Содержание к диссертации
Введение
1- Гены главного комплекса гистосовмсстимости крупного рогатого скота
1.1. Структура главного комплекса гистосовместимости 7-11
1.2, Методы изучения главного комплекса гистосовместимости 11 - 13
1-3. Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота 13 - 18
1.4. Связь антигенов главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота с болезнями и хозяйственно-полезными признаками 18 - 23
1.5. Распределение аллелей гена BoLA-DRB2> у различных пород крупного рогатого скота 23-26
2, Изучение полиморфизма генов пролактина и гормона роста крупного рогатого скота
2.1. Пролактип и гормон роста: структура и биологическая роль
2.1,1. Регуляция секреции 27-28
2.1.2 Биологическая роль 28-29
2.1.3 Структура генов пролактина и гормона роста 29 - 30
2.2. Полиморфизм гена пролактина и методы его определения 30 - 35
2.3. Изучение полиморфизма гена гормона роста (bGH) 35 - 37
Материалы и методы 38 - 52
Результаты и обсуждение 53 - 83
1, Полиморфизм гена BoLA-DRB3 в связи с устойчивостью к лейкозу н молочной продуктивностью
1.1. Оптимизация условий типирования аллелей гена BoLA-DRB5 54 - 57
1.2. Определение аллельных вариантов гън'д BoLA-DRB3t ассоциирующихся с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу, с помощью аллельспецнфичной полимеразиой цепной реакции 57 - 61
1.3. Сравнительный анализ аллсльного разнообразия гена BoLA-DRB3 у разных пород крупного рогатого скота 61 - 66
1.4. Сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA-DRBi у черно-пестрого и айрншрекого скота в под выборках виру со носителей, здоровых и больных лейкозом животных 66 - 72
2. Полиморфизм генов гормона роста и пролактина у крупного рогатого скота и монгольских яков
2.1. Полиморфизм гена гормона роста у крупного рогатого скота и монгольских яков 72 - 76
2.2. Полиморфизм гена пролактина (bPRL)y крупного рогатого скота и монгольских яков 76-S3
Выводы 84-85
Список литературы 86-104
- Методы изучения главного комплекса гистосовместимости
- Полиморфизм гена пролактина и методы его определения
- Определение аллельных вариантов гън'д BoLA-DRB3t ассоциирующихся с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу, с помощью аллельспецнфичной полимеразиой цепной реакции
- Полиморфизм генов гормона роста и пролактина у крупного рогатого скота и монгольских яков
Введение к работе
Лейкоз является одной из самых распространенных инфекционных болезней крупного рогатого скота. Лейкоз животных относят к тяжелым, с летальным исходом, заболеваниям опухолевой природы, основным признаком которых является злокачественное распространение клеток кроветворных органов с нарушением их созревания.
Лейкоз сельскохозяйственных животных представляет актуальную проблему для современной науки, имеющую как общебиологическое так и народнохозяйственное значение. Заболевание наносит большой экономический ущерб народному хозяйству, который состоит из потери племенного молодняка, утраты генофонда высокопродуктивных животных и недоброкачественной продукции. В тканях животных, больных лейкозом, накапливаются метаболиты, являющиеся опкогеиными веществами.
Основным этиологическим фактором лейкоза является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС), относящийся к группе ретровирусов. Ипфицированность животного не всегда приводит к развитию заболевания, для этого необходимо определенное состояние иммунной системы животного и его генетическая восприимчивость к заболеванию. Вирус индуцирует хроническую инфекцию у крупного рогатого скота, приводящую к трем возможным патологическим формам заболевания: асимптоматическое течение, персистснтный лимфоцитоз (PL) и лимфосаркома (Burny et al., 1980, 1988). Однажды инфицированное животное остается вирусопосителем в течение всей своей жизни. В серологической реакции инфекция проявляется спустя несколько недель после инфицирования.
. Изучены структура, химические, биологические, иммунологические свойства данного вируса, найден метод культивирования в лабораторных и промышленных условиях. Одновременно с выделением ВЛ КРС был изолирован вирус, который отнесен к иммунодефицитоподобному вирусу крупного рогатого скота. Интерес к данному возбудителю возрос после выделения вируса иммунодефицита человека (HIV), так как этот возбудитель мог быть использован в качестве модели для изучения вируса человека. Установлено также, что ретровирус типа С, также вызывающий лейкозы у крупного рогатого скота, структурно и функционально сходен с вирусом HTLV-I, HTLV-1V, вызывающим Т - клеточную лейкемию у человека (Derse et al., 1985; Sagata et al., 1985), хотя возможность заражения человека вирусом лейкоза крупного рогатого скота не доказана.
