Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Мониторинг токсинообразующих грибов
1.1.1. Вредоносность микотоксинов 14
1.1.2. Опасность микотоксикозов для животных и человека 16
1. 2 . Использование биологических объектов для определения токсичности 18
1.2.1. «Биотестер-2» при определении токсичности 22
1.2.2. Определение токсичности зерна и продуктов его переработки методом биотестирования 2 4
1.3. Снижение токсичности зерна и продуктов его переработки 27
1.3.1. Методы химической защиты зерна от загрязнения микотоксинами 2 8
1.3.2. Использование физических методов защиты растений для получения экологически чистой продукции 31
1.3.3 Биотехнологические препараты на основе нетоксичных антагонистов 33
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 37
2.1. Исследуемое зерно и методы его изучения -
2.1.1. Биологический метод для выявления внешней и внутренней зараженнности зерна болезнями 38
2.1.2. Методика получения экстракта из зерна озимой пшеницы для проведения биотестирования 38
2.1. 3. Методика пробоподготовки для определения уровня токсичности плесневых грибов 4 0
2.1.4. Методика определения общей токсичности на приборе «Биотестер-2» 4 0
2.1.5. Методика обработки зерна озимой пшеницы электромагнитными полями 42
2.1.6. Методика обработки зерна озимой пшеницы биологическими и химическими препаратами 4 3
2.1.7. Методика приготовления биопрепарата
«Биофит-1» 44
2 . 2 . Установки и приборы, используемые в экспериментах 45
2.2 .1. Установка для обработки биологических объектов электрическим полем отрицательного коронного разряда 4 5
2 .2 . 2 . Установка для обработки биологических
объектов переменным магнитным полем ... 4 8
2 . 2 . 3 . Измеритель токсичности концентратомер «Биотестер-2» 4 9
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52
3.1 Токсичность зерна озимой пшеницы с Александровского, Дивенского и Ипатовского элеваторов 52
3.2 Результаты токсикологического анализа зерна озимой пшеницы, доминирующих грибов и препа ратов используемых для обработки (токсиколо гический мониторинг) 7 0
3.2.1. Токсиногенность зерна озимой пшеницы с Александровского, Дивенского и Ипатов
ского элеваторов 7 0
3.3 Изучение возможности снижения различными методами токсичности зерна озимой пшеницы, пораженного микотоксинами 7 7
3.3.1.Использование методов химической за щиты
3.3.2. Снижение токсичности зерна пораженного микотоксинами с применением физических факторов 88
3.3.3. Защита зерна с помощью биологических методов 94
3.4 Результаты производственных испытаний 99
3.5 Влияние количественного состава микофлоры на технологические качества теста 102
4. Экономическая эффективность мероприятий предлагаемых в исследованиях 104
ВЫВОДЫ 109
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 11X
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Х12
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Мониторинг токсинообразующих грибов
- Исследуемое зерно и методы его изучения -
- Токсичность зерна озимой пшеницы с Александровского, Дивенского и Ипатовского элеваторов
Введение к работе
Актуальность темы: Последнее десятилетие ознаменовано значительной интенсификацией исследований во всех развитых странах мира вопроса микотоксинов - токсических веществ, вырабатывающихся в процессе жизнедеятельности патогенных грибов. Экономические трудности последних лет привели многие хозяйства к снижению нормы, а иногда и к полному исключению необходимых фунгицидов для предпосевной обработки семян озимой пшеницы, что обуславливало закономерный рост обсемененности зерна озимой пшеницы спорами патогенных грибов, как при выращивании, так и при дальнейшем его хранении. Токсиноген-ность плесневых грибов приводит к снижению урожайности на 40-50%, резкому ухудшению потребительских качеств зерна злаковых культур, их биологической полноценности и безопасности.
Микотоксины, контаминирующие пищевые продукты, зерно и корма, могут быть причиной тяжелых пищевых и кормовых токсикоинфекции теплокровных организмов. В этой связи очень важно разработать быстрые, чувствительные и воспроизводимые методы анализа для обнаружения присутствия микотоксинов.
Одним из современных способов определения общей токсичности является биотестирование, основанное на поведенческой реакции тест-организмов, в том числе инфузории Paramecium caudatum.
В последнее время в России применяют новый прибор отечественного производства «Биотестер-2», позволяющий в течение часа определить общую токсичность объекта ис-
следований и осуществить компьютерную обработку результатов исследований.
Широкое распространение в посевах сельскохозяйственных культур токсинообразующих грибов вызывает необходимость использования химических и других средств защиты.
