Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы.
2.1. Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота
2.1.1. Общаа характеристика парамиксовирусов
2.1.2. Парагрипп-3 крупного рогатого скота
2.2. Антигенная вариабельность вируса ПГ-3 КРС
2.3. Иммунный ответ на заражение вирусом ПГ-3 КРС
2.4. Морфология вируса парагриппа
2.5. Химический состав вируса ПГ-3 КРС
2.6. Антигенное родство парамиксовирусов и идентичность аминокислотных сиквенсов
2.7. Антигенное родство парамиксовирусов и идентичность нуклеотидных сиквенсов
2.8. Биологические свойства штаммов вируса ПГ-3 КРС и влияние па них физических и химических факторов 2.8.1. Ипфекциопность и гемагглютинирующая активность
2.9. Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 КРС и его структурных компонентов
2.10. Лабораторная диагностика ПГ-3-3 КРС
2.11. Профилактика парагриппа-3 и перспективы лечения
2.12. Заключение но обзору литераруры
3. Материалы и методы.
4. Собственные исследования.
4.1. Выбор культуры клеток для репродукции вируса парагриппа-3, штамм «ЗКСМ».
4.2. Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 КРС.
4.3. Биологические свойства вируса ПГ-3 КРС
4.4. Получение копыогата анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена. 80
4.4.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки
крови крупного рогатого скота. 80
4.4.2. Получение анти-IgG КРС гипериммунной сыворотки. 84
4.4.3. Выделение антивидовых иммуноглобулинов
(анти-IgG КРС) 85
4.4.4. Мечение антивидовых иммуноглобулинов
(анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена. 88
4.5. Тест-систс.ча иммунофермснтного анализа для диагностики ПГ-3 КРС 92
4.5.1. Антиген для иммуноферментного анализа ПГ-3 КРС. 92
4.5.2. Выделение антигенов вируса ПГ-3 из вируссодержащих суспензий. 93
4.5.3. Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа ПГ-3 КРС. 96
4.6. Диагностика ПГ-3 КРС методом иммуноферментного анализа. 98
4.7. Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 101
5. Обсуждение 104
6. Выводы. 111
7. Практические предложения. 113
8. Список литературы. 114
9. Приложение. 133
- Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота
- Материалы и методы.
- Выбор культуры клеток для репродукции вируса парагриппа-3, штамм «ЗКСМ».
Введение к работе
/./. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.
В связи с сохранением в нашей стране животноводческих хозяйств, остается' актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации животных часто проявляются у молодняка. Парагрипп — 3 (ПГ-3) - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней телят при промышленном животноводстве. Изучение ПГ-3 крупного рогатого скота (КРС) в течение последнего времени показало актуальность данной проблемы.
Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.
При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы, как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако, ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов, метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа,
Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченных пе-роксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов G, М и А классов.
Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных, они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.
Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина, меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.
Быстрый и точный диагноз парагриппа-3 крупного рогатого скота является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.
1.2. Цели и задачи исследования.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе аффинно-очищенных и концентрированных антигенов вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», для использования их в качестве компонента набора при серологической иммуноферментной диагностике ПГ-3 КРС посредством определения уровня антител в крови больных и переболевших животных.
Решались следующие задачи
1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного антигена вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80.
Вьщелить IgG КРС, получить анти-IgG КРС антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG КРС антитела и синтезировать анти-IgG КРС иммунопе-роксидазный коньюгат.
Вьщелить поверхностные белки вируса ПГ-3, изучить их состав в электрофорезе и активность в иммуноблотинге, иммобилизовать их в качества ли* ганда на BrCN сефарозу.
На полученном сорбенте вьщелить специфические к антигенам ПГ-3 антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN сефарозу.
1.2.5. Разработать компоненты иммуноферментного набора для определения
уровня антител к вирусу парагриппа — 3 крупного рогатого скота на основе
аффинно-очищеныхантигенов вируса ПГ-3.
1.2.6. Провести сравнительную оценку определения уровня анти-ПГ-3 антител в
РН, РИГА и с помощью разработанного иммуноферментного Набора.
1.3, Научная новизна.
В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения очищенных и концентрированных антигенов вируса ПГ-3 КРС, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ПГ-3 IgG Сефарозе.
При изучении в электрофорезе белков вируса ПГ-3 КРС, штамм «ЗКСМ», которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, выявлено 8 структурных гликопротеинов с молекулярной массой от 14 до 180 кД.
По результатам иммуноблотинга показано, что 8 белков вируса ПГ-3, которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-ПГ-3 антител в организме восприичивых животных.
разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа — 3 крупного рогатого скота на основе аффинно очищеных антигенов вируса ПГ-3, штамм «ЗКСМ».
1.4. Практическая значимость работы.
Результаты проведенных исследований позволили разработать инструкцию по изготовлению иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа - 3 крупного рогатого скота и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-ПГ-3 антител в сыворотках крови КРС
Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа-3 позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.