Разработка селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных относительно лейкоза включает изучение ассоциативных связей антигенов Главного комплекса гистосо вмести мости крупного рогатого скота (Bovine leukocyte antigens-BoLA) с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу.
Изучение нуклеотидных последовательностей генов класса II BoLA-системы у крупного рогатого скота позволило описать аллели гена DRB3 (методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов) и выявить аллели, ответственные за устойчивость и восприимчивость к лейкозу. Поиск генетических маркеров устойчивости к данному заболеванию приобретает практическое значение для разработки селекционно-генетических методов борьбы с лейкозами и создания здоровых стад.
В настоящее время активно изучаются гены, отвечающие за молочную продуктивность, такие как пролактин и гормон роста. Ведется поиск ассоциаций конкретных аллелей этих генов с различными признаками молочной продуктивности. Описано несколько полиморфных сайтов рестрикции в генах гормона роста и пролактина, микросателлитпые локусов и точечные мутации.
Однако многие вопросы, связанные с генетической обусловленностью формирования признаков устойчивости к заболеваниям и молочной продуктивности, остаются открытыми. Неизвестно, насколько универсальный характер носят аллели гена BoLA-DRB3, ответственного за устойчивость и восприимчивость к лейкозу, а также, насколько широко они распространены у разных пород крупного рогатого скота. Мало изучены местные породы крупного рогатого скота в отношении полиморфизма генов, участвующих в формировании рассматриваемых признаков.
К настоящему времени выявлен только один вариант ДНК-полиморфизма (Msp I (-) - аллель) гена гормона роста, для которого показана положительная корреляция с одним из хозяйственно-полезных признаков, а именно, с жирностью молока. Но даже для этого варианта полиморфизма данные носят противоречивый характер. Для гена пролактина до-сих пор не выявлено вариантов ДНК-полиморфизма, которые бы имели достоверную ассоциацию с хозяйственно-полезными признаками, хотя для гена пролактина показано участие в регуляции лактации.
В связи с вышесказанным очевидна необходимость исследований ДНК-полиморфизма генов, участвующих в формировании хозяйственно-полезных признаков.
Целью данной работы было изучение ДНК-полиморфизма генов BoLA-DRB3, пролактина и гормона роста у разных пород крупного рогатого скота в связи с
устойчивостью к лейкозу и молочной продуктивностью. Для достижения указанной цели были поставлены следующие нижеперечисленные задачи:
Провести сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA~DRB3 у разных пород крупного рогатого скота.
Охарактеризовать выборки животных айрширской породы и черно-пестрой пород, различающиеся по своему статусу в отношении лейкоза (здоровые, инфицированные ВЛ КРС и больные персистентным лимфоцитозоы животные) по разнообразию аллелей гена BoLA-DRB3 и их частотам,
Исследовать полиморфизм гена гормона роста (ПЦР-ПДРФ по рестрицирующей эндонуклеазе М$р\) у нескольких пород крупного рогатого скота и монгольских яков.
Несколькими независимыми методами изучить ДНК-полиморфизм гена пролактина у разных пород крупного рогатого скота и монгольских яков.
Изучить связи различных аллелей исследуемых генов с хозяйственно-полезными признаками (показателями молочной продуктивности и устойчивостью к лейкозу).
*
Методы изучения главного комплекса гистосовместимости
Изучение главного комплекса гистосовместимости осуществляется как на уровне продуктов генов, так и па уровне изучения последовательности ДНК. Первоначально рассмотрим кратко методы изучения антигенов HLA,
Традиционно для типирования HLA-ангигенов применяют серологические методы с использованием антител реагирующих с генными продуктами ГКГ на клеточной поверхности лимфоцитов (Dyer, Martin,! 991), Эти методы основаны на получении моноспецифических антисывороток из сыворотки крови многократно рожавших женщин, в которой, как правило, содержатся антитела к антигенам мужа. Чрезвычайно широко применяют эти методы для типирования антигенов класса І в частности с применением микролимфоцитотоксичсского теста. В настоящее время для типироаания используют моноклинальные антитела, позволившие в ряде случаев подразделить суперспецифичности на субспецифичности или выявить новые специфичности (Lanchbuiyv 1991). Типируют серологически и антигены класса II (HLA-DQ, DR). Для типирования DQ, DR применяют метод смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ), успешное типирование IILA-DP проводят с помощью гомозиготных тест-лимфоцитов. Чувствительность метода СКЛ выше, чем серологического метода типирования HLA-DR, что способствовало выявлению большего числа аллелей. Типирование HLA-DQ аллелей названными методами было затруднено из-за сильного сцепления с HLA-DR локусом. Помимо этого, антигенные специфичности изучают с помощью изоэлектрофокусирования и двумерного электрофореза (Nepom etal.,1989, Lanchbury, 1991).
