Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 13
1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире и в России
1.1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире 13
1.1.2. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в России 15
1.1.3. Характеристика распространенности лейкоза КРС в хозяйствах Брянской области 16
1.2. Экономический и социальный эффект от поражения КРС лейкозом
1.3. Строение вируса лейкоза, молекулярный механизм заражения клетки и размножения ВЛКРС, генетическое разнообразие ВЛКРС
1.4. Развитие персистентного лимфоцитоза, распространение вируса в популяции
1.5. BoLA - комплекс генов, определяющий устойчивость крупного рогатого скота к болезням
1.6. Генетический полиморфизм гена BoLA-DRB3, связанного с устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота 31
1.7. Генетический полиморфизм популяций быков производителей, используемых для разведения КРС в России
1.8. Генетические маркеры молочной продуктивности 39
1.8.1. Аллельный полиморфизм гена бета-лактоглобулина 40
1.8.2. Аллельный полиморфизм гена соматотропина 43
1.8.3. Аллельный полиморфизм гена пролактина 45
1.8.4. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина 46
2. Объекты и методы исследования 50
3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену BoLA-DRB3
3.1.1. Анализ аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ
3.2. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов
3.2.1. Сравнение быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов по генотипам гена BoLA-DRB3
3.3. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков- производителей разных пород Брянской области
3.3.1. Анализ генотипов по гену BoLA-DRB3 быков -производителей разных пород Брянской области
3.4. Аллельный полиморфизм быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности и качества молока
3.4.1. Анализ аллельного полиморфизма гена соматотропина у быков-производителей Брянской области
3.4.2. Анализ аллельного полиморфизма гена -лактоглобулина у быков-производителей Брянской области 92
3.4.3. Анализ аллельного полиморфизма гена пролактина у быков-производителей Брянской области
3.4.4. Анализ аллельного полиморфизма гена казеина у быков-производителей Брянской области 98
Заключение 101
Выводы 104
Предложения производству 105
Список использованной литературы 106
Приложения 127
- Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире
- Генетический полиморфизм гена BoLA-DRB3, связанного с устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота
- Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену BoLA-DRB3
- Анализ аллельного полиморфизма гена -лактоглобулина у быков-производителей Брянской области
Введение к работе
Актуальность проблемы.В последние два десятилетия в развитых странах Евросоюза, США, Канаде бурно развивается геномная селекция крупного рогатого скота, основанная на применении ДНК-технологий. Разработка ДНК-маркеров хозяйственно – ценных признаков позволилапроводить экспресс-оценкупоголовья на устойчивость к инфекционным заболеваниям и стрессорным факторам внешней среды, выявлять племенных животныхс высокимгенетическим потенциалом молочной и мясной продуктивности, высоким качеством продукции. Молекулярно-генетическая оценка племенного поголовья коров и быков является важнейшим этапом селекционной работы и при разведении скота.
В России также проводились работы по применению метода ДНК-маркеров для генотипирования коров по генам хозяйственно-ценных признаков. Так, изучалась генетическая устойчивость к вирусу лейкоза КРС коров из разных регионов страны (Сулимова, 1993; Удина и др., 2009; Эрнст, 2003), был изучен аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB,связанного с генетической устойчивостью животных к вирусу лейкоза крупного рогатого скота,у разных пород КРС (Шарифуллина, 2006; Быков,2009; Рузина, 2012; Козлов и др., 2012).В проведенных ранее исследованиях аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 в некоторых племенных хозяйствах Брянской области было выявлено 6-15% коров, несущих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии, и до 32% генетически устойчивых к вирусу лейкоза коров, имеющих генотипы У/Н и У/Ч (Кожевина и др., 2009; Смазнова и др., 2010; Козлов и др., 2011), что объясняет сравнительное благополучие этих хозяйств относительно распространенности лейкоза.
Особое значение для разведения крупного рогатого скота имеет генетическая оценка быков-производителей, используемых для производства семени на государственных племенных предприятиях (станциях). В настоящее время в литературе найдено немного работ по применению ДНК-маркеров для генетического анализа быков-производителей по устойчивости к лейкозу и генам молочной продуктивности.
