Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Сравнительный анализ дифференциально-окрашенных хромосом 13
1.2. Сравнительное картирование 14
1.3. Хромосомный пэйнтинг 17
1.3.1. Метод хромосомного сортинга 18
1.3.1.1. Проточная цитофлуориметрия 18
1.3.1.2. Устройство хромосомного сортера 19
1.3.1.3. Процедура сортировки 21
1.3.1.4. Проточный кариотип 22
1.3.2. Микродиссекция 24
1.3.3. Подготовка и использование библиотек для пэйнтинга 25
1.3.3.1. Амплификация сортированных хромосом 25
1.3.3.2. Мечение библиотек и детекция 26
1.3.3.3. Супрессионная гибридизация 26
1.3.3.4. Варианты гибиридизации 27
1.3.3.5. Детекция и программное обеспечение 29
1.3.3.6. Использование пэйнтинг-проб 30
1.3.4. Варианты постановки эксперимента по пэйнтингу 31
1.3.4.1. Применение хромосомного пэйнтинга 33
1.3.5. Пэйнтинг в эволюционных исследованиях 41
1.3.5.1. Явление консервативности хромосомных сегментов 41
1.3.5.2. Сгттенные ассоциации в геномах млекопитающих 43
1.3.5.3. Хромосомные перестройки как фшогенетические маркеры 45
1.3.5.4. Предковый кариотип 46
1.3.5.5. Темпы кариотипической эволюции в таксонах 47
1.3.6. Zoo-FISH млекопитающих 48
1.3.6.1. Парнокопытные 48
1.3.6.2. Непарнокопытные 49
1.3.6.3. Хищные 50
1.3.6.4. Рукокрылые 51
1.3.6.5. Насекомоядные 51
1.3.6.6. Зайцеобразные 52
1.3.6.7. Приматы 52
1.3.6.8. Грызуны 53
1.3.6.9. Afrotheria 53
1.3.610. Сумчатые 54
1.3.6.11. Птицы 55
1.3.6.12. Рептилии 55
1.3.7. Точки разрывов хромосом 56
1.3.8. Недостатки и перспективы метода Zoo-FISH 57
1.3.9. Область применения результатов исследований по сравнительной геномике 59
1.3.10. Вопрос о механизме хромосомных перестроек 61
1.4. Филогенетические отношения млекопитающих 62
1.4.1. Молекулярные филогенетические построения 62
1.4.2. Theria-гипотеза 63
1.4.3. Четыре группы отрядов плацентарных млекопитающих 63
1.4.4. Парафилетичные таксоны 66
-4-
1.4.5. Расхождение в построениях на основе разных данных 66
1.4.6. Молекулярные датировки 67
1.4.7. Филогении на видовом уровне 68
1.5. Филогенетические и кариотипические отношения хищных 68
1.5.1. Pinnipedia - семейство в отряде хищных 71
1.5.2. Проблема филогенетического положения большой и малой панды 72
1.5.3. Куницеобразные 74
1.5.4. Филогенетические отношения группы Feliformia 76
1.5.5. Кариотипические и филогенетические отношения Canidae 78
ГЛАВА 2. Материалы и методы 85
2.1.Материалы 85
2.1.1. Растворы и реактивы 85
2.1.2. Список видов, вовлеченных в исследование 86
2.2.Методы 88
2.2.1. Культура клеток и суспензии хромосом 88
2.2.1.1. Получение суспензии хромосом из костного мозга 88
2.2.1.2. Культура лейкоцитов периферической крови 89
2.2.1.3. Культуры фибробластов кожи илегкого 90
2.2.1.4. Хранение материала 91
2.2.1.5. Оценка качества суспензии хромосом 91
2.2.1.6. Приготовление препаратов 91
2.2.2. Дифференциальные окраски хромосом 92
2.2.2.1. Рутинная окраска хромосом 92
2.2.2.2. GTG-бэндинг 92
2.2.2.3. С-бэндинг 93
2.2.3. Пэйнтинг 93
2.2.3.1. Характеристика наборов сортированных хромосом 94
2.2.3.2. Гетерологичная гибридизация 100
2.2.3.3. Получение и обработка изображения 102
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 103
3.1. Кариотипическая эволюция в семействе собачьих сanidae 103
3.1.1. Описание кариотипа японской енотовидной собаки 106
3.1.2. Пэйнтинг хромосом енотовидной собаки 106
3.1.3. Интеграция с хромосомной картой собака-лисица-песец 109
3.1.4. Кариотипические и филогенетические отношения собачьих 112
3.1.4.1. Схема кариотипических отношений собачьих 115
3.1.4.2. Филогенетические отношения собачьих 115
3.1.4.3. Ветвь Canini 117
3.1.4.4. Ветвь Vulpini 118
3.1.4.5. Особенности эволюции кариотипов собачьих 119
3.1.5. Предковый кариотип собачьих 120
3.1.6. Высокий уровень реорганизации геномов собачьих 120