Непосредственное изучение последовательностей ДНК генов ГКГ предоставляет ряд преимуществ по сравнению с методами анализа белкового полиморфизма. Основные из них - это возможность анализа промоторных, интронных, 5 - и З -нетранслирумых последовательностей генов и межгениых нуклеотидпых последовательностей, возможность описания аллельных различий в кодирующей последовательности, а также возможность оценки скорости возникновения нуклеотидпых замен в последовательностях генов ГКГ у разных видов. Определение нуклеотидной последовательности для генов класса I показало существование дополнительных генов и псевдогенов в этом районе генома. Описана экзон-интронпая структура генов, отмечены случаи альтернативного сплайсинга (Auffray, Strominger, 1986). Высказано предположение, что псевдогены служат природным резервуаром генетического материала для событий типа конверсии генов и, таким образом, оказываются важным компонентом в механизмах, приводящих к разнообразию экспрессирующихся аллелей (Bell et aL, 1989), Итак, изучение локусов ГКГ на уровне ДНК открывает неизмеримо большие возможности для рассмотрения структуры, биологической роли и эволюции ГКГ, чем серологические методы. Применение методов изучения полиморфизма длин рестрикций иных фрагментов (ПДРФ) для генов ГКГ хорошо дополняет существующие серологические методы, но не заменяет их полностью. В случае HLA-DRB результаты ПДРФ-аналнза хорошо согласуются с серологическими методами и позволяют выявить несколько семей аллелей DR: DR3, DR6 и DR5 (входят в семейство DRw52), a DR4, DR7 и DR9 - в семейство DRw53. В дополиительную группу входят DR2, Dw2, Dvvl2 и AZH аллели. Варианты ПДРФ этих трех групп аллелей отличаются, что указывает на разные пути их происхождения (Bell ct aL, 1989). В связи с тесным сцеплением генов DQ и DR ПДРФ-анализ позволяет типировать целые гаплотипы с учетом аллелей в IILA-DRB, HLA-DQA и HLA-DQB что может быть использовано как Бысокоипформативпый метод при рассмотрении проблем популяционной генетики. Определение нуклеотидной последовательности генов ГКГ открыло возможность для применения чрезвычайно широко распространенного в молекулярной биологии метода полимеразпой цепной реакции (ПЦР), который позволяет синтезировать большие количества специфичных последовательностей ДНК- Метод ПЦР применяют в сочетании с рестрикционным анализом, или с последующим секвенировапием амплифицированных фрагментов. Метод ПЦР-апализа удобен также при изучении вариантов альтернативного сплайсинга в генах ГКГ (Crew et al., 1991), В этом случае в качестве матрицы в ПЦР используют кДНК, полученную с помощью обратной транскрипции (метод ОТ-ПЦР}. Так, этот метод был использован при изучении вариантов альтернативного сплайсинга в случае )ДВ4-нулевого гена (Sutton et al., 1990). Метод ОТ-ПЦР широко применеяется и для исследования ГКГ животных (Хи & Lewm, 1991; Samriento & Storb, 1990а, б). Метод ПЦР открывает большие возможности для популяциоипо-гепетических и сравнительно-эволюционных работ в отношении генов ГКГ, Так, ПЦР-анализ был применен в сочетании с последующим электрофорезом в градиентном денатурирующем геле и секвенированием продуктов амплификацип для изучения эволюции YZII&DQAI у шести видов приматов, включая помимо человекообразных обезьян шимпанзе и гориллы, также виды приматов Нового света, отделившиеся от предков человекообразных, около 40 миллионов лет назад. Поражает тот факт, что пранмеры, подобранные для амплификации последовательности полиморфного второго домена HLA-DQA, позволяют амплифицировать последовательности генов у столь отдаленных видов (цит. по: Удина, 1994). Применение метода ПЦР в исследованиях подобного рода позволяет, таким образом, изучать время возникновения полиморфизма и вызывающие его механизмы, оценивать скорость эволюции и степень консерватизма генов ГКГ па внутри- и межвидовом уровнях. В 70-х годах нашего столетия начались поиски ГКГ у крупного рогатого скота (Grosclaude, 1974)- Исследования были направлены на обнаружение генов ГКГ, способных влиять на иммунитет и резистентность к различным болезням, а также на выявление генетических маркеров хозяйственно-полезных признаков, связанных с продуктивностью. Независимо друг от друга рядом ученых (Spooner et al., 1978; Caldwell et al., 1979; Amorena, Stone, 1980), было доказано существование ГКГ у крупного рогатого скота и выдвинута гипотеза, согласно которой антигены ГКГ крупного рогатого скота контролируются кодоминаитпыми аллелями аутосомного локуса (Amorena, Stone, 1978;
Полиморфизм гена пролактина и методы его определения
Полиморфизм ДНК может быть определён различными способами, включая прямое определение нуклеогидной последовательности ДНК. Одним из первых для анализа полиморфизма ДНК был предложен метод, получивший название - полиморфизм длин рестрикциоппых фрагментов (ПДРФ) (Botstein et al.,i980). Метод заключается в обработке ДНК рестрицирующими эндонуклеазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов. Так как рсстриктазы имеют строго специфические места расщепления, то генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами (т.е. полиморфизм на уровне ДНК) приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК, а следовательно, к получению смеси продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться. Таким образом, полиморфизм ДНК будет тестироваться как полиморфизм длин рестрикциоппых фрагментов (ПДРФ или RFLP). Основной причиной, приводящей к возникновению полиморфизма ДНК, первоначально считались ючковые муіации, затрагивающие сайты узнавания тех или иных эндоиуклеаз рестрикции (Botstein et al.,1980). В последующих работах спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки, транспозиции мобильных генетических элементов и т. п„ Все эти факторы могут приводить, в конечном счете, к различиям в длинах гомологичных фрагментов из различных геномов, которые с точки зрения классического генетического анализа должны рассматриваться как множественные аллелытые формы.