Исследования по аллельному полиморфизму гена BoLA-DRB3быков-производителей разных пород из государственных племенных станций Краснодарского края, Московской, Ленинградской и Ростовской областей, Карелии, Финляндии, Норвегии были проведены в работах Ковалюк (2008), Сацука (2009), Мачульской (2009). В этих работах было показано существенное преобладание у племенных быков – производителей аллелей чувствительности к ВЛКРС, практически полное отсутствие быков, несущих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии, и незначительное количество быков с аллелями У в гетерозиготном состоянии - 11-14%.
Большое значение для повышения продуктивности молочного стада имеет генетический анализ быков по мажорным генам, влияющим на лактацию и качество продукции.Рядом авторов исследовался полиморфизм генов, определяющих молочную продуктивность: соматотропина, – лактоглобулина, пролактина (Сулимова, 2008; Гладырь, 2006; Дроздов, 2013), а также качество молока по гену каппа-казеина (Дроздов, 2013).
Целью настоящей работы является исследование быков-производителей разных пород Брянской области, быков черно-пестрой породы племенной станции ОАО «Невское» и быков голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству, по устойчивости к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), а также изучение генетического полиморфизма быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности.
Задачи исследования:
1. Провести анализ генетической устойчивости к ВЛКРС по аллелям гена BoLA-DRB3 быков-производителей разных пород из ОАО «Брянское» - Брянская госплемстанция;
2. Провести генотипирование по гену BoLA-DRB3 быков-производителей черно-пестрой породы из ОАО «Невское» - госплемстанция Ленинградской области;
3. Анализ генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 у быков - производителейголштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству;
4. Провести генотипирование быков - производителей разных пород Брянской области по генам, связанным с молочной продуктивностью и качеством молока:
- ген гормона роста,
- ген бета-лактоглобулина,
- ген пролактина,
- ген каппа-казеина.
Научная новизна.
Впервые был изучен аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков-производителей Брянской области разных пород: черно-пестрой, швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 был также изучен у быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород Ленинградской области (ОАО «Невское») и «ЖодиноАгроПлемЭлита» «НПЦ НАН Беларуси по животноводству».
Установлено, что у быков черно-пестрой породы преобладают аллели чувствительности и их частота увеличивается с ростом степени голштинизации. С увеличением уровня голштинизации наблюдается сужение аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3.
У быков производителей других пород выявлено преобладание нейтральных аллелей и снижение доли аллелей чувствительности.
Оценен потенциал быков - производителей из разных племпредприятийкак доноров генетической устойчивости к ВЛКРС.
Впервые изучен аллельный полиморфизм быков-производителей разных пород государственной племенной станции Брянской области по генам соматотропина, бета-лактоглобулина,пролактина, каппа-казеина.Оценен генетический потенциал молочной продуктивности быков-производителей Брянской области.
Практическая значимость работы. Результаты анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 у быков-производителей Брянской области являются основой для планирования племенной работы по обогащению поголовья КРС Брянской области аллелями устойчивости к ВЛКРС и повышению генетической устойчивости стад КРС к вирусу лейкоза. Оценка потенциала быков - производителей из разных племпредприятийкак доноров генетической устойчивости к ВЛКРС позволяет направленно использовать быков при разведении скота, устойчивого к лейкозу.
Оценка генетического потенциаламолочной продуктивности быков-производителей Брянской области по генам соматотропина, бета-лактоглобулина,пролактина, каппа-казеина позволяет планировать использование выявленных высокоценных особей в разведении скота, что приведет к повышению продуктивности молочного производства региона в целом.
Положения, выносимые на защиту.
1. Результаты анализа генетической структуры поголовья быков-производителей разных пород крупного рогатого скота ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области по аллелям гена BoLA-DRB3.
2. Сравнение генетической структуры поголовья быков-производителей разных пород крупного рогатого скота ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области по аллелям генов молочной продуктивности.