1.5. Апробацияработы.
Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 - 2004г.г.), на международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии Производства, биопрепаратов, Щелково (2002 г), на одинадцатом Московском международном ветеринарном конгрессе, г. Москва (2003 г.).
По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
1.8. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалу и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 72 отечественных и 151 зарубежный источников и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 22 рисунками и 1 схемой.
Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, профессору АЯ. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.
Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота
Впервые в 1956 г, Чсннок описал СА (croup-associated) вирус, выделенный от детей с острым ларинготрахеитом, а затем в 1958 г. Ченпок с соавторами выделили от детей с респираторными заболеваниями новые вирусы в культуре ткани почки обезьяны методом гемадсорбции [95]. Сходный вирус М-25 был выделен в 1960 г. Джонсоном и сотрудниками от детей и взрослых лиц.
Парамиксовирусы были идентифицированы только у позвоночных животных.
Парамиксовирусы относятся к вирусам, содержащим односпирапьную песегментированную РНК негативной полярности, семейству Paramyxoviridae, входящее в отряд Mononegavirales. Семейство включает в себя 2 подсемейства: Paramyxovirinae и Pneumovirinac; в первое подсемейство входят 3 рода - Respirovirus, Rubulavirus, Morbillivims; во второе - 2 рода: Pneumovirus и Metapneumovirus.
Помимо двух идентифицированных вирусов, обозначаемых Fer-de-Lance virus рептилий (FDLV) и Nariva virus (NARV) грызунов, известно еще несколько вирусов, выделенных от пингвинов, и отличающихся от парамиксовирусов 1-9 (таблица 1). Более того, вирус Hendra, родственный подсемейству Paramyxovirinae (родственны гены F, Н, М, F1P, V, С), был выделен от растительноядных летучих мышей и лошадей в Queensland (Австралия).
Большинство вирусов имеет узкий спектр естественных хозяев, но они способны к репродукции в разных культурах клеток. Инфекция клеток в культуре обычно литическая, но может быть кратковременная или персистентная. Одной из особенностей является образование телец-включений и синцития. Рецепторы клеточной поверхности, сиалогликопротеииы и гликолипиды, участвуют в прикреплении респиро- и рубулавирусов. Нуклсокапсиды ассоциируются с протеинами вирусной мембраны на плазматической мембране, после чего при почковании приобретают липидиую мембрану.
Парамиксовирусные инфекции начинаются с респираторного тракта, но могут распространяться на вторичные очаги, например, лимфоидные и эндотелиальпые ткани для MEV, эндотелиальпые ткани для MUV. Данные инфекции, как правило, ограничены и элиминируются иммунной системой хозяина [32].
Материалы и методы
NCI, H2S04. NaOH, NaCl К2НР04, КН2Р04, Na2HP04, КС I, NaIIC03, ZnS04, NaJ04, ортофеиилепдиамин (ОФД), трихлоруксусная кислота (ТХУ), додсцилсульфат натрия (ДСН), димстилсульфоксид (ДМСО), Н2О2, ацетон, изопропанол, глицин, бикарбонат натрия, боргидрид натрия, сульфат аммония, лимонная кислота, уксусная кислота, 3Ы-валин («Изотоп», Ленинград), 3Н-лейцин («Изотоп», Ленинград), фосфорно-вольфрамовая кислота (ФВК), уранил-ацетат (УА).
Импортные реактивы: трис (гидроксиметиламинометан) (Reanal), ЭДТА, додецилсульфат натрия, бычий сывороточный альбумин (BSA), сахароза, ацетат натрия, Кумасси R-250 («Amersham»), акрилам ид (Reanal), бисакриламид (Reanal), TEMED (Serva), Тритон X-305(Sigma), Тритон X-100 (Sigma), Твин-20 (Serva), Фикол-400 (Pharmacea), Декстран-Т-70 (Pharmacca), моноэтаноламин (Sigma), веронал-мединал (Reanal), Н-глюкозамин («Amersham»), пероксидаза из хрена RZ 3,0 (Олайнс), Агароза для РДП, Агар «Дифко» для иммуноэлектофореза, BrCN-Сефароза, Протеи и-А-Сефароза (Pharmacca), Сефадекс G10, 15, 25, 50, 100, 200, С 50, SP 50, DEAE 50 (Pharmacea), DEAE Trisacryl М, CM Trisacryl М (LKB), Toyopearl HW 40, HW 50,1-ІW 55 (Тоуо), гипоксантин (Sigma), аминоптсрин (Sigma), тимидин (Sigma), глютамин (Flow), 2-мсркаптоэтанол (Fluka), полиэтиленгликоль-4000, 6000 (Sigma), пируват натрия (Gibco), пеницилин(СіЬсо), стрептомицин (Gibco), гентамицин (Gibco), инсулин (Gibco), пристан (Sigma).