Первоначально анализ ПДРФ проводили с использованием блот-гибридизации (Southern,1975). Данный метод можно разбить на несколько этапов : выделение ДНК; анализ ДНК, включая рестрикцию, электрофорез, блотгинг (перенос ДНК на мембрану); выбор и подготовка гибридизационных зондов; гибридизация и тестирование вступивших в гибридизацию фрагментов (цит. по: Сулимова, 1993).
Метод ПДРФ был использован для проведения исследования полиморфизма гена PRL у различных пород крупного рогатого скота (Camper et ah, 1984). Работа была проведена на выборках из 8 пород крупного рогатого скота. Полиморфизм гена изучался по 8 рестриктазам - Uglily EcoRl, Hindlll, Pvull, &swl, Тоді, ВатШ, Mspl с использованием гибридизационных зондов для 5 -нетраислируемой области и двух экзопов гена. Было показано, что ген PRL представлен одной копией гена. Были описаны три генотипа по гену PRL на основе анализа ПДРФ с использованием эндоиуклеазы ВатШ (два фрагмента - 16 kb и 20 kb)3 обусловленных наличием двух аллелей- Предполагается, что ВатШ -полиморфизм не связан со вставкой или делецией внутри интрона, т. к, при использовании других рестриктаз не было выявлено полиморфизма, а является результатом перестроек (точечных замен) в сайте рестрикции (Camper et al.,1984).
Аналогичным образом были идентифицированы 2 различных класса полиморфных фрагментов по Mspl и RsaL При этом пеожидангго оказалось, что две группы, далекие друг от друга в отношении направления селекции (герефордский скот - мясное направление, голштинский скот - молочное) не показали полиморфизма по гену PRL, а близкие в этом отношении джерсейская и гернсейская породы напротив дали различия (Camper et al., 1984). Диаллельный полиморфизм по Mspl был описан также другими авторами (Hallemian et al.,1988) у брахманского, герефордского, голштинского, джсрссйского скота и у Техасского лондгорна. Обнаружен полиморфизм гена PRL по рестрикгазе coRVy голштино-фризской породы (Hallercnan et al.,1988).
Разработка новых молекулярных методов (полимеразной цепной реакции (ПЦР или PCR) (Saiki et al., 1988) позволила модифицировать метод ПДРФ, облегчая работу и увеличивая эффективность. При натичии полиморфного сайта рестрикции внутри амплифицированного фрагмента синтезированные последовательности обрабатывают соответствующей рсстриктазой и затем анализируют электрофоретически (цит. по: Сулимова, 1993).
Методом полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией амплифицированного продукта (ПЦР-ПДРФ) было изучено несколько полиморфных областей в гене bPRL (Mitra et aL, 1995; Clirenek et al., 1998; Unanian et аЬД994). Так в работе Chrenek et ah (199S) исследован полиморфизм гена PRL с использованием эндонуклсазы Rsai, который, как было показано ранее (Lewin et ah,1992), обусловлен транзицией А - G в кодоне для 103 аминокислоты в экзоне III гена bPRL. Были выявлены два аллеля (А и В) у трех пород крупного рогатого скота (словацкая пестрая, словацкий шшцгау и герефордская), частота аллеля А составляла у них соответственно - 0,87, 0,68 и 0,95 (Chrenek et al., 1998). При этом генотип DB по гену PRL в данном исследовании у изучаемых пород не был найден (Chrenek et аЦ 1998), Тем же методом определен полиморфизм гена PRL у различных видов семейства Bovidae: сахивальского зебу (Bos indicus: Sahiwal zebu), буйвола (Bubalus bubalis: Муррей (Murrah) и Нили/Рави (Nili/Ravi), немецкой черно-пестрой и Брауншвейгской пород крупного рогатого скота. Частоты аллеля А гена PRL у сахивальских зебу, буйволов Муррей и Нили/Рави составили 0.51, 0,93 и 0,84 соответственно. У немецкой черно-пестрой и брауншвейгской пород частоты аллеля составили 0,80 и 0,61 соответственно (Mitra et al., 1995), У сахивадьских зебу найдены все три генотипа по гену PRL: АА, АВ и ВВ с частотами 0,19, 0,60 и 0.21 соответственно, У буйволов животные с генотипом ВВ не были выявлены (Mitra et al,, 1995).