3. Сравнительная характеристика аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 поголовья быков-производителей черно-пестрой и голштинскойпороды крупного рогатого скота ОАО «Брянское», ОАО «Невское» - государственной племенной станции Ленинградской области и «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ НАН Беларуси по животноводству.
Апробация работы.Материалы исследований доложены и обсуждены на следующих конференциях:
Всероссийская выставка «Золотая осень», 2012 год – бронзовая медаль, 2013 год – серебряная медаль; Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2010; Научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал молодежи на службу России», Брянск, 2011; «Международная научно-практическая конференция «Трансфер инновационных биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, медицине, экологии», Брянск, 2012; III и IV региональная научно-практическая конференция молодых исследователей и специалистов «Приоритетные направления современной науки: фундаментальные проблемы, инновационные проекты», Брянск, 2012, 2013;Международная конференция ученых «Трансфер инновационных биотехнологий в селекции растений, экологии, растениеводстве, животноводстве». Республика Беларусь, г. Брест, 2012; II Среднерусский экономический форум. Выставка-презентация инновационных проектов молодых ученых и специалистов Центрального федерального округа и диалога с экспертами «Молодежь в инновационном пространстве. Идеи молодых в оценке компетентных профессионалов» Курск, 2013;VІІI Международная научная конференция "Факторы экспериментальной эволюции организмов", Украина, Алушта, 2013; Международная научно-практическая конференция «Научное обеспечение инновационного развития животноводства», Жодино, Беларусь, 2013; - на конкурсе УМНИК Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; - на Всероссийской выставке-форуме РосБиоТех-2012.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материал и методика проведения исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа содержит 9 таблиц и 35 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 196 источников, из них 152 на английском языке.
Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире
Эпизоотическое благополучие в стадах крупного рогатого скота – одна из наиболее актуальных проблем современного животноводства. Персистентный лимфоцитоз (лейкоз, лейкемия) является широко распространенным и опасным вирусным заболеванием крупного рогатого скота в разных странах, в том числе и в России (Гулюкин, 2008; Ковалюк и др., 2012; Эрнст, Зиновьева, 2008).
Впервые в мире лейкоз крупного рогатого скота был диагностирован О. Зидамгродским в 1878 году при исследовании опухолевых поражений у павших животных черно-пестрой породы остфризского происхождения в Восточной Пруссии (цит. по Гулюкин, 2008). Поскольку для повышения продуктивности аборигенных пород на фермы разных стран Европы завозили высокопродуктивных животных из Пруссии, лейкоз распространялся среди завозимых и местных пород скота вследствие перезаражения последних. В то время не была неизвестна природа заболевания и не были разработаны лабораторные гематологические методы исследования животных, выводы о заболеваемости животных делали только на основании вскрытия павших и вынужденно убитых животных и их количества.
В масштабных исследованиях с применением иммунологических методов было показано, что вирус лейкоза КРС распространен в Европе, Азии, Америке, Африке, Австралии. В разных странах Восточной Европы эта болезнь широко распространена Подробная информация об эпидемиологической ситуации в США была собрана NAHMS (National Animal Health Monitoring). Исследования, проведенные в 2007 году, показали, что 83,9% молочного стада США были серопозитивными по ВЛКРС (то есть животные являются вирусоносителями). Последние эпидемиологические данные по нескольким провинциям Канады указывают на высокую распространенность ВЛКСР, которая доходит до 89% в крупных стадах и составляет 20,8% - 37,4% в индивидуальных хозяйствах.
В Южной Америке в Колумбии, Венесуэле, Чили и Уругвая было зарегистрировано вирусоносительство на уровне 34 - 50%. В Аргентине на небольших фермах и в крупных стадах уровень распространения вируса составил до 32,8% и 84% соответственно. В Бразилии распространенность вируса значительно варьирует между отдельными регионами и достигает уровня свыше 50% (Rodrguez et al, 2011).
Эпидемиологическая ситуация в Азии остается неопределенной. Международная организация по борьбе с эпизоотиями (International Organization of Epizootics (OIE) признает, что ВЛКРС присутствует в Индонезии, Китае и Монголии. Удивительно, что в Камбодже и на Тайване серопозитивными были только около 5% животных. Вирусоносительство в Японии оказалось на уровне 28,6% и 68,1% на мелких стадах и крупных фермах. В Корее уровень поражения животных в мелких хозяйствах превысило 50%, при этом 86,8% крупного молочного стада были инфицировано (Рузина, 2012).
