Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
2.1. Морфология вируса бешенства 11
2.2. Химический состав вируса бешенства 15
2.3. Очистка и концентрирование вируса бешенства 21
2.4. Диагностика бешенства 25
2.5. Выделение антивидовых иммуноглобулинов и получение конъюгатов с пероксидазой хрена для иммунофериментного анализа 29
2.5.1 Выделение имуноглобулинов 30
2.6. Анти-идиотипические (анти-ИД) антитела 31
2.7. Заклю чение 3 5
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
3.1. Материалы и методы 36
3.2. Результаты исследований 41
3.2.1. Очистка и концентрирование вируса бешенства 41
3.2.2.Биологические и физико-химических свойства очищенного и концентрированного культурного вируса бешенства 52
3.2.3. Выделение гликопротеина и нуклеопротеида вируса бешенства 58
3.2.4. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных препаратов кулътурального вируса бешенства 63
3.2.4.1. Серологические методы диагностики бешенства 63
3.2.4.2. Иммуноферментный анализ для определения уровня антирабических антител.
3.2.4.2.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови крупного рогатого скота 67
3.2.4.2.2. Получение анти-IgG-KPC из гипериммунной сыворотки и выделение из нее антивидовых иммуноглобулинов 69
3.2.4.2.3. Меченые антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG-KPC) ферментом пероксодазой 70
3.2.5.Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной антирабической вакциной 71
3.2.6. Поликлональные антиидиотипические антитела к вирусу бешенства. 74
3.2.7. Тест-система для индикации вируса бешенства и антирабических антител методом ИФА 82
3.2.7.1.Конъюгат с пероксидазой хрена (ПО) в титровании методом ИФА антирабических антител 83
3.2.7.2.Протеин A (Staphylococcus Aureus) в титровании методом ИФА антирабических антител 88
4. ОБСУЖДЕНИЕ 92
5. ВЫВОДЫ 106
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЕ 133
Введение к работе
1.1. Актуальность темы.
К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. Борьба с бешенством была и остается проблемой медицины и ветеринарии. Эту проблему значительно осложнило отмеченное в последние десятилетия возрастание роли диких животных в распространении болезни. По данным ВОЗ (Expert committee on rabies, 1992) в мире ежегодно регистрируют более 50 тысяч случаев гибели людей и более 1 миллиона животных от бешенства. Сложная эпидемическая и эпизоотологическая ситуации по бешенству в последние годы наблюдаются более чем в 110 странах мира (20, 21, 89).
По оперативным данным ФГУ «Центрветеринарии» (лаборатории эпизоотологии ВИЭВ) в течение первой половины 2005г. на охваченной эпизоотией территории РФ были выявлены 386 неблагополучных пунктов по бешенству. В Московской области были выявлены 6 эпизоотических очагов. Этот процесс в мире не имеет тенденции к затуханию, напротив, поражаются все новые, ранее благополучные районы (12, 21).
Вирус бешенства, несмотря на то, что методика получения антирабической вакцины была разработана Л.Пастером более 100 лет назад и с тех пор достигнуто многое в изучении этого заболевания, остается предметом изучения многих исследователей. В основном, это практические аспекты: изготовление и применение вакцин, разработка методов репродукции вируса бешенства в тканевых культурах и создание диагностикумов.
Вирус бешенства, репродуцированный в культуре ткани, используется в качестве исходного материала при изготовлении антирабических вакцин и диагностикумов. Вакцины и диагностикумы, изготавливаемые из культуральных вируссодержащих суспензий, содержат небольшое количество специфического антигена в сравнений с множеством сопутствующих балластных белков, так как при промышленном изготовлении обычно используют неочищенный вируссодержащий материал. Поэтому внимание исследователей привлекает разработка методов получения очищенного и концентрированного вируса. Такой препарат представляет собой материал для изготовления надежной и эффективной вакцины против бешенства, обладающей высокой иммуногенностью, и более чувствительных диагностикумов, не дающих побочных неспецифических реакций (24, 25,27,44).