0,01М калий фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15М NaCl, рЫ 7,3 + 0,1 (ЗФР); 0,01М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15М NaCl и 0,15 Твин-20 рН 7,3 + 0,1 (ЗФР-Т); 0,15М фосфатно-цитратный буферный раствор, рН 5,0; 0,15М фосфатно-цитратный буферный раствор, содержащий 0, 4мг/мл о-фенилендиамина (ОФД) и 0,012% Н2О2, рН 5,0 (субстратный раствор); 62,5 мМ Трис, 2,25% ДСН, 12,5% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол и 0,01% бром - фенол голубой, рН 6,8 (дезинтегрирующий буфер); 0,2% Кумаси в 50% метаноле и 7% уксусной кислоте (окрашивающий раствор); 6,5 мМ трис-HCl буфер содержащий 64 мМ глицина, 20% этанола, рН 8,3 (буфер для переноса); физиологический раствор содержащий 0,5% Твии - 20 (ФР-Т); блокирующий раствор - ЮмМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15М NaCl и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7,4 (ЗФР-БСА); ЮмМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15М NaCl, 1% БСА и 0,05% Твин-20 рН 7,4 (ЗФР-БСА-Т); 4% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК), рН 7,2; 2% водный раствор урапил-ацетата (УА); 0,1М глицин МС1, рМ 2,0 (элюирующий буфер). среда Игла, среда 199, среда ГЛАХ (Институт Полиомиелита), сыворотка КРС для культуральных работ (ООО «Фуро»), фетальная сыворотка коров (000 «Фуро»), белые мыши массой 18-20 г, крысы массой 250 - 400г, морские свинки 250 - 400 г, кролики массой 2,5 — 3,0 кг. Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам. спектрофотометр с X 280нм и 490нм; центрифуги с бакет роторами на 5000 и 20 000 об/мин; ультрацептрифуги (60 000 и более об/мин); коллектор фракций (насос, рекордер с отметкой фракций, проточный спектрофотометр с изменяющейся X); система для вертикального и горизонтального электрофореза; система для электрофоретического переноса белков; градиент-миксер; магнитные мешалки; ячейки для ультрафильтрации (25, 50, 100, 200, 500 и 1000мл); система для детекции результатов ИФА (автоматический спектрофотометр, система для промывки плашек, инкубатор для микропланшет); комплект типа «Эппендорф» (центрифуга, термостат, миксер, автоматические микропипетки); шейкер; колонки для хроматографии; холодильники на + 4, -20 и -70С; водяная баня; термостаты на +37, +42, + 80С; вытяжной шкаф; вакуумный насос; микроскоп МБИ-2 (ЛЮМАМ, Ленинград).
Выбор культуры клеток для репродукции вируса парагриппа-3, штамм «ЗКСМ».
Вирус парагриппа-3, штамм «ЗКСМ» репродуцировали в перевиваемой культуре клеток ПОЧКИ теленка — ПТ-80, в первнчно-трипсинизированных культурах клеток легкого (ЛЭК) и трахеи (ТЭК) эмбриона коровы (на уровне 30-го субпассажа) и куриных эмбрионов (ККЭ) (1-й субпассаж).
Клетки выращивали на культуральной среде содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.
После образования монослоя клеток (рис. 3 а, в) его трижды отмывали раствором Хенкса и инокулировали вирус ПГ-3, штамм «ЗКСМ» в течение часа при 37 С из расчета 1-2 ТЩЬо на клетку. Затем добавляли
Рис. 3. Цитопатическое действие вируса ПГ-3 на культуру клеток.
а) монослой клеток ЛЭК, в) монослой клеток ПТ-80
б) ЦПД вируса ПГ-3 на ЛЭК, г) ЦПД вируса ПГ-3 на ПТ-80 бессывороточную среду ГЛЛХ (гидролизат лактальбумина на расворе Хенкса), содержащую 40 единиц гейтамицина на литр среды.
После проявления 80% ЦПД (рис. 3 б, г) клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием, культуральные матрасы встряхивали и осаждали клеточный детрит центрифугированием при 5000 об/мин в течение часа.
Надосадочную вирус-содеожащую среду исследовали на инфекционную (п. 3.2.6.) и гсмагглютинирующую (п. 3.2.10.) активность.
Как видно из результатов, представленых в таблице 7, вирус, выращенный в перевиваемой культуре ПТ-80, проявляется в реакции ГА в титрах 1:64 - 1:128, обладает инфекционностью на уровне 6,8 — 8,0 lg ТІДД50/МЛ. Во всех проведенных экспериментах он по всем показателям превосходил вирус, репродуцированный в монослое ЛЭК, ТЭК и ККЭ. Однако величины этих различий от опыта к опыту были не однозначными и варьировали в значительном диапазоне.
В образцах перевиваемой культуры клеток ПТ-80, инфицированных дозой 1—2 ТЦДзо/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования.
