Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1.1 Общая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота и заболевания, вызываемого этим вирусом 8
1.2 Методы диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота 14
1.3 Мировой опыт борьбы с лейкозом крупного рогатого скота 20
1.4 Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Краснодарском крае и регионах Российской федерации 23
1.5 Наследственная предрасположенность крупного рогатого скота к лейкозу и методы её выявления 25
2. Материал и методика проведения исследования 40
2.1 Методика проведения исследований 40
2.2 Выделение ДНК 43
2.3 Проведение полимеразной цепной реакции 44
2.4 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции 46
2.5 Электрофорез 47
3. Собственные исследования 48
3.1 Оптимизация методик взятия крови, выделения ДНК, проведения ПЦР и ПДРФ-аиализов 48
3.2 Характеристика изученных животных .54
3.3 Изучение частоты встречаемости генотипов BoLA DRB 3 гена в группах здоровых животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота и больных персистентным лимфоцитозом 55
3.4 Изучение частоты встречаемости аллелей гена BoLA DRB 3 в различных популяциях крупного рогатого скота Краснодарского края 57
3.5 Отбор селекционной группы коров, предназначенных для воспроизводства быков-производителей, и выявление животных, несущих признаки устойчивости к персистентному лимфоцитозу и улучшенных технологических качеств молока 63
3.6 Изучение генотипов быков-производителей 66
3.7 Использование генотипирования по локусу BoLA DRB З в установлении происхождения животных 67
3.8 Экономическая оценка эффективности использования генетического маркера устойчивости к персистентному лимфоцитозу в селекции крупного рогатого скота 69
4. Обсуждение результатов исследований 72
Выводы 75
Предложения производству 77
Список литературы
- Общая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота и заболевания, вызываемого этим вирусом
- Методика проведения исследований
- Оптимизация методик взятия крови, выделения ДНК, проведения ПЦР и ПДРФ-аиализов
Введение к работе
Актуальность темы
Успехи биологических наук — физиологии, биохимии, гистологии и генетики — обусловили в начале нашего столетия развитие нового направления в селекции - оценки потенциальных возможностей (продуктивных и племенных) животных по их внутренним морфологическим особенностям — интерьеру. Одним из основоположников этого направления в нашей стране был Е.Ф. Лискун (цит. по Е.В. Эйдригевич, В.В. Раевская, 1978), который в начале прошлого века показал связь между гистологическим строением молочных желез и молочной продуктивностью коров. Большой интерес исследователи проявили к составу крови. В настоящее время накоплен довольно большой материал о связи ряда биохимических и иммунологических показателей с хозяйственно-полезными качествами различных животных (Е.В. Эйдригевич, В.В. Раевская, 1978). В настоящее время все большую актуальность приобретают исследования, позволяющие выявлять полиморфизм на уровне ДНК и связывать его с качественными показателями животных.
Зная нуклеотидную последовательность и локализацию конкретного участка ДНК, можно выявлять в нем полиморфные участки, то есть участки, различающиеся у представителей исследуемой группы. Затем устанавливается связь полиморфного варианта с тем или иным хозяйственно-полезным признаком, заболеванием, другими показателями.
Использование отбора по генетическим маркерам выводит селекцию на новый уровень, позволяя непосредственно оценивать генотипы (С. Camaschella, A. Alfarano, Е. Gottadi, 1990; В.И. Глазко и др., 2000).
Инфицированность крупного рогатого скота вирусом лейкоза в большинстве хозяйств Краснодарского края достигла 100% у взрослых животных.
В настоящее время одной из наиболее известных методик ликвидации лейкоза является так называемая «технологическая», предусматривающая вы- деление из стада больных особей, изолированное выращивание здоровых, выполнение других зооветеринарных мероприятий. В то же время селекционные методы борьбы с этим заболеванием, на наш взгляд, разработаны недостаточно. Между тем, отечественными и зарубежными исследователями установлено, что отдельные животные одной и той же породы имеют различную устойчивость (наследственную невосприимчивость) к лейкозу (персистентному лимфоцитозу), которая обуславливается наличием определенных аллелей генов, отвечающих за эффективный иммунный ответ в организме. Сохранение и накопление этих аллелей в потомстве повышает его устойчивость к персистентному лимфоцитозу, а это способствует воспроизводству наследственно устойчивых к заболеванию животных и, в конечном итоге, оздоровлению всего стада.
Цель и задачи исследований.
Цель настоящей работы - разработка направлений использования в селекции нового признака - наследственной устойчивости к персистентному лимфоцитозу.