В странах Ближнего Востока распространенность ВЛКРС-инфекции несколько ниже, чем в других регионах мира - около 20%. Исключения в этом регионе - Турция и Иран, где распространенность вируса в крупных стадах составляет до 48,3% и 64,7%, соответственно (Rodrguez et al., 2011).
В странах Европы с высоким уровнем животноводства, а также в Беларуси лейкоз искоренен, что свидетельствует о возможности борьбы с этой инфекцией. В странах Западной Европы благодаря масштабным и дорогостоящим программам, направленным на искоренение ВЛКРС – инфекции, животноводческие фермы оздоровлены от этого патогена. Недавно страны – члены ЕЭС официально объявили, что большинство ее государств-членов свободны от этого вируса. 1.1.2. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в России
В России до середины прошлого ХХ века ветеринарные врачи не имели представления о существовании лейкоза КРС как нозологической единицы (Апалькин и др., 2005). После Великой Отечественной войны вследствие массового завоза неблагополучного скота из стран Европы по контрибуции болезнь получила повсеместное стационарное распространение. В 1958 году в стране были созданы научные учреждения по данной проблеме и отделы по диагностике лейкоза КРС при ветеринарных лабораториях. Однако проведение лишь клинико-гематологического анализа не могло позволить установить истинную степень поражения поголовья скота лейкозом. Начиная с 1980 года, поголовье скота в стране стало исследоваться комплексным гематологическим и серологическим методами.
В докладе Федеральной службы по ветеринарному надзору России констатируется факт, что лейкоз занимает второе место в десятке заболеваний, составляющих 80% неблагополучия в хозяйствах, где разводится крупный рогатый скот. Количество больных животных в хозяйствах Российской Федерации возросло в период с 2002 года по 2010 год с 695.9 тыс. голов до 936.2 тыс., с 1990 г. по 2008 г. количество животноводческих хозяйств, неблагополучных по лейкозу, возросло с 1476 до 2309, при этом в 2008 г. оздоровлено 292 неблагополучных пунктов, выявлено новых – 190. В 2008 году исследование по РИД 12984 тыс. животных выявило почти 1120 тыс. РИД-положительных животных (8,6%), что отражает высокую степень пораженности скота лейкозом.
В 2009 году выявлено 152 первичных пункта, в 2010 г. – 248, в 2011 г. – 117. В ряде субъектов Российской Федерации в ряде товарных хозяйств заболевание лейкозом КРС составляет до 40%, вирусоносительство – до 70%, лейкоз приобрел характер эпизоотии, в отдельных хозяйствах некоторых регионов России уровень поражения КРС лейкозом составляет 90% (Гулюкин и др., 2008; Ковалюк и др., 2011). На 2009 на территории России 8 регионов имело от 101 до 182 неблагополучных по лейкозу хозяйств, высокий уровень поражения животных лейкозом наблюдается в Московской, Владимирской, Кировской, Новосибирской областях, Краснодарском и Алтайском краях, Татарстане и других регионах. То есть, даже очень благополучные, экономически регионы могут иметь высокий уровень заражения поголовья скота лейкозом. В 18 областях Центрального Федерального округа в 2008 году было 526 неблагополучных пункта, при этом за год был оздоровлен 81 пункт (частично из-за ликвидации хозяйства), и в то же время был зарегистрирован 21 новый неблагополучный пункт (Гулюкин и др., 2008).
Генетический полиморфизм гена BoLA-DRB3, связанного с устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота
Определяющую роль в генетической устойчивости коров к лейкозу играет ген BoLA-DRB3, аллели которого отвечают за восприимчивость или устойчивость животного к вирусу лейкоза. Ген BoLA-DRB3 обладает высоким уровнем полиморфизма и экспрессии (Groenen et al., 1990; Klein J., O hUigin, 1995; Mikko, Andresson, 1995; Russell et al., 2004). Разные аллели данного гена играют неодинаковую роль в развитии лейкоза у КРС (van Eijk et al., 1992; Xu A. et al., 1993; Sulimova et al., 1995; Zanotti et al., 1996; Удина и др., 1998; Aida et al. 2000; Juliarena et al. 2008).