3.2. Кариотипическая эволюция в семействе куницеобразных (mustelidae) 124
3.2.1. Пэйнтинг куницеобразных 125
3.2.2. Идентификация внутрихромосомных перестроек в кариотипе американской норки... 130
3.2.3. Схема кариотипических взаимоотношений куницеобразных 135
3.2.4. Особенности кариотипической эволюции в различных таксонах Musteloidea 137
3.2.4.1. Lutrinae 137
3.2.4.2. Melinae 138
3.2.4.3. Mustelinae 138
3.2.4.4. Pinnipedia 140
3.2.4.5. Mephitidae 141
3.2.5. Заключение 142
3.3. Кариотипическая эволюция надсемействa FELOIDEA 143
3.3.1. Кариотип бурой гиены Hyaena brunnea 143
3.3.2. Кариотип гималайской циветы Paguma larvata 146
3.3.3. Многонаправленный пэйнтинг Feloidea 146
3.3.4. Сравнительный анализ кариотипов Feloidea 151
3.3.4.1. Сравнительная карта хромосом гиены и циветы 151
3.3.4.2. Идентификация инверсий с помощью проб собаки 153
3.3.4.3. Схема кариотипической эволюции Feliformia 153
3.4. Использование пэйнтинг-проб хромосом собаки для исследования
кариотипической эволюции 157
3.4.1. Участки консервативной синтении в геномах хищных 162
3.4.2. Идентификация инверсий с помощью пэйнтинг-проб хромосом собаки 162
3.4.3. Реконструкция порядка сегментов предковых хромосом хищных 164
Заключение 167
Выводы 170
Литература
- Подготовка и использование библиотек для пэйнтинга
- Культура клеток и суспензии хромосом
- Кариотипические и филогенетические отношения собачьих
- Сравнительный анализ кариотипов Feloidea
Подготовка и использование библиотек для пэйнтинга
В 2000 году было завершен проект «Геном человека» (Human Genome), в результате которого была получена информация о последовательности ДНК всего генома человека. Этот проект суммировал все молекулярные, биохимические и генетические методики, применяемые в физическом картировании. Впереди еще много работы по картированию геномов хозяйственно важных видов, таких как корова, свинья, домашних животных (кошка, собака). Картированию геномов других видов животных пока уделяется мало внимания из-за недостатка средств и ресурсов. Прогрессу в этой области может способствовать сравнительное картирование геномов многих видов животных, с использованием карт хромосом таких хорошо исследованных видов как человек и мышь.
В основе сравнительного картирования лежит факт, что гены, тесно сцепленные у одного вида, имеют тенденцию быть сцепленными и у других видов, образуя группы консервативной синтении (см. главу 1.З.5.1.).
Сравнительные карты необходимы, во-первых, в качестве источника для локализации генетических детерминант наследуемых признаков, поведения и фенотипов, во-вторых, как основа для разрешения и интерпретации эволюции геномов в прошлом.
Выделяют три типа последовательностей локализуемых при построении карт: маркеры типа I, типа II и типа III К первой группе относят кодирующие гены, которые являются низковариабельными и имеют высокую степень гомологии при межвидовых сравнениях. Ко второму типу относят гипервариабельные микросателлиты (так называемые короткие тандемные полиморфные повторы, short tandem repeat polymorphism STRP). Локусы типа II являются идеальными для построения родословных, однако уже на уровне семейства невозможно найти консервативные последовательности второго типа, и поэтому они бесполезны при межвидовых сравнительных построениях (O Brien et al. 1997, Graves 1998). Маркеры типа III - это общий биаллельный полиморфизм одиночных нуклеотидов (SNPs - single-nucleotide polymorphism) в пределах кодирующих районов, или чаще всего в некодирующих интронах или межгенных районах. Такие маркеры также полезны для родословных, семейных или популяционных внутривидовых исследований. Целью картирования является создание насыщенной упорядоченной карты хромосом, содержащей все три типа маркеров в количестве соответствующем их встречаемости в геноме.