В связи с этим программа исследований включала решение следующих задач: обосновать необходимость селекции крупного рогатого скота на устойчивость к персистентному лимфоцитозу; изучить популяции крупного рогатого скота Краснодарского края на предмет встречаемости аллельных вариантов гена BoLA DRB 3, отвечающего за предрасположенность к персистентному лимфоцитозу; изучить племенных быков, используемых в системе искусственного осеменения края на предмет структуры гена BoLA DRB 3; в одном из хозяйств отобрать по основным зоотехническим характеристикам высокопродуктивных коров, предназначенных для воспроизводства племенных быков, и выявить среди них особей с устойчивостью к персистентному лимфоцитозу; - представить возможные варианты скрещиваний для получения устойчивого к персистентному лимфоцитозу племенного молодняка.
Научная новизна исследований.
Оптимизированы методики проведения полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции для генотипирования по локусам BoLA DRB3 и каппа-казеина.
Впервые изучена генетическая структура популяций крупного рогатого скота Краснодарского края по генам BoLA DRB 3 и каппа-казеина. Установлено преобладание аллелей чувствительности к персистентному лимфоцитозу над аллелями устойчивости и нейтральными аллелями в популяциях скота с высокой долей крови голштинской породы. Показано, что аллельный полиморфизм по гену BoLA DRB3 более разнообразен в популяции аборигенной красной степной породы. Установлена высокая частота встречаемости генотипа АА по гену каппа-казеина.
Практическая значимость и реализация результатов исследований.
Обоснована необходимость использования при отборе селекционной части стада коров, предназначенных для воспроизводства племенных бычков, признака устойчивости к персистентному лимфоцитозу. В хозяйстве «Бейсуг» Приморско-Ахтарского района Краснодарского края отобраны коровы, несущие гомозиготный по устойчивости генотип и свободные от носительства про-вируса лейкоза крупного рогатого скота. В этом же хозяйстве изучена частота встречаемости генотипов по гену каппа-казеина. Проведены исследования образцов семени быков-производителей голштинской красно-пестрой породы и установлен их генотип по локусам BoLA DRB3 и каппа-казеину. Составлены варианты заказного подбора, позволяющие получить потомство, гомозиготное по устойчивости к персистентному лимфоцитозу.
На защиту выносятся следующие положения: животные, несущие одну или две аллели гена BoLA DRB3, обуславливающие устойчивость к персистентному лимфоцитозу, генетически защищены от перехода лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза; в различных популяциях крупного рогатого скота Краснодарского края аллели чувствительности к персистентному лимфоцитозу преобладают над аллелями устойчивости; популяция скота красной степной породы генетически более разнообразна по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина, чем популяции с высокой долей крови голштинской породы; в популяциях крупного рогатого скота, в значительной мере пораженных лейкозом, необходимо использовать быков-производителей, несущих аллели устойчивости к персистентному лимфоцитозу; при отборе селекционной группы коров, предназначенных для воспроизводства племенных бычков, необходимо использовать признак устойчивости к персистентному лимфоцитозу.
Общая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота и заболевания, вызываемого этим вирусом
Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы. Заболевание характеризуется патологически усиленной пролиферацией лимфо-идных клеток в местах их возникновения и за их пределами, выбросе этих клеток в циркулирующую кровь, появлении злокачественных образований в кроветворных и других органах и тканях (В.А. Крикун, 2002). Название болезни "лейкоз" происходит от греческого слова LEUCOS, что означает белый. Начало учения о лейкозе связано с именем известного немецкого морфолога Рудольфа Вирхова, который в 1845-1953 г.г. (информация с сайта www.vetlab.spb.ni.) впервые описал болезнь у человека. Он выделил ее в самостоятельную нозологическую единицу под названием "лейкемия" или белокровие, поскольку белые элементы крови придают ей более или менее белую окраску. При этом автор выделил две ее формы: селезеночную, проявляющейся увеличением селезенки и появлением в крови больных лейкоцитарных форм, и лимфатическую, характеризующейся увеличением лимфоузлов и появлением малых клеток - лимфоцитов. Несколько позднее появились сообщения по лейкозу животных. Первый случай лейкемии у лошади описал патологоанатом Дрезденского ветеринарного института Г. Лейзеринг в 1858 году (информация с сайта www.vetlab.spb.ru). В процессе изучения эту болезнь называли по разному: лейкемия, белокровие, рак крови, гемобластозы, энзоотический лейкоз. В нашей стране принято употреблять термин "лейкоз". По характеру и месту локализации опухолевых клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы: лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоид-ную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы; гемато-саркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфо саркома, ретикулосаркома, лимфофануломатоз и миеломная болезнь. Первая отличается системностью поражения кроветворной и лимфоидной тканей с вовлечением в процесс костного мозга, селезенки и лимфатических узлов. Болезни второй фуппы характеризуются поражением лимфоидной ткани, то есть лимфоузлов и селезенки. Опухоли, состоящие из клеточных элементов, природу которых трудно установить, относятся к числу недифференцированных лейкозов. По литературным данным, у крупного рогатого скота наибольшее распространение имеет лимфоидный лейкоз.