Среди пород КРС России ген BoLA-DRB3 представлен 54 аллелями (или более, согласно последним данным), из которых 3 определяют устойчивость к вирусу, а 4 связаны с восприимчивостью. Показано, что животные, несущие аллели 11, 23, 28 - устойчивые (У), они не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза. В частности, Сулимовой Г.Е. на большой выборке было показано, что 11, 23, 28 аллели гена BoLA-DRB3.2 являются устойчивыми к лейкемии. Животные, несущие в своем генотипе аллели 22, 24, 16, 8, являются чувствительными и наиболее часто оказываются в выборке гематологических больных. Остальные аллели являются нейтральными (Н) и не связаны ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу (Сулимова и др., 1995). Носители аллелей устойчивости гена BoLA DRB3 не заболевают лейкемией, несмотря на возможное вирусоносительство. Исследованиями было доказано, что аллели устойчивости имеют доминирующее положение, и животные, несущие их в гетерозиготном состоянии, не заболевают лейкозом (van Eijk et al., 1992).
При анализе нуклеотидной последовательности аллелей гена BoLA-DRB3 Xu (1993) было показано, что у всех устойчивых аллелей в 70-71-м положении находятся аминокислоты Glu-Arg. Эти аминокислоты входят в антиген-узнающий сайт молекул II класса МНС, определяют специфичность взаимодействия с антигеном и развитие полноценного иммунного ответа.
У всех аллелей, определяющих чувствительность к лейкозу, в 75-78 положении имеется аминокислотная последовательность Val-Asphryr(Val), расположенная в месте связывания с рецепторами Т-клеток.
Лейкоцитарные антигены крупного рогатого скота имеют молекулярную структуру, показанную на рис. 3 (Kaufman et al., 1994). Они содержат несколько структурных доменов, включающих 2 высоко полиморфных домена 1 и 2, которые образуют антигенсвязывающий сайт, иммуноглобулинподобный домен 3, который соединяется с -микроглобулином, а также трансмембранные и цитоплазматические домены (Janeway et al., 2004).
Антигены I класса (гликопротеины) располагаются на поверхности всех ядерных соматических клеток, наибольшая их концентрация отмечается на лимфоцитах и макрофагах. Их основная функция заключается в представлении антигенных пептидов CD8+ T-клеткам. Они в свою очередь секретируют цитотоксины, которые убивают опухолевые и инфицированные вирусом клетки, а также клетки чужеродных трансплантантов, но сами при этом выживают (Rammensee et al., 1995; Behl et al. 2012).
Meirom R. et al. (1993) установлено, что у больных персистентным лимфоцитозом животных количество лимфоцитов с несвязанными рецепторами намного выше, чем у животных без гематологического проявления заболевания.
Результаты генетического анализа стад основных молочных пород свидетельствуют о том, что инфицированность животных ВЛКРС не связана с генетическими факторами (Гаврилов, Шишков, 1983; Эрнст, Шишков, 1984), т.е. практически животные почти всех пород при определенных условиях могут быть заражены вирусом. Установлено также, что инфицированные животные необязательно болеют лейкозом; частота заболевания в значительной степени зависит от генотипа, то есть, клиническому и патоморфологическому проявлению болезни способствует генетическая предрасположенность и иммунологическая недостаточность организма.
Генетический полиморфизм популяций быков – производителей, используемых для разведения КРС в России
При селекционном отборе племенных животных главными параметрами, по которым производится оценка и отбор перспективных особей, особенно быков-производителей, являются высокая молочная продуктивность, качество молока (содержание белка и жира) и показатели здоровья, в частности, устойчивость к инфекционным болезням.