В целом, следует отметить, что сведения о рестрикционном полиморфизме гена PRL крайне ограничены и представлены единичными работами, хотя ген PRL играет важную роль в регуляции лактации, как это рассматривалось в разделе 2.1.2 обзора литературы. Функции гена определяют его важную роль в формировании молочной продуктивности крупного рогатого скота. В литературе есть указания на связь одного из вариантов полиморфизма гена PRL9 обусловленного наличием делеции/инсерции в гене, с молочной продуктивностью голштинского скота (Cowan ct al., 1989). К сожалению, ничего не известно о связи с хозяйственно-полезными признаками других вариантов полиморфизма гена PRL. Возможно, это объясняемся низким уровнем информативности выявленных полиморфных вариантов гена, что приводит к необходимости поиска новых подходов анализа полиморфизма ДНК, а также тем, что кодирующие последовательности в гене PRL отличаются высокой консервативностью в сравнении с интронными последовательностями и фланкирующими областями гена (Camper et al., 1984).
Определение аллельных вариантов гън'д BoLA-DRB3t ассоциирующихся с устойчивостью или чувствительностью к лейкозу, с помощью аллельспецнфичной полимеразиой цепной реакции
Отмеченное снижение уровня гетерозиготності! у больных животных недостоверно. Однако одинаковая тенденция снижения уровня гетерозиготносте у больных животных в обеих породах позволяет нам предположить, что снижение гетерозиготности влияет на устойчивость к лейкозу как неспецифический фактор. Роль нсспецифического фактора (снижения уровня гетерозиготности по гену BoLA-DRB3) в снижении устойчивости к лейкозу в большей степени проявляется у айрширского скота в связи с более низким уровнем гетерозиготности как в суммарной популяции, так и у больных животных, по сравнению с соответствующими выборками чёрно-пёстрого скота. В изученной популяции черно-пестрого скота данный иеспецифический фактор также выражен, что предполагает дополнительное действие неспецифических факторов устойчивости к лейкозу на фоне специфических» К специфическим факторам устойчивости к лейкозу относится влияние аллелей, обусловливающих устойчивость С 11, 23 и 28) и чувствительность ( 8, 16, 22 и 24) к лейкозу (Xu et al„, 1993; Сулимова и др. 1995; Zanotti et al., 1996). Вероятно, за счет более низкого уровня гетерозиготности в суммарной выборке животных айрширской породы, по сравнению с черно-пестрой породой, влияние ранее изученных специфических факторов устойчивости к лейкозу выражено в меньшей степени, чем в изученной выборке черно-пестрой породы (Sulimova G.E. ct al., 1997). Можно предположить, что эффект снижения уровня гетерозиготности влияет на снижение устойчивости животных и в случае других заболеваний.
Отмеченная оценка выборочного инбридинга в группе вирусоносителей у айрширской породы (F= -0.172) указывает на вероятное действие отбора в сторону избытка гетерозигот в данной группе. Этот вывод представляет интерес в связи с противоположной тенденцией в группах больных персистентным лимфоцитозом животных и предполагает, что животные в группе вирусоносителей устойчивы к лейкозу. Группа вирусоносителей представлена на 2/3 животными, возраст которых превышает 5 лет. Кроме того, в данной группе широко представлены сочетания животных, представляющих собой пары мать-дочь по данным о родословных. Исключение из данной группы близкородственных животных не приводит к существенным изменениям профиля их частот и уровня гетерозиготности. Можно предположить» что в группе вирусоносителей наблюдается эффект иммунологической толерантности, который также может отчасти нивелировать действие специфических факторов устойчивости к лейкозу, а именно, влияние аллелей, связанных с развитием данной болезни.
