Введение к работе
Актуальность исследований. На территории России наиболее распространены карпатская, серая горная кавказская, среднерусская порода медоносной пчелы Apis mellifera и породный тип “Приокский”, выведенный в результате скрещивания пчел среднерусской и серой горной кавказской породы. Среднерусская порода относится к подвиду темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. (Авдеев Н.В. и др., 2008, Николенко А.Г., Поскряков А.В., 2002), характеризуется уникальным комплексом черт, включая зимостойкость и устойчивость к инфекциям, и служит исходным материалом при создании промышленных пород.
В отдельных регионах произошла гибридизация темной лесной пчелы A. m. mellifera L с южными породами, относящимися к подвидам A. m. carnica, A. m. liguistica и A. m. caucasica (Никоноров Ю.М. и др., 1998, Бородачев А.В., Савушкина Л.Н., 2007, Салтыкова Е.С. и др., 2007). Интрогрессия южных пород пчел в популяции среднерусской пчелы приводит к ухудшению производственных качеств и меньшей устойчивости к суровым природным условиям гибридных популяций пчел, а также к снижению иммунитета, что способствует распространению инфекционных заболеваний (Booth B., 2011) и к сокращению генетического разнообразия популяций пчел (Tencheva D. et al, 2004).
Для сохранения аборигенных пород пчел необходимо дополнительно к морфометрическому методу (Алпатов В.В., 1948, Бородачев А.В. и др., 2002) использовать современные методы анализа генетических ресурсов: анализ мтДНК (Николенко А.Г., Поскряков А.В., 2002, Schneider S.S. et al, 2005, Ильясов Р.А. и др., 2007) и микросателлитных локусов (Estoup A. et al, 2002, Непейвода С.Н. и др., 2011, Зиновьева Н.А. и др., 2011). В соответствии с Федеральным законом о племенном животноводстве и рекомендациями Комиссии по биологии пчелы и конгресса «APIMONDIA» (.) (2009г.) для изучения и сохранения аборигенных популяций животных и пчел следует применять микросателлитный анализ. В последнее время стали накапливаться данные о дифференциации отечественных популяций пчел с применением ДНК-маркеров (Зиновьева Н.А. и др. 2013, Ильясов Р.А. и др., 2008, Кривцов Н.И. и др., 2010), однако эти данные носят фрагментарный и неполный характер.
Для предотвращения сокращения численности популяций пчел вследствие распространения вирусных заболеваний необходима профилактика заражения клещом Varroa destructor, который служит переносчиком вирусов, и контроль за вирусными инфекциями при помощи ДНК-диагностики. В зарубежных популяциях пчел при помощи ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой) выявлен высокий уровень инфицированности РНК-содержащими вирусами: в одной семье могут быть одновременно выявлены до пяти-шести разных вирусов (Miranda J.R. et al, 2010). Для отечественных пород пчел данные об их инфицированности вирусами весьма малочисленны (Батуев Ю.М. и др., 2010).
Использование ДНК-маркеров является эффективным инструментом не только для диагностики вирусных инфекций, но и для определения принадлежности к конкретной породе. Применение молекулярных методов при разведении пчел и пчелиных маток и получении пчелопакетов промышленных пород является актуальным для сохранения их генетического разнообразия.
Цель и задачи исследований. Целью работы является изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и выявление инфицированности пчел РНК-содержащими вирусами при помощи молекулярно-генетических методов.
Для достижения цели определены следующие задачи исследования:
1. характеристика дифференциации отечественных популяций пчел с помощью морфометрического анализа;
2. характеристика генетической дифференциации отечественных пород пчел при помощи анализа вариабельности митохондриального генома;
3. характеристика генетической дифференциации пород, популяций и семей пчел при помощи микросателлитных маркеров ядерного генома;
5. анализ уровня инфицированности пчелиных семей РНК-содержащими вирусами методом ОТ-ПЦР;
6. структурный и филогенетический анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей обнаруженных РНК-содержащих вирусов пчел (DWV, SBV и BQCV).
Научная новизна
1. Впервые изучены отечественные популяции пчел одновременно по морфометрическим параметрам (по кубитальному индексу, с использованием цифровых технологий измерения) и по совокупности молекулярно-генетических маркеров. Охарактеризованы чистопородные популяции среднерусской, карпатской и серой горной кавказской пород. В некоторых популяциях среднерусской породы выявлено смешение с южными породами пчел.
2. У пчел среднерусской породы и в выборках пчел из смешанных популяций впервые обнаружено явление гетероплазмии с присутствием одновременно нескольких вариантов митотипов. Установлена дифференциация отечественных популяций пчел по межгенному локусу мтДНК с рестрикцией по сайту Dra I.