В развитых европейских странах, откуда в Россию поступает племенной скот (нетели и бычки) и сперма для ведущих племенных хозяйств, отсутствует проблема лейкоза, поэтому в селекционных программах этих стран не учитывается генетическая устойчивость КРС к лейкозу, и поступающие в Россию племенные животные и сперма не могут быть оценены по этому параметру, и могут иметь гены восприимчивости к вирусу лейкоза КРС.
Основной вклад в генетический прогресс или регресс популяции вносят быки – производители, поскольку потенциал воспроизводства у быков несравнимо выше, чем у коров, которые приносят в среднем по 1 теленку в год. Современные технологии производства семени позволяют получать от быков по 50-70 тыс. доз спермы в год, и ежегодно можно получать по 15-20 тыс. телят с высокими племенными качествами. Поэтому генетический анализ быков по совокупности хозяйственно-ценных признаков очень важен для их отбора в селекционно-племенной работе, направленной на повышение молочной и мясной продуктивности, качества продукции, устойчивости к инфекционным болезням, а также неблагоприятным факторам внешней среды. Генетические исследования быков-производителей из Московской, Ленинградской и Ростовской областей, Краснодарского края, Карелии, Финляндии, Норвегии по гену BoLA-DRB3 были проведены в работах Ковалюк (2008), Сацук (2009), Мачульской (2009). В этих работах было проведено генотипирование быков-производителей голштинской и черно-пестрой пород по гену BoLA-DRB3, изучена частота аллелей чувствительности и устойчивости к ВЛКРС (Ковалюк, 2008; Сацук, 2011; Мачульская, 2012).
При генетическом анализе 607 быков – производителей голштинской (n=142) и черно-пестрой (n=107) пород, используемых в системе искусственного осеменения в Краснодарском крае и Ростовской области, было выявлено, что они имеют очень высокий уровень Ч/Ч генотипов – 38% и 41%, соответственно, и Ч/Н (29% и 30%). Самая малочисленная группа имела генотип У/У (по 4%). Быки – производители черно-пестрой породы (n=46) из ОАО «Московское» имели соответственно 55% Ч/Ч, 20% Ч/Н и 2% У/У (Ковалюк, 2008).
В работе Сацука (2009) были изучены аллельные профили быков из различных племенных предприятий России: ОАО «Московский», ОАО «ГЦВ», ГУПП РК «Карелиягосплем», ОАО «Краснодарское», ОАО «Невское». Для каждого из этих племпредприятий характерны свои источники поступления быков – производителей. Например, в ОАО «Московское» из 57 быков голштинской породы 35 имеют немецкое происхождение, 13 – американское, 7 – российское и 2 – канадское. Напротив, большинство быков ОАО «ГЦВ» родились в России (54 из 82), 17 поступили из Дании, 9 – из Голландии, 2 – из Канады.
Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену BoLA-DRB3
Изучение генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза КРС методом ПЦР-ПДРФ основано на определении генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 и выявлении аллелей, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к ВЛКРС и ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу.
Метод ПЦР-ПДРФ для анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 животных включает несколько этапов работы:
На этапе выделения ДНК из спермы быков был проведен электрофорез ДНК (рис.10), на рисунке видно, что использованная методика позволяет получать образцы ДНК с выровненной концентрацией ДНК.
На этапе проведения ПЦР с праймерами к гену BoLA-DRB3 были получены фрагменты длиной 284 п.о., реакция проходит количественно, электрофорез продукта амплификации позволяет продемонстрировать близкие концентрации получаемого продукта. На рис. 11 видно, что в ПЦР с геномной ДНК из образцов спермы прошла хорошо, в геле видна полоса ДНК с ожидаемым размером 284 п.о., яркость полосы свидетельствует о достаточном количестве в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразы, правильном составе буфера для полимеразной реакции.