Таким образом, относительно низкий уровень гетерозиготности и обеднение разнообразия аллелей могут приводить к неспецифическому снижению иммунитета. В связи с чем, в селекционной работе следует поддерживать полиморфизм по маркерам гистосовмссти мости , ідя іпбежапия отрицательных эффектов- связанных со снижением у pom IN іигсро -шіошосгм. иуіем использованстя большего количества (їьїков-нроичводшелси, гетерозиготных іто маркерам гистосовместимоети.
Ньгоорісн животных іійрширской породы, в ГЧЇМ числе группа ГІОЛЬНЬІХ персистеншым лимфоцит очом животных, были еопосіавленьї по молочной продуктивности (рис Л 5), Жирность молока в исследованных іруппах живої ных практически не отличались (4,36% :t 0.04) (Удина и др., 1998).
У больных анрнтирон доля высокопродуктивных коров (37.1%) выше, чем у здоровых (15.2%). Данный факт указывает на большую чувствительность высокопродуктивных короіі к леикозл крупного pdaioio скота. В гой связи, следует рекомендовать провелс:шс контроля ча поддержанием разнообразия но .маркерам гистоеогшееїимоети при проведении селекции па продуктивность 1 стадах крупного рогашю схота.
В представленной работе был исследован полиморфизм гена гормона роста {bGH)9 опнсаїшьга ранее как результат одновременной инсерции Т в позиции 1163 в транзиции C/G в позиции 1164 (интрон III), Указанный вариант полиморфизма тестируется методом ПЦР-ПДРФ по отсутствию сайта рестрикции для эндопуклеазы Mspl (аллель Mspl (-)) (Hoj et ah, 1993) (рис.16)- Нами был проведен анализ Мфї-полиморфизма гена bGHy красной горбатовской породы, монгольского скота и монгольских яков. В исследованной нами выборке монгольских коров (п=35) частота Mspl (-) аллеля составляла - 0,30, в выборке монгольских яков (п=32)- 0,94, а ЇЇ выборке красной горбатовской породы (п=20) 0,09.
Поскольку монгольский скот и монгольские яки ранее не исследовались по Mspl-полиморфизму гена bGH, необходимо было подтвердить, что мы тестируем ту же мутацию, которая была описана ранее. Нами был проведен анализ нуклеотидной последовательности амплифицированпого фрагмента ДНК у гомозиготных по Mspl (-) -аллелю особей. Секвепировапие было выполнено методом прямого секвенировапия ПЦР-продукта в лаборатории проф. Янковского Н,К. и на автоматическом секвенаторе в лаборатории проф, Иванова ПЛ. Данные по нуклеотидной последовательности фрагмента тестируемой полиморфной области rena hGH представлены на рисЛ7, 1 продуктов амплификации соответствующего участка гена bGH, включающего интрон III с отсутствующим сайтом рестрикции для эндонуклеазы Mspl (Mspl (-) аллель) у монгольского скота и яков и сопоставление полученных данных с нуклеотидной последовательностью соответствующего аплеля, описанного в работе (Lagziel et aL, 1999), показало, что рассматриваемые мутации не идентичны. Нами исследованы ДНК у двух монгольских коров, гомозиготных по Mspl (-) - аллелю и у трех монгольских яков, также гомозиготных по этому аллелю (рис.17). В результате сравнения их пуклеотидных последовательностей показана их абсолютная идентичность между собой.
Соответствующий фрагмент ДНК гена ЬСН, зарегистрированный под номером J00008 (Woychik et ah, 1982), отличается от изученных нами последовательностей лишь тем» что в указанном образце сайт рестрикции для Mspl (CCGG) присутствует (Mspl (+) - аллель), что соответствует наличию Т в положении 1162 (рис. 17)- В изученных нами нуклеотидпых последовательностях ДНК сайт рестрикции отсутствует, что обусловлено мутацией в положении 1162, в результате которой нуклеотид С заменен на Т. Аналогичная мутация была описана ранее (Yao et ah, 1996).
Наиболее подробно ранее изучена мутация» приводящая к исчезновению сайта рестрикции для Mspl как одновременная инсерция Т в позиции 1163 и замена C/G в позиции 1164 (Hoj et ah, 1993; Lagziel et ah, 1999). Однако как видно на рис.17, последовательности, фланкирующие Mspl сайт рестрикции по данным Lagziel et ah (1999), совпадают с остальными данными, за исключением делеции одного нуклеотида в положении 57. В результате эту мутацию молено рассматривать как трансверсию G/T и G/C в позициях 1163 и 1164 соответственно (рис. 17). Таким образом, на настоящий момент описано две мутации в сайте рестрикции для эндонуклеазы Mspl в интроне III гена bGH, приводящие к его отсутствию.
