Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОКСИДАТИВНЫИ СТРЕСС. АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ 10
1.1. Свободные радикалы. Определение, классификация и механизмы образования 10
1.2. Физиологическое значение свободных радикалов 12
1.3. Патофизиологические эффекты свободных радикалов.Оксидативный стресс как типовой патологический процесс. Система антиоксидантной защиты организма 13
1.4. TNF- d и Си,гп-супероксиддисмутаза 17
1.5. Супероксиддисмутаза-структура, биохимия. Супероксиддисмутаза как антиоксидант 20
1.6. Возможности терапевтического применения препаратов супероксиддисмутазы 25
1.7. Принципы получения рекомбинантных препаратов 27
1.8. Принципы промышленного культивирования 30
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Лабораторный метод очистки рекомбинантной супроксиддисмутазы ... 32
2.1.1. Метод получения белкового дезинтеграта 32
2.1.2. Метод ионообменной хроматографии 32
2.1.3. Диализ (обессоливание) 33
2.1.4. Метод гель-хроматографии 33
2.1.5. Определение белка по методу Лоури 34
2.1.6. Количественный метод определения активности супроксиддисмутазы 34
2.2. Подготовка материала для проведения модельных опытов и исследований групп пациентов 36
2.3. Оценка параметров свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы 37
2.3.1. Определение конечных продуктов ПОЛ (ТБК-АП) 37
2.3.2. Определение окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах периферической крови человека 38
2.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы набором "Randox" в нейтрофилах и мононуклеарах 39
2.3.4. Определение активности каталазы 39
2.3.5. Определение окислительной деструкции белков 39
2.4. Методы оценки иммунного статуса 40
2.4.1. Индукция синтеза цитокинов. Определение фактора некроза опухоли - a (TNF - а) 40
2.4.2. ИФА метод определения TNF- а 40
2.5. Методы оценки биохимических параметров 41
2.5.1. Метод определения АЛТ 41
2.5.2. Метод определения общего билирубина 41
2.5.3. Метод определения ГГТП 41
2.5.4. Метод определения щелочной фосфатазы 42
2.5.5. Метод определения холинэстеразы 42
2.6. Характеристика обследованных больных 42
2.7. Статистические методы 43
2.8. Характеристика используемых реактивов и оборудования 43
ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
3.1. Действие препарата рексод в модельных системах на окислительную деструкцию белков 47
3.2. Модифицирование метода определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров
периферической крови 49
4
3.3. Действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro 54
3.4. Изучение влияния экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли а (TNF-а), фактора воспаления обладающего цитотоксичностью в отношении клеток мишеней, в системах с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы 56
3.5. Оценка клинико-лабораторных параметров у больных с острым гепатитом В до и после лечения препаратом Рексод 59
3.6. Влияние препарата рексод на параметры свободнорадикального статуса и антиоксидантной защиты у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия или сенильная неэксуда-
тивная хориоретинальная дистрофия) 71
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 75
ВЫВОДЫ 78
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 79
- Свободные радикалы. Определение, классификация и механизмы образования
- Лабораторный метод очистки рекомбинантной супроксиддисмутазы
- Действие препарата рексод в модельных системах на окислительную деструкцию белков
Введение к работе
Как известно, при всех патологических процессах, происходящих в организме человека на клеточном уровне, возникают процессы альтерации с последующей репарацией. В связи с этим, в терапии заболеваний различной природы, большое значение имеют препараты, способствующие защите и репарации клеток (Коган А.Х., 1999; Das U.N., 2000; Guerra Е. I., 2001).
Среди подобных соединений особое внимание привлекают антиоксиданты, способные контролировать и модулировать окислительные процессы в клетке.
Ключевым ферментом антиоксидантной защиты организма является супероксиддисмутаза (СОД). Данный фермент осуществляет дисмутацию супероксидного радикала (О'г)- продукта одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, который образуется практически во всех клетках организма, контактирующих с кислородом и играет ведущую роль в процессах токсичности активных форм кислорода (АФК). 0'2 действует на все компоненты клеток (белки, липиды, нуклеиновые кислоты), на компоненты соединительных тканей (гиалуроновая кислота), а также является предшественником более токсичного гидроксильного радикала (*ОН).