После рестрикции фрагмента 284 п.о. ферментами Rsa I, Hae III, Bst X2I проводится электрофорез продуктов рестрикции в полиакриламидном геле (ПААГ). Рисунок 10. Электрофорез геномной ДНК из образцов спермы в 1% агарозном геле
Фрагмент 284 п.о. далее расщепляли рестрицирующими эндонуклеазами Rsa I, Hae III и/или Bst X2I, с последующим разделением полученной смеси фрагментов ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и определением длин рестрикционных фрагментов (рис. 12, 13, 14). Различия в нуклеотидной последовательности различных аллелей гена BoLA-DRB3 (т. е. полиморфизм на уровне ДНК) лежат в основе различного распределения сайтов рестрикции фрагмента 284 п.о., поэтому аллельный полиморфизм ДНК будет проявляться как полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Для определения генетической устойчивости КРС к лейкозу необходимо выявить наличие аллелей гена BoLA-DRB3, ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу. Аллельные варианты гена определяли по наличию или отсутствию указанных сайтов рестрикции согласно ранее полученным таблицам.
Для определения аллелей гена BoLA-DRB3 на основе данных рестрикционного анализа используют таблицу 1. 3.2. Аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов
Основная разводимая в Брянской области порода КРС – черно-пестрая голштинизированная, сильно подвержена инфицированию вирусом лейкоза КРС. Изучение аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород имеет важнейшее значение для развития молочного животноводства.
Нами было проведено генотипирование по гену BoLA-DRB3 быков – производителей черно-пестрой и голштинской пород из ОАО «Брянское» по племенной работе (29 голов), ОАО «Невское» по племенной работе (Ленинградская область) (29 голов), НПЦ НАН Беларуси по животноводству» (г. Жодино Минской области) (12 голов), откуда завозится сперма для племенных и товарных молочных хозяйств Брянской области.
Проведен анализ распределения частот аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как следует из данных таблицы 2, быки из 3 разных регионов имеют в совокупности 17 разных аллелей из 54 возможных. При этом наблюдается значительное преобладание в этих популяциях быков-производителей, несущих аллели восприимчивости к вирусу лейкоза. Наибольшее количество животных несет аллели восприимчивости к вирусу лейкоза КРС 22, 24 и в меньшее количество быков - 8. Общее количество аллелей восприимчивости к лейкозу изменяется от 60,3% в Брянском стаде до 67,2% в Ленинградской области и до 70,86% у белорусских быков.
Распределение аллелей гена BoLA-DRB3 у быков – производителей показано на рисунках 15, 16, 17.
Анализ аллельного полиморфизма гена -лактоглобулина у быков-производителей Брянской области
При анализе структуры по гену - лактоглобулина стада быков-производителей разных пород использовали методику Medrano и методику Гладырь.
Для генотипирования стада по методике Medrano получают продукт ПЦР гена – лактоглобулина размером 247 п.о. (рисунок 27), который при рестрикции Hae III позволяет выявить 3 генотипа быков: генотип АА имеет фрагменты 148 п.о. и 99 п.о.; генотип АВ имеет фрагменты 148, 99, 74 и 74 п.о.; генотип ВВ – 99, 74, 74 п.о. (рисунок 28).
Рисунок 27. Анализ продуктов ПЦР гена – лактоглобулина по методике Medrano М27 – маркер молекулярных масс; 28-39 - исследуемые образцы
Фрагмент ДНК размером 1248 п.о., полученный при проведении ПЦР по методике Гладырь, показан на рисунке 29. Рестрикция с помощью эндонуклеазы Pvu II выявила наличие A, В аллелей LG у различных пород КРС (рисунок 30).
Полученные данные свидетельствуют о том, что оба метода позволяют оценить аллельный полиморфизм гена – лактоглобулина изученной выборки быков, частота аллелей А и В, полученная по разным методикам, достаточно близка. Аллель В выявлена у всех 5 пород, ее частота превышает 60% у всех пород, кроме швицкой. Генотипы, имеющие В-аллель, составляют большинство у всех пород, причем в гетерозиготном состоянии их более 50% у всех пород, кроме абердин-ангусов. Аллель А отсутствует у быков абердин-ангусов, при использовании методики Медрано. По методике Гладырь был выявлен 1 бык, имеющий гетерозиготу АВ.