Ранее было сделано предположение (Lagziel et ah, 1996), что МїрІ(-)-аллель гена bGH имеет зебувидное происхождение. Частота Л&уЛ(-)-аллеля в различных породах крупного рогатого скота уменьшается с удалением от места происхождения зебувидного скота (Индийский полуостров) (Lagziel et ah, 2000) (Подробнее в главе 2 обзора литературы). На рис. 18 показаны частоты А1їрІ(-)-аллеля в различных породах в связи с их географическим происхождением па основании данных, приведенных в работе (Lagziel et ah, 2000). Однако, как мы уже указывали выше, существует, по крайней мере» два варианта Mspl (-)-аллеля. В цитируемой статье (Lagziel et ah, 2000) не указывается, какой из вариантов рассматривается. Не исключено, что для построения диаграммы использовались данные по частотам М у?1(-)-аллеля, тестируемого по наличию/отсутствию сайта рестрикции для Mspl и, следовательно, возможно в этой работе объединены данные по разным мутациям в этой области гена. Широкое распространение описанного нами варианта Mspl (-)-аллеля гена bGH у монгольских яков, сопоставимое с его частотой у зебу, и иной тип мутации, обусловленный транзицией Т/С в позиции 1162, позволяют предположить независимое присхождение Mspl (-)-аллеля гена bGHy яков.
Полиморфизм генов гормона роста и пролактина у крупного рогатого скота и монгольских яков
Ранее было сделано предположение (Lagziel et ah, 1996), что МїрІ(-)-аллель гена bGH имеет зебувидное происхождение. Частота Л&уЛ(-)-аллеля в различных породах крупного рогатого скота уменьшается с удалением от места происхождения зебувидного скота (Индийский полуостров) (Lagziel et ah, 2000) (Подробнее в главе 2 обзора литературы). На рис. 18 показаны частоты А1їрІ(-)-аллеля в различных породах в связи с их географическим происхождением па основании данных, приведенных в работе (Lagziel et ah, 2000). Однако, как мы уже указывали выше, существует, по крайней мере» два варианта Mspl (-)-аллеля. В цитируемой статье (Lagziel et ah, 2000) не указывается, какой из вариантов рассматривается. Не исключено, что для построения диаграммы использовались данные по частотам М у?1(-)-аллеля, тестируемого по наличию/отсутствию сайта рестрикции для Mspl и, следовательно, возможно в этой работе объединены данные по разным мутациям в этой области гена. Широкое распространение описанного нами варианта Mspl (-)-аллеля гена bGH у монгольских яков, сопоставимое с его частотой у зебу, и иной тип мутации, обусловленный транзицией Т/С в позиции 1162, позволяют предположить независимое присхождение Mspl (-)-аллеля гена bGHy яков. Исследование полиморфизма гена bGHt как уже рассматривалось ранее (глава 2 обзора литературы) имеет и практическое значение. Существует ряд независимых исследований, в которых были показаны ассоциации этого полиморфизма с молочной продуктивностью, жирностью и содержанием белка в молоке различных пород крупного рогатого скота. С наиболее высокой частотой Mspl(-) - аллель был представлен в линиях с высокими показателями по указанным выше признакам (Lee et al., 1993; Falaki et aL, 1996; Lagziel et al„ 1999, Hoj et aL, 1993). Кроме того, присутствие Mspl (-) - аллеля у конкретного животного положительно сказывалось на его молочной продуктивности и приводило к снижению количества соматических клеток в молоке (Lagziel et al., 1999). Однако полученные ассоциации не всегда носили однозначный хараюер (Yao et al., 1996). По данным Yao и др. (1996) мутация М$р\ (-) ассоциировалась с понижением продуктивности и жирности молока. Скорее всего это связано с двумя вариантами мутаций в сайте рестрикции Mspl,
Нами была показана чрезвычайно иысокая частота Msp\{-) - аллеля (0,94) у монгольских яков. Молоко изученной выборки яков имеет высокий процент жирности (средняя 6,5%, у отдельных животных до 8%).
Ранее методом SSCP і!";; чачеч аелиморфіпм 5-фланкирующего участка гена hPRl. на выборках ютіг иііек ого a a г.р. ндзекого етепта. При помощи 11ЦР был получен фрагмент длиной 16U kb и затем проводился SSCP анализ. У іолншінекон} скота были выявлены три аллеля і В, (\ /J) є частотами 0.25, 0.69 и 0.06 соответственно. V австралийского скота би і найден сміє однії а ілель .1 частота которого в работе не указана (Hart ct al,_ 1903). В крас;юл гориатовской породе нами были обнаружены только два аллеля В и D ( рпс. 0). Методом ППР-ПДРФ (р: 21) оьию мучено распределение частот аллелей гена hPRL, ои\елоилепных мо.лшшеїі Л-О традицией, ло шикающей в 103 кодине (лгюц 3) и приводящей к появленню полиморфно, о /Лї/і-саіігл. После обработки рестриктазой Rsal иыявляюся три геноіила живичних ію і ЄНУ , 7?/.: іеношпу АА соответствует продукт 156 плк; геттотчшу /18 150,Й2 u 74 и п.и L ::іич і n\ /№ - 8? и 74 п.п. (Milra et aL 1995).