Известно, что патогенез каждого заболевания обусловлен, прежде всего, этиологическим фактором, а затем факторами, способствующими его возникновению и развитию. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является этиологическим фактором лейкоза у коров, телят, реже у других животных (в основном при экспериментальном заражении): овец, коз и кроликов (Л.Б. Про-хватилова и др., 2001; Н.В. Замараева, М.И. Гулюкин, Н.Н. Снежков, 1996), имеются данные об экспериментальном заражении обезьян (Н.М. McClure, М.Е. Killing, P.Ph. Custer, 1974). ВЛКРС впервые удалось выделить в 1969 году, но в экспериментальных условиях болезнь была воспроизведена ещё" в 1916 году путём введения подопытным телятам и взрослым животным крови и суспензии из лимфатических узлов от больной коровы (J.M. Miller, L.D. Miller, С. Olson, K.G. Gillet, 1969).
Вирус лейкоза крупного рогатого скота относится к семейству ретровиру-сов. Семейство ретровирусов (Retroviride), по данным международного комитета по таксономии вирусов, разделено на 7 родов (Б.Г. Орлянкин, 1996; П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, В.В. Смирнова, 2000). Наиболее распространенными среди домашних животных являются представители двух родов: рода Deltaretrovirus, объединяющего вирус лейкоза крупного рогатого скота, Т -лимфотропные вирусы человека 1 и 2 типов, вирус лейкоза обезьян и рода Lentivirus, объединяющего 5 подродов лентивирусов (от латинского lenti - медленный). К ним относят лентивирусы коз и овец, вирус иммунодефицита приматов, лентивирусы лошадей, лентивирусы кошек, лентивирусы крупного рога 10 того скота. Ретровирусным инфекциям свойственен ряд общих признаков: длительность инкубационного периода, хроническое или латентное течение, прижизненная персистенция вируса и строго ограниченный круг восприимчивых животных.
Ретровирусы проникают в клетку путем эндоцитоза, РНК освобождается и транскрибируется в двухцепочечную ДНК-копию, которая встраивается как провирус в ДНК клетки хозяина (Р.А. Кукайн, 1982). Интегрированный в геном вирус остается недоступным для воздействия специфических антител и перси-стирует в организме на протяжении всей жизни животного (В.А. Крикун, 2002).
В благоприятных условиях с интегрированного провируса транскрибируется как вирусная РНК-копия, так и РНК, которые транслируются в белки. Затем происходит сборка новых вирионов, которые отпочковываются от клеточной мембраны для инфицирования новых клеток.
Морфологически вирус лейкоза крупного рогатого скота имеет сферическую форму и относится к оболочечным вирусам (М.И. Гулюкин, Н.В. Зама-раева, 2000), то есть его наружным компонентом является двухконтурный ли-пидный слой с погруженными в него вирусными поверхностными белками-гликопротеидами, которые формируют наружные структуры-шипы. Липопро-теидная оболочка окружает сердцевину, которая содержит две идентичные молекулы геномной РНК, ассоциированные с внутренними белками - продуктами генов gag (р24) и рої (обратная транскриптаза). В отличие от Т-клеточного лейкоза человека ВЛКРС поражает В-лимфоциты, встраиваясь в геном клетки-хозяина в виде ДНК - копии (провируса). Интегрированный в клеточный геном провирус может долгое время не экспрессироваться, чем и объясняется наличие длительного латентного периода в течение заболевания (Б.Г. Орлянкин, 1996).
Методика проведения исследований
Методика проведения исследований включала следующие этапы (схема 1):
1. Изучение частоты встречаемости аллельных вариантов гена BoLA DRB 3 в популяции крупного рогатого скота ОПХ СКНИИЖ «Рассвет». Было отобрано три группы животных: первая - животные (n=24) , не реагирующие в РИД (здоровые), вторая (п=22) - животные, реагирующие в РИД (инфицированные), третья (п=14) - животные, реагирующие в РИД и имеющие гематологические изменения в крови (больные персистентным лимфоцитозом).
2. Изучение частоты встречаемости аллельных вариантов гена BoLA DRB 3 в популяциях крупного рогатого скота племзавода «Привольное» Канев ского района (п=60), «Дружба» Приморско-Ахтарского района (п=60).
3. Изучение частоты встречаемости аллельных вариантов гена BoLA DRB 3 в популяции высокопродуктивных коров племзавода «Бейсуг» Приморско-Ахтарского района (п=60). Для этого в племзаводе на основании предварительного изучения маточного поголовья по генотипу и фенотипу были отобраны наиболее ценные коровы, а именно:
- обладающие максимально высокой продуктивностью (удой не ниже 5500 кг молока за лактацию, содержание жира — 3,5%, белка - 3,3%), без экс-терьерных недостатков;
- имеющие ценный генотип (такую же высокую продуктивность и у предков в родословной, то есть наследственно закрепленную).