Существует несколько основных методов создания генетических карт.
Во-первых, это методы радиационных гибридов (RH - radiation hybrid) и гибридов соматических клеток, в основе которых лежит получение панелей клеточных линий, содержащих случайные фрагменты хромосом исследуемого генома на фоне хромосом другого вида, с помощью радиоактивного облучения и слияния клеток. Насыщенные маркерами типа I и II карты были созданы таким образом для многих видов животных: человека, мыши, крысы, КРС, свиньи, кошки, собаки, курицы и рыбы данио рерио (O Brien et al. 1999). Картирование с помощью гибридов соматических клеток дает информацию только о синтении (SG- syntenic group), но не о порядке генов. Во-вторых, это локализация с помощью FISH фрагментов ДНК клонированных в искусственные бактериальные (ВАС), Р1-фаговые (РАС), дрожжевые (YAC) хромосомы, и их упорядочивание (создание контигов) (например, Haaf, Bray-Ward 1996). В-третьих, это метод генетического сцепления (так называемое рекомбинационное или мейотическое картирование, GL-genetic linkage) с помощью межвидовых гибридных бэккроссов или отдаленных внутривидовых скрещиваний. Метод позволяет создавать насыщенные мейотические карты сцепления, например, у мыши, кошки, КРС, оленя, овцы и свиньи (например, Slate et al. 2002; VandeBerg, Graves 1998). В-четвертых, это метод Zoo-FISH, который подробно рассмотрен ниже.
Однако, несмотря на то, что были получены первичные карты, насыщенные в основном маркерами второго типа, их ценность при межвидовых сравнениях была крайне низкой. Поэтому была специально для сравнительного картирования разработана система CATs (comparative anchor tagged sequences) - набор геноспецифичных пар праймеров для идентификации уникальных последовательностей в практически любом геноме млекопитающих. Праймеры были сконструированы на основе сравнительного анализа данных картирования геномов человека и мыши, путем выявления наиболее консервативных пар генов. Наработанные с помощью CATs гомологичные продукты из геномов разных млекопитающих могут быть картированы и служить реперными точками для поиска консервативных сегментов (Lyons et al. 1997).
Сравнительное картирование способствует быстрому и эффективному поиску генов-кандидатов, отвечающих за заболевания человека, у модельных лабораторных животных. Сравнительное картирование важных сельскохозяйственных животных уже -16 привело к описанию локусов, отвечающих за количественные признаки1 и за экономически важные признаки. Картирование геномов домашних животных имеет большое значение, так как для них описаны многие аналоги заболеваний человека и имеются родословные. К тому же анализ феномена большого числа пород собак и кошек, возможно, позволит найти объяснение пластичности морфологических признаков и их генетической основе. Картирование геномов других видов идет гораздо более медленными темпами, хотя его роль в понимании фундаментальных биологических процессов может быть велика. Например, сравнительное картирование генов половых хромосом у сумчатых и плацентарных проливает свет на происхождение полоопределяющих механизмов (Graves et al. 1998; Toder et a/.2000; Graves, Delbridge 2001). Даже при сравнительном картировании человека и рыб, человека и Drosophila удалось найти консервативные кластеры генов (Postlethwait et al. 1998; Trachtulec et al. 1997; Nadeau, Sankoff 1998).
Можно выделить несколько основных проблем, возникающих при сравнительном картировании. Во-первых, низкая насыщенность генами карт хромосом млекопитающих не позволяет идентифицировать все гомологичные сегменты (даже между геномами человека и мыши). Ошибки, возникающие при картировании генов, запутывают и затрудняют обнаружение консервативных сегментов. Во-вторых, мелкие инверсии, происходящие в геномах, после расхождения от общего предка уменьшают размер сегментов, консервативных для всего отряда и увеличивают их число. Таким образом, консервативные сегменты являются результатом процесса эволюции кариотипа и отражают определенные события: инверсии и транслокации, которые возникают с различной частотой и скоростью. При сравнительном картировании хромосом рыб, растений, амфибий возникают проблемы, связанные с полиплоидизацией геномов, которые сильно тормозят прогресс в этой области (Nadeau, Sankoff 1998).
