Введение к работе
[ ^7 Ч О^*
Актуальность проблемы
Хламидии являются облигатными внутриклеточными паразитами, вызывающими широкий спектр заболеваний у человека, животных и птиц. Хламидиозы отличаются большим полиморфизмом клинических проявлений и отсутствием специфических симптомов. У человека хламидии являются возбудителями трахомы, венерической лимфогрануломы, заболеваний урогенитального и респираторного тракта, конъюнктивитов, зоо- и орнитоантропонозных заболеваний. В последнее время с этими бактериями связывают развитие сердечно-сосудистых патологий, атеросклероза, болезни Альцгеймера, некоторых форм артритов и бронхиальной астмы. Однако истинная роль хламидии в патогенезе многих заболеваний остается невыясненной, в том числе по причине отсутствия простых и надежных средств детекции, идентификации и дифференциации хламидии, учитывающих современный уровень знаний об их биологическом разнообразии.
Фундаментальные исследования генетической вариабельности хламидии, проведенные в 1999 г. д-р K.D. Everett и др. [Everett KD, et.al.(1999)], позволили предложить новую классификацию представителей порядка Chlamydiales. Согласно новой классификации к одному виду хламидии были отнесены только те штаммы, нуклеотидные последовательности генов 16S и 23S рРНК которых имели степень гомологии более 97%. Штаммы, имеющие более высокий показатель генетической дивергенции, были выделены в самостоятельные виды. В результате вместо 4 идентифицированных до введения новой классификации видов в семействе Chlamydiaceae было выделено 9 видов, разделенных на 2 рода - Chlamydia и Chlamydophila. Род Chlamydia включает 3 вида: С.trachomatis, C.suis и C.muridarum; род Chlamydophila включает 6 видов: C.pneumoniae, Сресогит, С.abortus,
:тербург луУ »
C.psittaci, C.felis, C.caviae. Следует подчеркнуть, |Чіо^нивьі^видьі йди
РОС. НАЦИОНА БИБЛИОТЕКА С. Петербург ОЭ
л*ч^« """'АЛЬНАя І
образованы за счет реклассификации видовой принадлежности ранее известных штаммов.
В связи с кардинальным изменением таксономии хламидий разработанные ранее генетические и иммуноферментные методы видоспецифической детекции и дифференциации в большой мере утратили видовую специфичность. Таким образом, единственным надежным способом видовой идентификации хламидийных штаммов стал метод секвенирования фрагмента гена, кодирующего 16S рРНК хламидий.
Метод ГЩР с последующим анализом структурного полиморфизма полученных ампликонов в течение последнего десятилетия зарекомендовал себя как эффективный способ генотипирования микроорганизмов. В частности, этот метод успешно использовался для анализа генетической гетерогенности представителей семейства Chlamydiaceae. На его основе был создан ряд систем, направленных на анализ видовой и внутривидовой вариабельности хламидий, но подавляющее большинство из них были разработаны в соответствии с положениями старой таксономии Chlamydiaceae и в настоящее время не позволяют провести адекватную видовую идентификацию патогена.
Разработка новых систем генетической дифференциации и идентификации сдерживается недостаточным объемом данных о видовой вариабельности генов хламидий, и крайне ограниченным набором .генов, последовательности которых известны для всех видов семейства Chlamydiaceae.
В сложившейся ситуации расширение исследований генетической вариабельности хламидий и создание надежного и простого метода практической идентификации и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae является актуальной задачей фундаментальной и практической микробиологии.
Цель исследования
Целью настоящей работы было изучение структурных особенностей генов хламидий и создание метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов, основанного на методе амплификации ДНК генома хламидий с последующим анализом структурного полиморфизма полученного ампликона.
Задачи исследования
Для достижения поставленной цели нами был определен ряд задач:
На основе компьютерного анализа известных нуклеотидных последовательностей генов хламидий провести выбор оптимальной генетической мишени для разработки метода видовой дифференциации хламидий.
Создать банк рекомбинантных плазмид, содержащих выбранную в качестве мишени область ДНК референс-штаммов всех видов семейства Chlamydiaceae.
Определить нуклеотидные последовательности выбранной генетической мишени у тех видов хламидий, для которых она не известна.
Провести анализ вариабельности нуклеотидной последовательности выбранной генетической мишени у всех видов Chlamydiaceae.
Разработать систему ПЦР, обеспечивающую специфическую амплификацию маркерной области генетической мишени у всех видов семейства Chlamydiaceae.
Разработать метод видовой генетической дифференциации видов хламидий, основанный на видовом своеобразии' нуклеотидных последовательностей выбранной генетической мишени.
Апробировать методику специфической детекции и видовой дифференциации на коллекции изолятов хламидий.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые определены нуклеотидные последовательности гена отр2 C.suis и C.felis, которые были заложены в Банк нуклеотидных последовательностей GenBank.
Клонированы значащие участки (около 97%) гена отр2 представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae.
Разработан оригинальный способ детекции представителей семейства Chlamydiaceae методом ПЦР-амплификации.
Разработан новый для клинической микробиологии методический подход для оценки генетической вариабельности микроорганизмов, основанный на электрофоретическом анализе рестриктов ПЦР-продуктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.
Разработан метод идентификации и дифференциации видов семейства Chlamydiaceae в соответствии с современной таксономией Chlamydiaceae, который позволяет в короткие сроки и без существенных материальных затрат проводить идентификацию и видовую дифференциацию штаммов хламидий и может использоваться для определения видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценки соответствия контрольных штаммов хламидий данным сертификата соответствия, генотипирования имеющихся музейных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства Chlamydiaceae, а также для решения других задач клинической микробиологии.
С помощью разработанного метода проведено генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий, полученных из коллекции ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Внедрение
Получено авторское свидетельство на изобретение №2205876 от 10.06.03 «Способ диагностики хламидийной инфекции (варианты)».
Апробация работы
Результаты исследования доложены на 9-м Европейском конгрессе по Клинической микробиологии и инфекционным болезням (Берлин, 1999г.), 3-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине", посвященной памяти М.М. Авербаха (Москва, 2000г.), на отчетной конференции института Молекулярной генетики РАН (Москва, 2001г.), на конкурсе аспирантских работ на стипендию фонда «Будущее Молекулярной Генетики» (Москва, 2001г.), на межлабораторном семинаре отдела медицинской микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва, 2002г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 - в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 101 странице машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 123 источника, из них 18 отечественных и 105 иностранных.
Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. С.С.Ямниковой ( ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) за предоставление коллекции хламидийных изолятов и к.б.н. М.В. Эйдельштейна и И.А.Эйдельштейн (НИИ антимикробной химиотерапии СГМА) за сотрудничество и помощь в работе.