4. Изучение частоты встречаемости аллельных вариантов гена каппа-казеина в популяции высокопродуктивных коров племзавода «Бейсуг» Приморско-Ахтарского района (п=60).
5. Отбор селекционной группы коров, предназначенных для воспроизводства ремонтных бычков, несущих выгодные варианты генов каппа-казеина и BoLA DRB 3 и свободных от носительства провируса лейкоза крупного рогатого скота для заказного спаривания с быками соответствующих генотипов.
6. Изучение генотипов быков-производителей и рекомендация использования быков с аллелями устойчивости к персистентному лимфоцитозу для заказного спаривания с целью получения быков-производителей, несущих в своем генотипе аллели устойчивости к персистентному лимфоцитозу.
Оптимизация методик взятия крови, выделения ДНК, проведения ПЦР и ПДРФ-аиализов
В связи с высокой чувствительностью метода ПЦР и опасностью получения ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации образцов крови, при взятии биологического материала использовали следующие правила: забор крови осуществляли только одноразовыми шприцами; затем иглу шприца снимали; кровь осторожно выдавливали в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом и в этот же день доставляли в лабораторию.
В тех случаях, когда не представлялось возможным сразу приступить к выделению ДНК, образцы хранили в холодильнике при + 4С. Нам удавалось успешно выделять ДНК через 1 -2 месяца после взятия крови.
Определенные трудности возникли при выделении ДНК из спермы, так как в состав среды для криоконсервации входят вещества, мешающие как нормальному выделению ДНК, так и успешному прохождению ПЦР. Поэтому начальный этап выделения пришлось несколько модифицировать, введя этап первичной обработки образцов. На этом этапе семя размораживали, 300 мкл переносили в чистую пробирку, центрифугировали 5 минут при 4000 об/мин, удаляли супернатант, к осадку добавляли 1 мл промывочного раствора (200 мкл 0,5М раствора ЭДТА + 7 мл 1М раствора NaCl (0,6 г на 10 мл воды) + 42,8 мл воды), ресуспендировали на вортексе, центрифугировали 5 минут при 4000 об/мин, к осадку добавляли 400 мкл лизирующего раствора и термостатировали смесь при 65С 40 минут. К выделению ДНК из крови приступали без термостатирования согласно инструкции, прилагаемой к набору для выделения.
Для успешного прохождения ПЦР необходимо правильно подобрать концентрации ДНК, ионов Mg , нуклеозидтрифосфатов, праймеров в реакционной среде, установить оптимальные значения температур и времени плавления, отжига и процессинга. Численные значения всех этих параметров устанавливаются опытным путем. Зависят они от вида анализа, а также от оборудования, установленного в лаборатории. То есть, те значения ключевых параметров, которые позволяют эффективно проводить ПЦР в одной лаборатории, окажутся бесполезными в другой. При подборе числовых значений концентраций, температур и количества циклов обычно выбирали один из факторов (например, концентрацию ионов Mg2+), и проводили ПЦР в нескольких повторах (обычно 3-4) так, чтобы пробирки отличались друг от друга только концентрацией этого компонента. Диапазон концентраций ионов Mg2+, используемых в ПЦР, исходя из литературных данных, составляет 1,5-3 мМ, поэтому в пробирки добавляли все компоненты ПЦР и MgCh в концентрации 1,5 мМ; 2 мМ, 2,5 мМ и 3 мМ. После прохождения ПЦР анализировали продукты амплификации и определяли ту концентрацию, которая позволяет получить наиболее высокий выход специфичного ПЦР-продукта. В тех случаях, когда помимо специфичных продуктов ПЦР на электрофореграммах появлялись другие полосы, что говорило о неправильном отжиге праймеров, условия реакции делали более жесткими (например, поднимали температуру отжига праймеров). Эмпирически установленные концентрации компонентов реакции, а также временные и температурные условия ПЦР приведены в главе «Материалы и методы». В литературе рекомендуется использовать два раунда (нестед - ПЦР) для амплификации 2 экзона гена BoLA DRB3 с применением праймеров HLO 30 и HLO 31 в первом раунде и HLO 30 и HLO 32 - во втором раунде (MJ.T. Van Eijk, J.A. Stewart-Haynes, H.A. Levin, 1992). Но эффективность нестед-ПЦР и однораундовой ПЦР с прайме-рами HLO 30 и HLO 32 в проведенных исследованиях оказалась примерно одинаковой, поэтому, учитывая значительно больший риск контаминации в первом случае, пришли к выводу о нецелесообразности постановки нестед-ПЦР. 33 цикла амплификации с праймерами HLO 30 и HLO 32 было достаточно для четкой визуализации амплифицируемого фрагмента.
