы.
-
Межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов GSDMB и IL4 детерминирует развитие бронхиальной астмы и аллергических заболеваний в целом в объединенной выборке больных. Специфические комбинации полиморфных вариантов исследованных генов ассоциированы с развитием различных аллергических заболеваний у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.
Апробация работы
Основные положения диссертации были представлены на российских и международных конференциях: XVII Всемирном конгрессе по астме (Санкт-Петербург, 2003), V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; Ростов-на-Дону, 2010), 14-м, 16-м и 21-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2004; Санкт-Петербург, 2006; Уфа, 2011), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), I и II школах-семинарах «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007; 2011), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), Санкт-Петербургском научном форуме «Наука и общество. Физиология и медицина XXI века» (Санкт-Петербург, 2011), конференциях Европейского общества генетики человека (Мюнхен, 2004; Прага, 2005; Ницца, 2007; Барселона, 2008; Вена, 2009; Гетебург, 2010; Амстердам, 2011), 7-ом Балканском конгрессе по генетике человека (Скопье, 2006), конгрессах Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Гетебург, 2007; Барселона, 2008; Варшава, 2009; Стамбул, 2011), конгрессах Европейского респираторного общества (Мюнхен, 2006; Стокгольм, 2007; Берлин, 2008; Вена, 2009; Барселона, 2010; Амстердам, 2011), Международном конгрессе по геному человека (Дубай, 2011).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 58 работ, из них 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, из них 5 из международной базы цитирования, две главы в монографиях и один патент на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 458 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и 73 таблицами. Список литературы включает 725 источников.
Конкурсная поддержка исследования
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Европейской Комиссии в рамках проекта GABRIEL (контракт № LSHB-CT-2006-018996) и Минобрнауки России (госконтракт № 02.434.11.7115 от 18.08.2006, госконтракт №П601 от 18.05.2010).