Эвтрофирование и применение химических соединений, в том числе и фунгицидов, приводят к необратимой деградации почв, почвенного покрова, загрязнению водных объектов, ухудшению общей экологической обстановки, и, как следствию - к гибели многих представителей растительного и животного мира. Тем не менее, технология производства растениеводческой продукции требует вносить на поля существенные количества химикатов. Имеющиеся в настоящее время способы обеззараживания зерна высокоэнергоемки и недостаточно эффективны. В связи с этим научный и практический интерес представляет применение новых эффективных методов защиты растений при условии их экологической безопасности. Использование новых, более совершенных, экологически безопасных методов воздействия на токсинообразующие грибы, контаминирующие зерно, совершенствование методов определения токсичности, позволяют своевременно снизить общую токсичность, сохранить продукцию, предотвратить пищевые и кормовые отравления .
Цель работы
Изучение и разработка методов исследования общей токсичности зерна, продуктов его переработки, различных
кормов, контаминированных плесневыми грибами и методов снижения их вредоносности.
В связи с этим, перед нами были поставлены и решены следующие задачи:
Провести мониторинг плесневых грибов в различных эколого-климатических зонах края и установить зависимость между агрометеорологическими факторами и их токсичностью.
Исследовать токсичность плесневых грибов, конта-минирующих зерно, при помощи биотестирования.
Определить особенности развития микофлоры зерна при его хранении.
Экспериментально изучить влияние обработки электромагнитными полями; методов химической и биологической защиты зерна, зараженного плесневыми грибами и кормов на состав микофлоры и общую токсичность .
Исследовать влияние плесневых грибов на технологические качества зерна.
Определить экономическую эффективность метода определения токсичности зерна и кормов с использованием экспресс биотеста, и наиболее эффективного метода снижения токсичности.
Диссертационная работа выполнена в Ставропольском государственном аграрном университете, в аккредитованной учебно-научной испытательной лаборатории (УНИЛ). По теме диссертации, по заказу МСХ Ставропольского края выполнялась хоздоговорная тема №32/19 «Определение ток-синообразующих грибов на зерне злаков в Ставропольском
крае и разработка методов обеззараживания» в 2000-2003 гг.
Научная новизна работы состоит в следующем:
впервые проведен мониторинг плесневых грибов в различных эколого-климатических зонах края, установлена высокая степень токсичности микофлоры засушливых и крайне засушливых зон края.
Впервые применено биотестирование для определения токсичности плесневых грибов, контаминирующих зерно, автоматизированным методом с использованием в качестве тест-объекта инфузорий Paramecium caudatum.
Впервые установлена зависимость между агрометеорологическими факторами и токсичностью полевых плесневых грибов, контаминирующих зерно.
Научной новизне отвечает экспериментальное изучение влияния электромагнитных полей; неопробированных химических и биологических препаратов на плесневые грибы, обуславливающие токсичность зерна и кормов.
Впервые определена экономическая и биоэнергетическая эффективность метода определения токсичности зерна и кормов с использованием экспресс - биотеста, применения Мико Карба и Биофит-1 как наиболее эффективных методов снижения токсичности.
Положения, выносимые на защиту:
1. Микофлора, контаминирующая зерно озимой пшеницы, произрастающей в различных эколого-климатических зонах края, от агрометеорологических условий выращивания.
Токсичность различных родов грибов зависит от агрометеорологических факторов.
При хранении зерна озимой пшеницы изменяется состав микофлоры, контаминирующеи зерно озимой пшеницы и его токсичность.
Обработка полем отрицательного коронного разряда, как угнетает, так и стимулирует рост и развитие плесневых грибов, контаминирующих зерно озимой пшеницы, в зависимости от экспозиции.
Воздействие переменного магнитного поля стимулирует рост плесневых грибов.
Применение Мико Карба, Сал Карба, Молд Карба подавляет рост плесневых грибов и снижает их токсичность.
Обработка зерна, контаминированного плесневыми грибами, Бактофитом, Биофитом-1, грибом - антагонистом Fusarium sambucinum, способствует угнетению роста грибов и снижению общей токсичности.
Практическая ценность полученных результатов.