При анализе коров различных пород исследователи (Дроздов, 2013; Гладырь, 2001) выявили аллели А и В у всех пород, при этом частота их встречаемости у исследуемых животных была близкой, кроме красной горбатовской породы. Частота генотипа АА была наивысшей у якутского скота (18,75%). Частота встречаемости гомозигот ВВ была максимальной в швицкой (31,25%), а минимальной в якутской (15,62%) породах. В группах быков чёрно-пёстрой и голштинской пород не было выявлено значительных различий в частотах гомозиготных генотипов АА и ВВ (Яковлев и др., 2002). При оценке полиморфизма гена бета-лактоглобулина у коров абердин-ангусской и украинской красно-пестрой молочной пород отмечено значительное преобладание частот встречаемости аллеля В по сравнению с аллелем А (Арнаут, 2008).
Ранее на красной горбатовской породе была выявлена тенденция к превосходству животных с гомозиготным АА генотипом над особями с генотипами АВ и ВВ как по удою, так и по жиру. Полученные по продуктивности животных молочного типа швицкой породы результаты указывают на возможное преимущество коров с АА генотипом – лактоглобулина над АВ и ВВ по удою, хотя АС гетерозиготы показывают наивысшую продуктивность по первой лактации. Коровы швицкой породы, молочного типа с генотипом ВВ – лактоглобулина со средними удоем 5399, имеют наивысшее процентное содержание жира и белка в молоке – 4,06 и 3,39%.
Анализ аллельного полиморфизма гена пролактина у быков-производителей Брянской области
Рисунок 31. Электрофорез в 1% агарозном геле продуктов ПЦР гена пролактина. М27 – маркер молекулярных масс; 5-14 - исследуемые образцы
При проведении полимеразной цепной реакции получен фрагмент ДНК гена пролактина длиной 156 п.о. (рисунок 31), который был рестрицирован с помощью эндонуклеазы RsaI. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле продуктов выявил 2 аллеля - А и В. Генотип АА имеет фрагмент 156 п.о.; генотип АВ составляют фрагменты 156, 82 и 74 п.о. (рисунок 32).
Генетическая структура поголовья быков – производителей разных пород ОАО «Брянское» по гену пролактина показана в таблице 8. Как показывают полученные результаты, быки молочных пород в основном имеют генотипы с аллелем А, обнаружено лишь 1 животное с генотипом ВВ. 3 быка абердин-ангусской мясной породы имеют генотип АВ.Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина (CSN3) первоначально изучался на уровне белков. Казеины – белки молока, секретируемые клетками молочной железы. В период лактации на их долю приходится до 80% от всех белков, синтезируемых этими клетками.
Возрастающее значение переработки молока и получения кисломолочной продукции диктует необходимость использования генетических методов для повышения экономической эффективности производства, в частности, сыроделия. Экономически важным селекционным критерием для молочных пород крупного рогатого скота является генотип племенных коров и быков по каппа-казеину. Во многих развитых странах селекция на В-аллель CSN3 включена в селекционные программы по разведению КРС. Тестирование A-и В- аллелей представляет интерес с точки зрения практики, так как молоко коров с В-аллелем каппа-казеина имеет по сравнению А-вариантом лучшую температурную устойчивость, более короткое время коагуляции, лучшую свертываемость и содержит мицеллы различной величины, что предпочтительнее для производства сыров. Выход сыра из молока коров с ВВ-генотипом на 10% выше, чем из молока с АА-генотипом. Наличие В-аллеля CSN3 не только способствует увеличению выхода и качества сыров, но и коррелирует с другими ценными показателями молочной продуктивности (белковостью, удойностью).
Генотипирование быков – производителей разных пород ОАО «Брянское» включает 2 этапа: проведение ПЦР для амплификации фрагмента ДНК длиной 228 п.о. и его рестрикцию с помощью эндонуклеазы Hinf I. Результаты приведены на рисунке 33 и в таблице 9.
На рисунке 33 показан результат электрофореза фрагментов ДНК -продуктов рестрикции гена каппа-казеина в 6% полиакриламидном геле. Генотип АА составляют фрагменты 135 и 93 п.о.; генотип АВ составляют фрагменты 228, 135 и 93 п.о.; генотип ВВ – 228 п.о.