Сравнительное картирование тем более успешно, чем более подробные карты хромосом созданы для большего количества видов. На сегодняшний день самые насыщенные карты хромосом созданы для человека и мыши, основной этап проекта "геном человека" уже завершен и сейчас идет работа над проектом "геном мыши". Быстрый прогресс наблюдается в картировании геномов таких видов как крыса, кошка, собака, корова, коза, овца, свинья, курица и рыба данио рерио
Культура клеток и суспензии хромосом
Метод микродиссекции основан на технологии вырезания (диссекции) интересующего участка цитологического препарата с помощью микроманипуляционной техники. Помимо диссекции с помощью стеклянной иглы, используют так же способ вырезания лазером (Monajembashi et al. 1986). Особенность метода микродиссекции состоит в том, что можно вырезать как целую хромосому, так и любой интересующий район. Диссектированный материал обрабатывают протеиназой К и амплифицируют. В результате получают район- и хромосомспецифичные библиотеки ДНК или, так называемые, микродиссекционные библиотеки (Scalenghe et al. 1981, Senger et al. 1990, Luedecke et al. 1989). Метод впервые был применен для получения зонда политенных хромосом Drosophila, метафазных хромосом мыши, и сейчас широко применяется в цитогенетике человека (Scalenghe et al. 1981, Rohme et al. 1984, Mueller-Navia et al. 1995, Рубцов и др., 2001).
Такие библиотеки являются незаменимыми при исследовании хромосомных аномалий, в частности при канцерогенезе или при выявлении тонких хромосомных перестроек. Именно с помощью микродиссекции были получены наборы зондов для многоцветной FISH и многоцветного бэндинга (Liehr et al. 2002).
Методика получения микродиссекционных пэйнтинг-проб имеет преимущество перед сортировкой хромосом в том, что с ее помощью можно легко и быстро получить районспецифичные библиотеки. Однако недостатком микродиссекционных библиотек является их низкая представительность для гетерологичной гибридизации. Это связано с тем, что получить высокое число копий желаемого района очень тяжело, и требует больших усилий. Поэтому их использование в эволюционных исследованиях ограничивается пределами рода (Raudsepp, Chowdhary 1999), отряда (Hassanane et al. 1998) или есть одиночные работы по использованию микродиссекционных библиотек для исследования эволюции хромосом между отрядами (Chaudhary et al. 1998; Rubtsov et al. 1997, 2000). Однако в данных работах, как правило, исследуется лишь эволюция одного района хромосомы, а не полного кариотипа.
В некоторых случаях применяется комбинированный подход к получению полного набора библиотек для хромосом данного вида. Так, например, пэйнтинг-пробы хромосом курицы были получены сочетанием методов сортинга (для выделения макрохромосом) и микродиссекции (для выделения микрохромосом) (Griffin et al. 1999).
Иногда используют другие методы получения пэйнтинг-проб, кроме микродиссекции и сортинга, однако широкого применения они не нашли. Например, зонды можно получить с помощью Inter-Alu-ПЦР с ДНК гибридов соматических клеток. Именно такие зонды использовали для изучения внутрихромосомных перестроек высших приматов (Muller et al. 1996, 1997).
Метод in situ гибридизации состоит в локализации последовательностей ДНК на цитологических препаратах (Gall, Pardue 1969). Такая гибридизация позволяет визуализировать определенные последовательности нуклеиновых кислот внутри отдельной клетки. Из сортированных и микродиссектированных хромосом получают зонды для флуоресцентной in situ гибридизации - FISH (Pinkel et al. 1988; Meltzer et al. 1992). ДНК хромосом размножают в ПЦР и метят флуоресцентными гаптенами. Выделяют следующие варианты гибридизации: гомологичная - когда зонд и ДНК на препарате, происходят от одного вида и гетерологичная, когда ДНК зонда и хромосом на препарате от разных видов. При гетерологичном варианте гибридизуются только консервативные последовательности гомологичные для обоих видов. В этом случае решающее значение имеет представительность библиотеки зонда.