3. Впервые проведен комплексный анализ отечественных популяций пчел анализ по четырем микросателлитным локусам А24, А28, и А14 и А88 (по локусам А28 и А14 данные уникальны). Для карпатской породы охарактеризована дифференциация пчел по микросателлитным локусам на уровне отдельных семей.
4. Методом ОТ-ПЦР в условиях разведения отечественных пчел на пасеках выявлено инфицирование РНК-содержащими вирусами DWV, SBV, BQCV, KBV, CBPV и ABPV не только пчел, но и клещей (DWV, ABPV). Впервые показана множественная инфекция отечественных пчел несколькими вирусами. Нуклеотидные последовательности фрагментов вирусов DWV, SBV и BQCV, выделенных из отечественных пчел, получены, проанализированы и зарегистрированы в Genbank (GQ422786, JX993278, KC138854, KC138852, KC020673, KC020674, KC138853).
Практическая значимость работы
1. На основании полученных результатов с применением молекулярно-генетических маркеров возможно определение чистопородных популяций пчел и смешанных популяций пчел среднерусской породы с южными породами. Полученные результаты и использованные в работе методы анализа могут быть использованы при создании паспорта пород в качестве исходных данных для селекционных центров и генетического мониторинга процессов селекции.
2. Методы молекулярной диагностики являются эффективным инструментом для ежегодной выбраковки семей пчел, инфицированных вирусами, в рамках ветеринарных мероприятий с целью предотвращения дальнейшего распространения вирусных заболеваний и гибели популяций пчел.
3. Проведение анализа вариабельности длины межгенного локуса COI-COII мтДНК и микросателлитных локусов наряду с ДНК-диагностикой вирусных заболеваний пчел можно рекомендовать в качестве обязательных тестов при подготовке коммерческих пчелопакетов и маток на племенных предприятиях, а также при изучении отечественных популяций пчел с целью их сохранения.
Положения, выносимые на защиту:
1. Генетическая дифференциация отечественных пород и популяций пчел по микросателлитным локусам A24, А28, А88 и А14, длине межгенного локуса COI-COII мтДНК и вариантам сайта рестрикции Dra I межгенного локуса COI-COII мтДНК.
2. Различие чистопородных и смешанных популяций по длине межгенного локуса COI-COII мтДНК и кубитальному индексу.
3. Внутри- и межсемейная дифференциация пчел карпатской породы по микросателлитных локусам A24, А28, А88 и А14.
4. Гетероплазмия пчел с присутствием одновременно нескольких вариантов митотипов по длине межгенного локуса COI-COII мтДНК.
5. Наличие инфицированности отечественных популяций пчел РНК-содержащими вирусами DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV, наиболее частое распространение вируса DWV и SBV. Инфицированность пчелиных семей несколькими вирусами одновременно.
6. Наличие инфицирования клещей Varroa destructor РНК-содержащими вирусами пчел.
7. Степень идентичности нуклеотидных последовательностей РНК-содержащих вирусов пчел DWV, SBV и BQCV на территории России с ранее изученными нуклеотидными последовательностями этих вирусов, представленными в Genbank. Филогенетическое своеобразие нуклеотидной последовательности вируса деформации крыла.
Апробация работы. Результаты диссертации представлены на 11 профильных конференциях: «Актуальные проблемы инфекционной патологии и ветеринарной медицины» (Покров, 2009); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «65 лет академии пчеловодства» (Рыбное, Рязанской области, 2010); Международной конференции «Пчеловодство XXI век» (Москва, 2010); II Международном форуме “Медовый пир”, Международной научно-практической конференции «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии» (Ярославль, 2010); 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2011); Международной конференции «Проблемы популяционной и общей генетики» посвященная памятной дате 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова» (Москва, 2011); III Международном форуме пчеловодов «Медовый пир», Международной конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО» (Ярославль, 2012); Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии в рамках фестиваля науки» (Уфа, 2012); XXXXIII International Apicultural Congress «APIMONDIA» (Киев, Украина, 2013); 50 Naukowa konferenja pczelarska (Pulawy, Poland, 2013).
Публикация результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 22 научные работы: 8 статей в рецензируемых журналах (5 журналов (Вопросы вирусологии, Вестник РАСХН, Сельскохозяйственная биология, Пчеловодство, Вестник Башкирского государственного аграрного университета) включены в список ВАК Минобрнауки РФ для защиты диссертаций), 7 статей в научных сборниках и материалах конференций, 7 тезисов докладов.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 211 страницах, содержит 45 таблиц, 44 рисунка, 1 схему, 23 страницы приложений с иллюстрациями, 22 формулы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, практических предложений, выводов и списка литературы, который включает 278 источников, в том числе 193 иностранных источника.