Исследование структурных компонентов, нуклеопротеида и гемагглютинина, вируса бешенства представляет не только теоретический, но и практический интерес. В связи с этим важным представляется вопрос выделения и изучения их биологических свойств. На основании данных молекулярной структуры вируса бешенства установлено, что основным протективным белком является гликопротеин, содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин. Поэтому перспективным является разработка теста in vitro, основанного на определении содержания протективного антигена — гликопротеина, коррелирующего с иммуногенностью (51). Изучение этого вопроса может создать предпосылки для практического применения компонентов вируса в составе вакцин и диагностикумов, чистых и высокоэффективных.
Ускоренные методы вирусологической диагностики, такие как иммуноферментный анализ, обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами серологической диагностики. Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность является действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Быстрота и простота постановки этого теста делают его удобным для исследования динамики инфекции в очагах заболевания, а полученная информация может служить ориентиром для принятия соответствующих мер по предупреждению и распространению инфекции.
При организации целенаправленных профилактических мероприятий необходим контроль за иммунным состоянием вакцинированных против бешенства животных. Уровень антител в сыворотках животных определяется несколькими методами. Трудность выбора состоит в том, что большинство методов не всегда достаточно стандартизировано.
Таким образом, создание тест-системы для ускоренной индикации вируса и определения уровня антирабических антител в сыворотке иммунизированных культуральной антирабической вакциной животных является на сегодняшний день важной и актуальной задачей.
1.2. Цель и задачи исследования.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание реагентов на основе очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства для постановки серологических реакций, а также высокочувствительных и специфичных компонентов для иммуноферментного анализа при оценке эффективности поствакцинального иммунитета у животных, вакцинированных антирабической вакциной.
Решались следующие задачи:
1.2.1. Получить очищенные и концентрированные препараты вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51.
1.2.2. Выделить структурные компоненты вируса бешенства нуклеопротеид и гемагглютинин
1.2.3. Испытать антигены вируса бешенства, полученные на базе очищенных и концентрированных препаратов, в качестве компонентов для постановки серологических реакций при определении уровня антител в сыворотках вакцинированных животных.
1.2.4. Получить антирабические сыворотки на лабораторных животных, выделить IgG различных животных, получить анти-IgG сыворотки на кроликах и выделить анти-IgG из них, получить конъюгат пероксидазы из хрена с анти- IgG и сравнить его с протеином А.
1.2.5. Изучить напряженность гуморального иммунитета и антиидиотипические поликлональные антитела к вирусу бешенства на лабораторных животных.
1.2.6. Разработать тест-систему для иммуноферментного анализа, оценку эффективности поствакцинального иммунитета у животных при бешенстве и провести сравнительную оценку определения уровня антирабических антител в традиционных серологических реакциях и ИФА.
1,3, Научная новизна.
В процессе работы были модифицированы и усовершенствованы методы очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, ранее разработанные в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП. Выделены структурные компоненты вируса бешенства - гемагглютинин и . нуклеопротеид. Подтверждено, что гемагглютинин вызывает интенсивное образование вируснейтрализующих антител в крови иммунизированных животных и является компонентом, ответственным за иммуногенную активность вириона и может быть применен в качестве антигена при определении уровня вируснейтрализующих антител.
Показана возможность повышения чувствительности серологических реакций РДСК при применении концентрированного вируса ПЭГ М-3000, и РИГА, концентрированного на геле фосфата алюминия и ультрацентрифугированием.
Установлена корреляция между показаниями активности сывороток при постановке ИФА с добавлением коньюгата с пероксидазой и с протеином А. Изучен гуморальный иммунитет на уровне образования антирабических антител, относящихся к классам IgM и IgG и его подклассам.
Получены антиидиотипические антитела, содержащие внутренний образ антигена бешенства и способные индуцировать иммунный ответ у животных в отсутствии вирусного антигена.
1.4. Практическая значимость.
На основании модифицированных ранее разработанных во ВНИТИБП методов очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, созданы антигены для определения в серологических реакциях уровня антирабических антител в сыворотках животных в реакции связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, а также применяемые в качестве компонентов для иммуноферментного анализа и показавшие высокую эффективность в реакциях. Методической комиссией ВНИТИБП утверждены 4 методики по получению антигенов для серологических реакций.