На первых этапах развития метода хромосомного пэйнтинга для получения библиотек проводили трудоемкие стандартные процедуры клонирования в фагах. Однако качество полученных библиотек было довольно низким из-за плохого соотношения вставка-вектор. Вследствие низкой представительности библиотеки при гибридизации давали большой фон и слабый сигнал (Ried et al. 1998). Однако именно с такими библиотеками были осуществлены первые эксперименты по пэйнтингу (Wienberg et al. 1990; Jauch et al. 1992). Создание плазмидных библиотек несколько улучшило представительность зондов (Collins et al. 1991). Амплификация обогащенных библиотек с помощью линкер-адаптер ПЦР (linker-adaptor PCR) так же стала одной из попыток усовершенствования библиотек сортированных хромосом (Vooijs et al. 1993; Scherthan et al. 1994). Однако сейчас такие библиотеки практически не используются, так как появились очень быстрые и эффективные методы амплификации ДНК сортированных хромосом. 1.3.3.1. Амплификация сортированных хромосом
Амплификация с вырожденными праймерами позволяет нарабатывать высокопредставительные библиотеки, пригодные для отдаленной гетерологичной гибридизации. Количество хромосом, необходимое на сегодняшний день для получения хорошей библиотеки, составляет 300 - 500, для того, чтобы их собрать требуется около 2 часов сортировки. DOP-PCR позволяет нарабатывать хорошие микродиссекционные библиотеки, пригодные для гомологичной гибридизации всего из одной копии района или хромосомы. Другой способ амплификации с использованием неспецифических праймеров PARM-PCR (priming authorizing random mismatches PCR). В этом случае используется невырожденный праймер, например 5 -(GAG)7-3 , отжигающийся на сайты повторов глутаминовой кислоты, встречающиеся в кодирующих областях генов. Этот способ также позволяет эффективно нарабатывать высоко представительные библиотеки для разных видов млекопитающих (Milan et al. 1993, 1996; Guilly et al. 1999, 2001). Оба способа включают несколько первых циклов ПЦР в нестрогих условиях температуры отжига, что позволяет амплифицировать множественные локусы.
Появление нерадиоактивного мечения зондов привело к более широкому использованию сортированных хромосом и микродиссекционных библиотек. Были разработаны методы флуоресцентной in situ гибридизации, в которых мечение зонда достигалось за счет введения в ПЦР нуклеотидов, связанных с различными гаптенами (такими как биотин и дигоксигенин) или напрямую меченных флуорохромами (такими как, например, флуоресцеинизотиоционат). Их в свою очередь выявляют с помощью связанного с флуорохромом стрептоавидина или соответствующих антител. Эти усовершенствования значительно сократили время и затратность молекулярных процедур по сравнению с классическим методом изотопной in situ гибридизации (Pinkel et al. 1986; Ferguson-Smith et al. 1998).
Кариотипические и филогенетические отношения собачьих
В монофилетической ветви Feliformia выделяют три семейства: кошачьих, виверровых и гиеновых. Основные споры на сегодняшний день развернулись вокруг взаимоотношений внутри семейства виверровых.
Недавно было предложено на основе морфологических признаков выделить мангустов в отдельное семейство Herpestidae (Wozencraft 1989). Молекулярные филогении подтверждают такое деление нынешнего семейства виверровых на две ветви: мангустов и виверр (Bininda-Emonds et al. 1999). Взаимоотношения внутри нового семейства, в состав которого входит 30 видов мангустов, являются практически неисследованными в силу экзотических местообитаний его представителей. Так, совершенно неясно положение Dologale и Rhynogale внутри таксона мангустов. Только для двух подсемейств удалось подтвердить монофилию (Bininda-Emonds et al. 1999).
В составе виверровых существует два обособленных вида, филогенетическое положение которых позволяет предполагать парафилию всех Viverridae. Было показано, что фосса (Cryptoprocta ferox) является сестринской линией либо для мангустов, либо для всех виверр (Veron, Catzeflis 1993; Bininda-Emonds et al. 1999). Особое внимание уделяют монотипическому роду пальмовых цивет (Nandinia), который считают либо рано отделившимся от виверровых, либо даже примитивным кошачьим (Flynn , Nedbal 1998; Bininda-Emonds et al. 1999).