Каталитический характер инактивации супероксидного радикала определяет преимущество СОД по сравнению с антиоксидантами неферментативной природы. К настоящему времени существует хорошо обоснованная стратегия применения препаратов СОД при самых различных заболеваниях, где патогенетическую роль выполняют активированные фагоциты, а также отмечаются нарушения, связанные с накоплением активных форм кислорода (Трубников Г.А. и соавт.,1998; Скальный А.В. и соавт.,2000; Чурилова И.В. и соавт., 2002; Davis J.M. et. al.,2000).
Наиболее перспективными для широкого клинического применения являются препараты гомологичных белков, а именно, препараты на основе СОД человека (Черепак Л. Н. и соавт., 1998; Davis J.M., et al., 2000). Одним из них, является Рексод - новый отечественный ферментный лекарственный препарат, обладающий антиоксидантным, антицитолитическим и противовоспалительным действием. Основным действующим веществом Рексода является рекомбинантная супероксиддисмутаза (СОД) человека, выделенная из биомассы рекомбинантного
7 штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae. Доклинические исследования препарата Рексод показали, что он является нетоксичным при однократном (остром) пероральном, а также внутривенном и внутримышечном введении. Опыт применения зарубежными исследователями препаратов СОД человека показал, что экзогенная супероксиддисмутаза обладает широким терапевтическим действием (Yune T.Y.et al., 2004; Akbulut G. et al., 2005; Kamata H et al., 2005).
В связи с выше сказанным, можно сказать, что использование экзогенной супероксиддисмутазы, являющейся ключевым ферментом антиоксидантной системы, будет способствовать защите клеток макроорганизма от альтерации супероксидными радикалами и корректировать состояние оксидативного стресса.
Цель исследования:
Охарактеризовать воздействие экзогенной супероксиддисмутазы, выделенной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, на процессы свободнорадикального окисления in vitro и оценить влияние препарата Рексод на клинико-лабораторные показатели при острых и хронических патологических процессах in vivo.
Задачи исследования 1. Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах.
Модифицировать метод определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови.
Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro
Изучить влияние экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли -а (TNF-а) в системах in vitro с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы.
Охарактеризовать показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса, биохимические и иммунологические параметры у больных с острым гепатитом В до и после лечения препаратом Рексод.
Изучить показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия) до и после лечения препаратом Рексод.
8 Научная новизна.
В результате проведенного научного исследования получены новые данные о механизмах протективного действия экзогенной супероксиддисмутазы на процессы свободно-радикального окисления и оценены механизмы подавления продукции TNF- а, фактора цитотоксичности, непосредственно и необратимо инициирующего апоптоз клеток мишеней по TNF- а - TNF- R пути in vitro. Показано положительное влияние препарата "Рексод", содержащего рекомбинантную Си^п-супероксиддисмутазу, на состояние «окислительного стресса», при остром и хроническом патологических процессах. Обоснован метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, который не только дополняет методы оценки антиоксидантной защиты у человека, а в некоторых случаях может быть более информативным клинико-лабораторным показателем.
Научно-практическая значимость работы.
Разработаны подходы к оценке антиоксидантного действия экзогенной супероксиддисмутазы в модельных системах. Спектр методов оценки антиоксидантной защиты расширен за счет разработки метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови.
Доказана эффективность применения препарата супероксиддисмутазы Рексод при остром (гепатит В) и хроническом (возрастная макулодистрофия) патологических процессах.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Опыты in vitro достоверно доказывают действие экзогенной супероксиддисмутазы на снижение окислительной деструкции белков в системе с постоянной генерацией Ог.
Метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови может быть использован, как дополнительный показатель при оценке антиоксидантного статуса организма.
В эксперименте при различной по длительности совместной инкубации in vitro образцов крови волонтеров с различными концентрациями
9 супероксиддисмутазы активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах достоверно не изменялась.