Мониторинг патогенной микофлоры, сведения о ее составе, токсичности грибов, позволяют учитывать особенности хранения и использования фуражного зерна озимой пшеницы в различных эколого-климатических зонах. Использование прибора «Биотестер-2» способствует предотвращению массовых кормовых отравлений зерном озимой пшеницы и кормами, зараженными патогенными грибами. Биотестирование дает возможность определить общую токсичность препаратов, используемых для обработки с целью уничтожения патогенной микофлоры, и их влияние на общую токсичность зерна. Результаты применения физических,
химических и биологических способов обработки пораженного зерна позволяют выбрать наиболее эффективный метод снижения зараженности и общей токсичности зерна озимой пшеницы.
Достоверность полученных результатов подтверждается: применением при проведении исследований стандартных приборов и оборудования; статистической обработкой результатов экспериментов методом Стьюдента.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на научных конференциях СГСХА в 2001, 2002. 2003 гг.: Международной научной конференции по проблемам экологии; Первой международной интернет-конференции по проблемам физиологии и экологии человека и животных; Первом Всероссийском Конгрессе по Медицинской Микологии; Международном Форуме молодых ученых; Третьей Международной Конференции «Состояние и охрана воздушного бассейна и водно-минеральных ресурсов курортно-рекреационных регионов»; Региональной Конференции по проблемам экологии.
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 научных публикациях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и предложений производству. Содержит 136 страниц, в том числе 22 таблиц в тексте диссертации и 11 в приложении, 14 рисунков, список литературы из 182 наименования и в том числе 64 на иностранном языке.
Мониторинг токсинообразующих грибов
По данным ФАО, около 30% мирового сбора зерновых и зернобобовых культур заражено токсиногенными грибами и загрязнено микотоксинами. Экономический ущерб, причиняемый микроскопическими грибами, только в результате потерь урожая в глобальном аспекте достигает 16 млрд. долларов США в год. Данные об ущербе, вызываемом отдельными микотоксинами подсчитать невозможно, хотя имеются сообщения о том, что в США в результате поражения афлатоксинами кукурузы убытки в отдельные годы составляют более 400 млн. долларов(Wood G.E., 1999).
Фузариоз колоса вызывают несколько видов Fusarium, нередко сопутствующих первому виду: Fusarium graminearum Schwabe, F. avenaceum, F. culmorum, F. herbarum (Corda) Fries.
Различают три основных типа заболевания: гибель всходов, отмирание продуктивных стеблей, поражение колоса и зерна.
Встречается гриб главным образом как паразит хлебных злаков на зерновках и вызывает заболевание, называемое «пьяным хлебом»; отмечен также и на других органах растений ржи, ячменя, овса и диких злаков (Абрамов И.Н., 1938) .
Зерна, пораженные Alternaria tenuis Nees ex Fries, при проращивании покрываются бархатистыми дерновинками (колониями) темного цвета. На зернах пшеницы гриб может вызывать поверхностное потемнение зародыша, проявляющееся в виде точечности.
На зернах пораженных Aspergillus glaucus Link во влажных условиях и на агаровой среде образуется зеленый налет, сходный с налетом гриба Penicillium и отличается от него строением конидиеносцев.
Вид Aspergillus glaucus в настоящее время упразднен и заменен целой серией особых видов, различаемых главным образом по сумчатому спороношению. Группа Aspergillus niger van Tiegh составляет значительное число видов.
На недезинфицированных зернах, помещенных во влажную камеру, а также при повышенной влажности часто появляется налет зелено-сизого цвета, характерный при поражении Penicillium glaucum Link, его мицелий бесцветный, с возрастом иногда темнеющий (Пересыпкин В.Ф., 1989) .
Наибольшую опасность представляют фузарии, пеницил-лы, аспергиллы и их токсины. Фузарии образуют более 190 микотоксинов, из которых наиболее важными считаются 10 токсинов. Однако, начиная с середины 80-х годов, быстро нарастает заражение зерна мукором, альтернарией. По сведениям, полученным в основных зерносеющих странах мира, фузаризом поражается до 50% посевов пшеницы и ячменя. Штаммы - суперпродуценты фузариотоксинов, составляют около 70% всех изолятов. В годы эпифитотий эта цифра может достигать 100%. Проведенные исследования частоты встречаемости штаммов - суперпродуцентов фуза-риотоксина (Fusarium graminearum) в агроценозах Северного Кавказа показали, что в начале 90-х годов их распределение достигало 100%, а к 1999 снизилось до 34, 8 -б .
Исследуемое зерно и методы его изучения
Зараженность зерна определяли при проращивании их во влажной камере по методике Н.А. Наумовой (1970) на питательной среде, приготовленной по ГОСТ 17206.