Разработаны компоненты и создан набор для иммуноферментного анализа репродукции антирабических антител в сыворотке крови животных. НТД на набор утверждается в общепринятом порядке.
Морфология вируса бешенства
Впервые морфологию вируса бешенства при помощи электронной микроскопии негативно окрашенных неочищенных препаратов, полученных из инфицированных клеток почки хомяка, изучал в 1962г. Almeida J. и др. (99).
Кроме того, в том же году Matsumoto S.(185) исследовал морфологию вируса в нервных клетках мышей, инфицированных уличным вирусом бешенства. Вирус бешенства имеет форму пули с одним округлым и другим плоским концом (37,123,151,161). На плоском конце, не прикрытым наружной оболочкой, как правило, имеется выемка. Общая схема строения рабдовирусов представлена на рис. 1.
Длина и диаметр вирусной частицы имеют размеры 170-200x70-90 нм (224). Поверхность вириона имеет небольшие выступы, диаметр которых 4,5-5,5 нм, длина 6-7нм. Какой-либо регулярной структуры на его поверхности обнаружить чаще всего не удается. Однако Hummeler К. и др. (151) отмечает, что на некоторых негативно окрашенных препаратах вируса поверхность его кажется составленной из правильных шестиугольников. Полная вирусная частица на продольном срезе, как и все рабдовирусы, похожа на пулю, имеющую две мембраны различной плотности. Более плотная наружная мембрана не закрывает плоский конец, что хорошо заметно на продольном срезе. На плоском конце вириона имеется осевая полость, которая может иметь глубину до 1/2 общей длины вириона. По данным ряда исследователей плотность вириона 1,16-1,20г/см3, константа седиментации 600 S, молекулярная масса (ММ) 475x106 дальтон (Д) (13,176,237).
Внутри вириона находится спиральный нуклеокапсид (нуклеопротеид), состоящий из РІЖ и внутреннего белка. Нуклеопротеид (НП) вируса бешенства представляет собой спирально свернутую вправо лентообразную нить, построенную из белковых субъединиц, скрепленных рибонуклеиновой кислотой (153,212) (рис.2).
В нуклеопротеиде содержится 4% РНК к 96% белка. По данным Sokol F. (238,240) плавучая плотность его 1,32 г/см3, константа седиментации 200S, молекулярная масса 1,5x10 Д (13).
Нуклеопротеид вируса бешенства активен только в реакции связывания комплемента и не обладает гемагглютинирующей активностью (238). В реакции нейтрализации нуклеопротеид вызывает образование очень небольшого количества вируснейтрализущих антител (266). Защитной активностью препарат нуклеопротеида практически не обладает. Таким образом, нуклеопротеид вируса бешенства при введении в организм животного способен индуцировать образование антител, активных только в реакции связывания комплемента и иммунофлуоресценции (153,176).
РНК вируса бешенства имеет молекулярный вес 4,6x106Д и константу седиментации 45S (96,238). До сих пор никому еще не удалось выделить РНК вируса бешенства, которая была бы инфекционна, поэтому принято считать, что она неинфекционна.
ВирионЫ бешенства могут быть представлены короткой формой в виде колокольчиков. По своей структуре они во всем сходны с полным вирусом и. похожи на усеченные Т-частицы вируса везикулярного стоматита (134,148,149,210).
Некоторые исследователи (97,136,179,211,268) считают, что частицы пулеобразной формы являются результатом рассечения бациллярных частиц при приготовлении тонких срезов культуры клеток, инфицированных вирусом или полностью отпочковавшимися от клеточной мембраны частицами (рис. 3).
Интересное предположение о механизме образования коротких частиц, одновременно объясняющее и происхождение пулеобразной формы вирионов, высказал Lee Р. (171). Он считает, что в определенном, легко уязвимом месте, бациллярная вирусная частица размером 260x80 нм разрывается и в результате образуются два фрагмента длиной 170 и 90 нм которые идентифицируются как полные и укороченные вирусные частицы.
Химический состав вируса бешенства
Знание качества и количества компонентов вируса бешенства является необходимым условием понимания их взаимодействия, определяющего стабильность структуры вируса и его биологические свойства.