Инкубация крови в модельных системах различными концентрациями раствора супероксиддисмутазы приводит к достоверному снижению продукции фактора некроза опухоли а (TNF-а) мононуклеарами периферической крови и подтверждает, что одним из опосредованных механизмов действия фермента является снижение продукции TNF- а.
Применение препарата Рексод на фоне базисной терапии при остром патологическом процессе (гепатит В) оказывает положительное влияние на интенсивность процессов свободнорадикального окисления, что выражается в достоверном улучшении биохимических показателей.
При хроническом процессе (возрастная макулодистрофия) проявляется ингибирующее влияние препарата Рексод на интенсивность процессов свободнорадикального окисления и, прежде всего, на уровень окислительной модификации белка.
Апробация работы и публикации по материалам исследования Результаты работы были представлены на научной конф. «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию П.МАльбицкого (9-Ю октября 2003 года, Санкт-Петербург), и национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (26-30сентября 2005г, Смоленск). По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Свободные радикалы. Определение, классификация и механизмы образования
Свободный радикал-это молекула, атом или группа атомов, имеющих неспаренный электрон на внешней атомной орбитали. В настоящее время выделяют реактивные радикальные соединения, среди которых активными являются соединения кислорода, азота и хлора (Halliwell В., 2000). Активные формы кислорода (АФК) являются активными участниками большого числа химических реакций в клетках, оказывая разнообразное физиологическое действие. Присутствие неспаренного электрона наделяет радикал двумя отличительными свойствами: чрезвычайно высокой окислительной способностью и наличием магнитного момента. В настоящее время установлено, что ведущую роль в повреждающем действии кислорода в отношении молекулярных структур в организме выполняют именно его радикальные производные (Knight J.A., 1998; Янковский О.Ю., 2000).
Процессы метаболизма кислорода в организме связаны с образованием активных форм кислорода, обладающих выраженной реакционной способностью. «Активные формы кислорода» - это понятие собирательное, объединяющее такие соединения, как: супероксидные радикалы (02 ), перекись водорода (Н2О2), гидроксильные (свободные) радикалы ( ОН, Н02 ), синглетные формы кислорода (!02), ионы Н02-. Основные механизмы появления АФК в организме связаны обычно с нарушениями функционирования электроннотранспортных цепей митохондрий или микросом, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Особняком стоит нормальный процесс формирования АФК фагоцитами в ходе стимуляции неспецифической защиты организма (Морозов В.И.,1998). Синглетный кислород образуется в реакциях фотоокисления в присутствии так называемых фотосенсибилизаторов: флавинов, гематопорфирина, хлорофилла и др., а также при дисмутации супероксидных радикалов. Синглетный кислород агрессивен в отношении биосубстратов, в особенности в отношении молекул с двойной связью. Конечным итогом таких реакций обычно является образование гидроперекисей органических молекул, важнейших в процессах перекисного окисления ненасыщенных липидов в биомембранах (Балаболкин М.И. с соавт., 2000). В присутствии металлов переменной валентности эти продукты запускают цепные реакции окислительной деградации биомолекул (Владимиров Ю.А., 2000; Дубинина Е.Е., 2001).
Во всех аэробных клетках в процессе присоединения одного электрона к молекуле кислорода образуются супероксидный анион-радикал - Ог" и его протонированная форма - гидроперекисный радикал - Н02 . Оба радикала способствуют возникновению ряда других активных форм кислорода (Maytin М. et al., 1999). Образование этих АФК наиболее существенно вблизи цепей переноса электронов - дыхательной цепи, микросом и в растительных клетках хлоропластов. Эти АФК играют также важную роль в защитных - неспецифических иммунных механизмах организма: они образуются в ходе активации при инфекционных и иных воспалительных процессах фагоцитирующими клетками - нейтрофилами, макрофагами, моноцитами, эозинофилами (Скальный А.В. и соавт., 2000). Супероксидный радикал может прямо инактивировать адреналин, аскорбиновую кислоту, а более активный гидроперекисный радикал - реагирует с линолевой, линоленовой, арахидоновой кислотами, окисляя их до гидроперекисей. Образованию гидроперекисного радикала способствует закисление среды, он также свободно проникает через биомембраны, так как не несет заряда.