Для проведения фитопатологической экспертизы зерна отбирали образец в количестве 400 штук. Соблюдая стерильные условия, раскладывали зерна по 2 0 штук на питательную среду (КГА) в чашки Петри в 20-ти повторностях в стерильных условиях. По истечении срока прорастания 8 дней, при температуре 22С, в каждом варианте было подсчитано количество здоровых и заселённых грибами и бактериями зерна, после чего из образовавшихся вокруг исследуемых зерен колоний микромицетов были приготовлены микроскопические препараты, на основе морфологических характеристик которых было осуществлено определение обнаруженных грибов до рода или вида.
Методика получения экстракта из зерна озимой пшеницы для проведения биотестирования
Для определения общей токсичности использовался экстракт, из прорастающего зерна полученный по методике Г.Ф. Наумова (1973) адаптированной к нашим условиям.
Процесс получения экстракта из зерна включает ряд операций: 1) подготовку ложа; 2) подготовку зерна; 3) проращивание зерна; 4) получение экстракта.
Подготовка ложа. Для проращивания зерна использовались чашки Петри, дно которых покрывалось двумя слоями увлажненной фильтровальной бумаги (кружки диаметром 10-12 см) , сверху чашку накрывали сухим кружком фильтровальной бумаги диаметром 15 см.
Подготовка зерна. Для получения экстракта навески зерна по 2,5 г из каждого образца размещали в один слой на фильтровальной бумаге в двух чашках Петри, затем прикрывали еще одним слоем увлажненной фильтровальной бумаги. Чашки Петри ставили в ванночки с водой (25-30 мл) таким образом, чтобы загнутые края верхнего листа фильтровальной бумаги большего диаметра покрывали чашку.
Проращивание зерна. Чашки Петри помещались в термостат на трое суток при температуре 20С.
Получение экстракта. Для более полного экстрагирования проросшие зерна вместе с фильтровальной бумагой отжимали для получения из них влаги. При этом зерна не должны быть разрушены. Полученный экстракт сливали в стеклянную посуду. Так как в процессе проращивания часть воды поглощалась зернами и испарялась, необходимый для исследования объем экстракта доводили определенным количеством воды, которой ополаскивали чашки Петри. Общее количество экстракта из 2,5 г сухих зерна составляло около 5 мл. Полученный объем условно принимался за 100% концентрацию.
Исследуемое зерно и методы его изучения
Для установления объективной картины обсеменения микрофлорой зерна озимой пшеницы в Ставропольском крае, исследовали зерно, выращенное в четырех контрастных климатоэкологических зонах Ставропольского края: крайне засушливой (Дивенский элеватор) - I зона; засушливой (Ипатовский и Александровский элеватор) - II зона; неустойчивого увлажнения (Грачевский и Палагиадский элеваторы) - III зона; достаточного увлажнения (Незлобнен-ский КХП и Минераловодский элеватор) - IV зона.
В 2001-2003 гг. нами проверены на наличие микофлоры партии пищевого и фуражного зерна озимой пшеницы, хранившейся с августа по январь 2001-2002 гг., а также с августа по январь 2002-2003 гг., то есть в осенний и зимний периоды.
Из проведенного анализа литературных данных следует, что интенсивность распространения микотоксикоинфек-ций определяется тремя группами факторов: биотическими (влажность зерна, вирулентность, спорогенность, сортовые особенности растения-хозяина, внутривидовые и межвидовые взаимодействия; абиотическими (осадки, температура, влажность воздуха, рН почвы); технологическими (сроки посева, условия хранения с соавт.).
Данные о влиянии перечисленных факторов в условиях Ставропольского края на видовой состав грибов, динамику развития семенной микофлоры и угнетение роста микроми-цетов в период хранения зерна, в литературных источниках нами не обнаружены.
Оптимальные условия хранения зерна на элеваторе: температура, влажность, как правило, не выдерживаются. Появлению плесени способствует плохая вентиляция. Стены зданий элеваторов, как правило, имеют низкое теплосо-противление, поэтому отключение отопления или снижение температуры в помещении приводит к появлению конденсата, а за ним и плесени. Ее развитию способствуют повреждения в кровле, непромазанные швы панельных зданий, нарушенная гидроизоляция, непринятие мер после промерзания стен или протечек.
При закладке зерна при повышенной температуре или влажности появляются «горячие участки», что способствует развитию контаминации зерна микофлорои, накоплению микотоксинов и, вследствие этого потерю кормовых качеств .