Элементарный химический состав вирусов в общих чертах не отличается от состава клеток животных, растений и микробов (82). В этом отношении у вирусов установлена только одна особенность: если у клеток животных, растений и микроорганизмов химический состав довольно постоянен, то у вирусов он вариабелен.
По химическому составу вирусы делят на две большие группы. Вирусы, содержащие белок, нуклеиновую кислоту и зольный остаток, относятся к простым и образуют группу так называемых минимальных вирусов (вирусы ящура, полиомиелита, реовирусы и др.). Вирусы, в состав которых входит белок, нуклеиновая кислота, зольный остаток, липиды и углеводы, составляют группу сложноустроенных (рабдовирусы, миксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и др.).
Вирус бешенства относится к группе сложноустроенных вирусов. Он содержит белок, РНК, липиды и углеводы (114). Общий химический состав штамма HEP Flury представляет собой следующее (в процентах сухого веса вируса): белка 67,0 ± 3,6%, РНК - 3,9 ± 0,6%, углеводов, связанных с белком, 2,9% липидов- 25,8 ± 1,5%, общая масса нерастворимого осадка 73,8 ± 3,6% (223).
В составе углеводов, связанных с белком, обнаружили (в процентах: сухого веса вируса): глюкозамин - 1,0%, галактозамин - 0,3%, гексозу - 0,7%, фукозу - 0,1%), сиаловую кислоту - 0,8%) (223).Высушенные препараты очищенного вируса содержат 5,5% нейтральных и 19,5% полярных липидов. Холестерол является мажорным нейтральным липидом. Фосфолипиды составляли 11,2%, а гликолипиды- 4,6% вирусной массы. Остальные 3,7% липидов идентифицировать не удалось.(124).
Гликолипиды оболочки вируса бешенства и клетки хозяина, как выяснилось, идентичны (223). Предполагают, что вирусные белки играют специфическую роль в избирательном включении липидов в процесс сборки вирусной частицы (135,163).
РНК вируса бешенства представлена единой нефрагментированной молекулой нуклеиновой кислоты (минус-нить), что и объясняет отсутствие биологической активности у РНК, выделенной из вируса бешенства, то есть такая РНК не способна инициировать инфекционный процесс и функционировать в качестве информационной РНК (31,96,186). Длина РНК вируса 460 нм, константа седиментации 45 S, плавучая плотность 1,66 г/см3, ММ=4,4-4,6х106 Д (96,107,150,237). Количественное соотношение нуклеотидов в РНК разных штаммов практически одинаково, в среднем в молекуле РНК содержится 25,5 - 26,3 (0,9%) адениловой кислоты, 28,1 - 29,7 (0,4%) уридиловой кислоты, 20,6 - 24,1 (1,2%) гуаниловой кислоты, 21,7 - 23,8 (1,5%) цитидиловой кислоты (Імоль на ЮОмоль нуклеотидов) (96,151,176,222,230,240,262). РНК вируса бешенства соединена с белками, которые позволяют ей свободно образовывать спиральные витки, то есть формировать структуру - комплекс, именуемый рибонуклеопротеидом (РНП), нуклеокапсидом (НК) или нуклеопротеидом (НП), составляющим 14% общей массы вириона (рис. 2).
Каждый виток спирали состоит из 12 белковых молекул размером 9 3 3 нм, что составляет примерно 1850 молекул белка на всю РНК. Субъединицы расположены радиально по отношению к длине рибонуклеопротеида, который представлен спиральной структурой, имеющей 34-35 витков, причем диаметр 4-5 витков уменьшен на закругленном пулевидном конце. Такая организация нуклеокапсида довольно нестабильна, так как даже длительное хранение вируса при +4 иногда вызывает разворачивание спирали нуклеокапсида в более рыхлую структуру (31).
Материалы и методы
Работа выполнена в 2002-2005 г.г. в лаборатории молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2000-2005г., в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой.
3.1.1.Вирус бешенства. В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штамм Щелково-51,репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Титр инфекционности вируссодержащего материала, использованного в работе, был 5,5-6,51gLD5o/.M.T Суспензию вирусного материала хранили при температуре -50С.