Главные типы повреждений биомолекул ОН: отрыв атома водорода (таким образом повреждается лецитин - главный компонент биологических мембран, а также сахара в составе нуклеозидов ДНК); присоединение к молекулам по двойным связям (взаимодействие с пуринами и пиримидинами ДНК и РНК, в том числе, с образованием вторичных радикалов). Перенос электронов также является повреждающим механизмом действия ОН (Владимиров Ю.А., 2000).
Лабораторный метод очистки рекомбинантной супроксиддисмутазы
Баллистический дезинтегратор готовили к операции дезинтеграции в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Замороженную биомассу клеток дрожжей в количестве 1500 г загружали в емкость из нержавеющей стали с механической мешалкой вместимостью 6 л, приливали к ней 3,3л 2мМ водного раствора CUSO4 х 5Н20 и выдерживали в течение 1 часа до полного растаивания биомассы. Затем включали электродвигатель мешалки и перемешивали биомассу в течение 30 минут до получения однородной суспензии. Далее осуществляли дезинтеграцию суспензии в соответствии с инструкцией по эксплуатации дезинтегратора. Полученный дезинтеграт подкисляли 2М НС1 до значения рН 4,2. Подкисленный дезинтеграт разливали в центрифужные стаканы и центрифугировали при 10000 об/мин на центрифуге фирмы „Бэкман" в течение 30 - 40 минут. Супернатант с центрифужных стаканов сливали в емкость. Полученный белковый дезинтеграт далее подвергался хроматографической очистке ("Дезинтегратор для микроорганизмов" ГосНИИ особо чистых биопрепаратов).
2.1.2 Метод ионообменной хроматографии.
В лабораторной методике получения СОД разделение белкового дезинтеграта проводилось с помощью двухступенчатой хроматографии на сорбентах Солозе и SP - целлюлозе.
Колонки с катионитами Солоза (470x300) и SP - целлюлоза (100x230) предварительно промывали и уравновешивали стартовым фосфатным буфером (ОДМ однозамещенный фосфат натрия, рН 4,2). Белковый дезинтеграт наносили на сорбент Солоза, после стока буферного раствора с колонки. Элюат сорбции собирали. Колонку промывали стартовым буфером (приблизительно 5 - ти кратным объемом). Десорбцию с колонки проводили тем же буферным раствором при рН 5,3- Элюат десорбции использовали на следующем этапе хроматографической очистки. Продолжительность стадии 4 - 5 часов. Элюат десорбции с катионита Солоза подкисляли до значения рН 4,0 и наносили на подготовленную колонку с катионитом SP - целлюлоза. Процесс сорбции и последующая промывка колонки осуществляли 0,1М буферным раствором однозамещенного фосфата натрия, рН 9,3. Элюат десорбции поступал на следующую стадию для обессоливания. Очистка на SP - целлюлозе занимала около 24 часов.
Процесс диализа элюата десорбции проводили против воды в диализных мешках (Serva, Германия) в течение 12 часов при температуре 4С в холодильнике.
Метод гель - хроматографии
Для исследования использовали гель АСА 44 (LKB, Швеция), который по своей химической природе представляет собой смесь акриламида и агарозы в соотношении 4:4 и обладает низкой специфической сорбцией. Он имеет диапазон фракционирования от 10000 до 130000 Да. Молекулярная масса СОД (39000 Да) находится примерно в середине разделяемого интервала. Коммерческий гель АСА 44 (V = 60 мл) заливали рабочим буфером и „отмучивали" от мелких частиц декантацией. Затем дегазировали на водоструйном насосе и осторожно заполняли аналитическую колонку (0,9x60). Колонку уравновешивали рабочим буфером в течение суток. В качестве рабочего буфера использовали 0,1М натрий фосфатный буфер с 0,05М хлоридом натрия и 0,04М азидом натрия. Для приготовления буфера 69,8г однозамещенного фосфата натрия, 57,8г двузамещенного фосфата натрия, 14,0г хлорида натрия и 1,0г азида натрия растворяли в 5л дистиллированной воды. Раствор перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр.