Ранее в 5 области гена bPRL был выявлен методом ПЦР полиморфный микросателлитный динуклеотидпый повтор с аллелями (158 п.н.» !62 п.н, и 164 п.н) (MacHugh D.E. et аЦ 1997). Нами был использован этот метод для анализа полиморфизма гена bPRL. В качестве примера на рис,22 и 23 приведены электрофореграммы продуктов амплификации микросателлитно го локуса в 5 -области гена bPRL.
В выборке монгольских яков, так же как и в красной горбатовской породе все животные были гомозиготны по микросателлитпому локусу гена bPRL и содержали только аллель, соответствующие продукту амплификации длиной 162 п.н. Этот аллель является основным в изученных нами выборках, У монгольского скота присутствуют также аллели, которым соответствуют амплифицированные продукты длиной 158 и 164 п.н, (Рис.23).
Распределение частот полиморфных вариантов гена bPRL представлено в табл.11, Установлена более высокая средняя оценка информационного содержания полиморфизма для ПЦР-ПДРФ в экзоне 3 (Р1С= 0,26) по сравнению с оценкой для микросателлитного полиморфизма в регуляторної! области (Р1С=0,17) гена PRL для трех пород крупного рогатого скота и монгольских яков.
Для вариантов гена bPRLy выявляемых с помощью ПЦР-ПДРФ метода, отмечен более высокий уровень гетерозиготності!, чем для микросателлитного локуса (табл, 11), Гомозиготы по аплелю В встречались до сих пор только у зебувидного скота. Нами была обнаружена такая гомозигота в выборке монгольских коров (частота - 0,05). Вероятно генотип В/В не был выявлен ранее вследствие небольших размеров изучаемых выборок, а также из-за относительно низкой частоты встречаемости этого аллеля в породах вида Bos taurus. Внутри вида Bos taunts согласно литературным данным (Mitra et al., 1995; Chrenek ct al, 1998) наблюдались породы с частотами аллеля В, находящимися в двух диапазонах: 0,05 0,14 и 0,20 0,39 (таблЛ 2), Красная горбатовская и айрширская породы крупного рогатого скота относятся к группе пород с низкой частотой аллеля В гена bPRL а монгольский скот - к группе пород с высокой частотой 5-атлсля. Наибольшая частота встречаемости fi-аллеля была отмечена у зебу (0,49).
Таким образом, по аналогии с геном hGH можно предположить возникновение данной мутации у зебувидного скота, однако 5-аллель гена bPRL наблюдался также у представителей рода Bubalis, филогенетически более удаленных от зебу, по сравнению с яком (Bos grimniens) (Ritz et al., 2000) (рнс.24). У яков этой мутации обнаружено не было. Нельзя исключать возможность независимого возникновения 5-аллеля гена bPRL у зебу и буйволов.
Можно предположить, что генотип АВ имеет какое-то селективное преимущество, однако до сих пор не получено достоверных данных о каких-либо корреляциях с признаками молочной продуктивности.
Полное отсутствие гомозигот ВВ и ряде пород Bos taurus может предполагать тесное сцепление аллеля В гена bPRL с другим геном, который вероятно является рецессивной леталькх Возможность такого предположения подтверждается тем фактом, что ген bPRL локализован на 23 хромосоме и сцеплен с областью генов иммунного ответа (класса П) главного комплекса пістосовмсстимости крупного рогатого скота с частотой рекомбинации г = 0,040. Ранее было показано присутствие летатей в области главного комплекса гнстосовместимости, например, в t-области ГКГу мыши (цит. по Удина, 1994). Тем не менее, аллель В в гомозиготном состоянии выявлен у зебу (Bos indicus) и у монгольского скота, что предполагает отсутствие у них такого сцепления.В связи с тем, что пролактин яилястся регуляторным белком, стимулирующим лактацию, рост органов и тканей животных, этот ген может являться потенциальным маркером продуктивности у КРС, Таким образом, изучение аллельного полиморфизма геиа bPRL у крупного рогатого скота и родственных видов представляет большой интерес и требует дальнейших исследований.
Красная горбатовская порода (мясо-молочного направления селекции) характеризуется меньшим уровнем гетерозиготное по полиморфным вариантам гена bPRL по сравнению с айрширской и черно-пестрой породами (с высокой молочной продуктивностью) (Рис, 25),