3.1.2. Концентрирование вирусов методом ультрафильтрации проводили на УФ ячейках ФМО2-200 и ФМО2-1000 с использованием ядерных фильтров, полученных из лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна).
3.1.3. -г центрифугирование в работе использовали, линейный градиент CsCI, сахарозы и глицерина. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL (Польша) по составленным калибровочным кривым.
3.1 А.Контрольные антигены получали в тех же условиях, что и вирус, но без добавления последнего (с п.3.1.1 по 3.1.3.)
3.1.5.Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5-недельных мышах массой 10-12г, заражая их интрацеребрально по 0,03мл препарата. Число павших от специфических причин мышей (паралич, судороги, гибель) учитывали с 6 по 1 Ідень заражения.
Титр инфекционности вирусов рассчитывали по методу Ашмарина И.П. и др.
3.1.6.Белок определяли по методу Лоури и др. (177) и на спектрометре СФ-26. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.
3.1.7.Комплементсвязывающую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Soulebot J и др.(245), с оценкой реакции по общепринятой крестовой системе. За титр комплементсвязывающей активности принимали высшее разведение антигена или сыворотки, вызывающее частичный гемолиз эритроцитов (на 2+).
3.1.8.Преципитирующую активность определяли по методу Ouchterlony L. в 1,0% агаре "Дифісо" (206).
За титр преципитирующей активности принимали высшее разведение антигена или сыворотки, дающее выраженную полосу преципитации.
3.І.Я.Гемагглютинирующую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Kuwer Е. (170) с эритроцитами гуся.
За титр гемагглютинирующей активности вируса бешенства принимали высшее разведение вируса, агглютинирующее эритроциты на 1+.
3.1.10. Титр вируснейтрализующих (ВН) антител в антирабических сыворотках определяли следующим образом: к двукратным разведениям сыворотки приливали равный объем определенного разведения вируса (для мышей количество вируса соответствовало 100LD50/W). Затем инкубировали 1ч при +37С и заражали этими разведением интрацеребрально мышей весом 10-12г. В качестве контроля брали десятикратные разведения вируса СVS, также прогретого 1ч при +37С. За титр ВН-антител принимали последнее разведение сывороток, предохраняют) 50% животных.
3.1.11 .Гемагглютинин вируса бешенства выделяли по методу Schneider L. и др. (189) из очищенного и концентрированного препарата. Для этого вирусную суспензию после высокоскоростного центрифугирования обрабатывали 5% сапонином, добавляя его до конечной концентрации 1мг/мл, и инкубировали 20мин при +37С. Затем проводили очистку концентрирование гемагглютинина при помощи равновесного центрифугирования на "подушке" хлористого цезия плотностью 1,29г/см , в течение 4,5ч при ЗООООоб/мин (90000g) и собирали нижний слой, содержащий гемагглютинин.
3.1.12.Нуклеопротеид вируса бешенства получали по методу Socol F. (240), которой заключается в разрушении вирионов бешенства при помощи дезоксихолата натрия (ДХН) и выделении нуклеопротеида. Согласно этому методу, обрабатывали очищенный и концентрированный вирус ДХН в концентрации 5мг/1000 ГАЕ (гемагглютинирующих единиц) в течение Юмин при +20С. Для отделения нуклеопротеида от белков оболочки и не полностью разрушенных вирионов обработанный вирус фракционировали при помощи высокоскоростного центрифугирования. Разрушенный вирус наслаивали на 10-28% линейный градиент сахарозы и центрифугировали 2ч при 22500об/мин (60000g) и собирали фракции. В нижней фракции содержались не разрушенные вирионы, в верхней - белки оболочки, а в средней - нуклеопротеид. Среднюю,, содержащую нуклеопротеид, фракцию диализовали 18ч против бурного ФР при +44С. Затем препарат концентрировали в 3 раза диализом против ПЭГ и центрифугировали на "подушке" хлористого цезия плотностью 1,32г/см , 24ч при 40000 o6/MHH(125000g). После центрифугирования собирали нижнюю фракцию и диализовали 18 ч против буферного ФР при +4С.