Перед работой гель калибровали, чтобы установить диапазон фракционирования. Для калибровки применяли наборы глобулярных белков (LKB, Швеция) с разными молекулярными массами (от 200 до 440000 Да) и размерами (диаметр от 7,4 до136,0 А). Калибрование проводили сначала индивидуальными белками - маркерами (С = 1мг/мл), а затем их смесью (С = 0,6 мг/мл), чтобы приблизиться к реальным смесям. Калибровочная смесь состояла из триптофана (204 Да), бацитрацина (1459 Да), цитохрома С (12500 Да), химотрипсиногена (25000 Да), яичного альбумина (45000 Да), бычьего сывороточного альбумина (6700 Да), у - глобулина (160000 Да).
Действие препарата рексод в модельных системах на окислительную деструкцию белков
Белки оказались наиболее чувствительными к свободнорадикалыюму окислению по сравнению с другими биомолекулами и, их окисление является наиболее ранним показателем усиления продукции АФК. Влияние свободных радикалов на белки разного типа приводит к сложным модификациям в структуре белковой молекулы и, соответственно, к изменению ее физико-химических и биологических свойств. В зависимости от интенсивности генерации АФК степень окисления может быть различной: от единичных повреждений аминокислотных остатков до агрегации и фрагментации белковых молекул (Berlett B.S., Stadman E.R., 1997). Следствием этого может стать нарушение в структуре активных центров ферментов, центров связывания белков-переносчиков, изменение антигенных свойств белков. Пути и конечные продукты окислительной модификации белков крайне сложны и многообразны, однако существует ряд характерных химических форм, которые образуются в большинстве случаев. К таким продуктам окисления относятся карбонилпроизводные белков (Зыбина Н.Н. и соавт., 2004; Зыбина Н.Н. и соавт., 2005). В связи с этим далее мы попытались выявить динамику образования карбонильных групп белков в опытах in vitro в зависимости от уровня продукции активных форм кислорода в системах с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы. И таким образом оценить действие СОД в модельных системах на окислительную деструкцию белков.
Окислительную модификацию белков проводили при инкубации растворов белка с системой, генерирующей АФК. В качестве такой системы была взята система ксантиноксидаза-ксантин.
В результате инкубации в системе вырабатывается супероксидный радикал 02 . Концентрации составляющих были взяты согласно прописи, предложенной Коно и Фридовичем (Kono, Fridovich, 1982): 5,86 U/л ксантиноксидазы и 100 мкмоль/л ксантина. Раствор белка готовили в концентрации 70 мг/мл.
К 0,45 мл раствора белка добавляли 0,05 мл инкубационной среды, содержащей ксантин-ксантиноксидазную систему. Инкубацию проводили в термостате при температуре 37С. Время инкубации 30 и 60 минут.
Параллельно ставились пробы, где к инкубационной среде с белком добавляли супреоксиддисмутазу. Доза фермента для обработки in vitro рассчитывалась, исходя из доз, назначаемых в клинической практике при внутривенном введении препарата Рексод.
В каждой серии экспериментов обязательно имелась контрольная проба, где в качестве инкубационной среды использовалась вода.
В эксперименте использовали метод, модифицированный Дубининой Е.Е. для сывороточных белков (1993). Ставились две пробы: опытная и контрольная. В опытной пробе к 0,05 мл раствора белка добавляли 1 мл 20% ТХУ и 1 мл 2,4-ДНФГ. В контрольную пробу — 1 мл 20% ТХУ и 1 мл 2М НС1. Пробы с осажденным белком инкубировали 1 час при комнатной температуре, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Осадок промывали три раза смесью этанол-этилацетат (1:1) по 1 мл до того момента, когда надосадочная жидкость станет бесцветной. Затем осадок подсушивали на кипящей водяной бане и растворяли в 2,5 мл 8М мочевины, добавляя одну каплю 2М НС1.
Похожие диссертации на Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях человека