Радиация же самого семейства виверровых является достаточно древней, и три основных линии в нем выделились, возможно, еще до образования других семейств Feliformia.
В группе Feliformia не удалось до сих пор установить взаимоотношения между четырьмя основными ветвями: гиеновыми, кошачьими, виверровыми и мангустами (Flynn, Nedbal 1998). Есть несколько основных версий, которые имеют как морфологическое, так и молекулярное подтверждение. Во-первых, что существуют родственные отношения между гиеновыми и кошачьими (Wozencraft 1989; Wyss, Flynn 1993; Flynn, Nedbal 1998; Bininda-Emonds et al. 1999), во-вторых, что имеются сестринские отношения между гиеновыми и мангустами (Hunt 1987; Veron 1995; Veron, Catzeflis 1993; Flynn, Nedbal 1998), и в-третьих, что таксоны виверр и мангустов являются близкими (Wayne et al 1989; Flynn 1996; Bininda-Emonds et al. 1999). При исследовании ископаемых было показано, что гиеновые и кошачьи разделяют много признаков, которые ранее считались синапоморфными, но не были обнаружены у ископаемых гиеновых и теперь должны быть признаны конвергентными (Flynn, Nedbal 1998). Таким образом, остаются совершенно неясными отношения между такими крупными таксонами как семейства ветви Feliformia.
Филогенетические взаимоотношения внутри семейства кошачьих тщательно исследованы группой О Брайена с помощью различных методов (цитогенетики, сравнительной морфологии, филогении на основе сравнения белковых иммунологических дистанций, аллозимов, 2-мерного белкового электрофореза, митохондриальной ДНК, ядерных генов) (обзор у Jonson, O Brien 1997). В семействе выделяют 3 основных линии: линия оцелота (южно- и центральноамериканские кошки), линия пантер (большие кошки) и линия домашних кошек. Кроме того, имеется несколько видов, положение которых на древе кошачьих до сих пор является спорным (в различных филогениях это - Prionailurus rubiginosa, Leptailurus serval, Otocolobus manul, Pardofelis marmorata). Продолжаются споры о полифилии некоторых родов, связанные с тем, что систематики смитсоновского института выделяют 18 родов в семействе кошачьих (http://nmnhwww.si.edu/cgi-bin/wdb/msw/). Соколов же выделяет всего 4 рода (Соколов 1979). Гепард (Acinonyx jubatus) является сестринским таксоном по отношению ко всем кошачьим. Таким образом, несмотря на всеобъемлющее исследование, проведенное на настоящий момент, остается еще много нерешенных вопросов систематики и филогении кошачьих, связанных в основном с отсутствием надежных филогенетических маркеров для достоверных филогенетических построений.
Кариотпы Feloidea Кариотипические исследования представителей ветви Feliformia являют крайне неполными. Наиболее хорошо исследованы представители семейства кошачьих. Практически для всех видов семейства кошачьих описаны кариотипы с помощью рутинной окраски и наиболее информативного метода G-бэндинга (обзор на www.bionet.nsc.ru/chromosomes). Проведенный сравнительный анализ дифференциальной исчерченности хромосом позволил разделить кошачьих по крайней мере на три группы: линию оцелота (6 видов) - у всех видов 2п=36 и в кариотипе присутствует метацентрическая хромосома СЗ, линию домашних кошек (8 видов), кариотипы которых практически одинаковы, характеризуются 2п=38 и отсутствием СЗ хромосомы, и линию пантер или больших кошек (10 видов), которые имеют одинаковый кариотип. Кариотипы остальных кошачьих так же характеризуются 2п=38, однако имеют некоторые отличия от вышеперечисленных (Wurster-Hill 1973; Wurster-Hill, Gray 1973, 1975; Wurster-Hill 1974; Wurster-Hill, Centerwall 1982). Подробное древо кошачьих приведено у Janczewski et al. 1995 и Bininda-Emonds et al. 1999.
Кариотипы 4 видов семейства гиеновых описаны. Все гиены имеют 2п=40. Для 2 видов получен G-бэндинг (Wurster-Hill 1973; Wurster-Hill, Centerwall 1982; Berube-Genest et al 1987). He описаны с помощью дифференциальных окрасок лишь кариотипы земляного волка и бурой гиены.
Что касается семейства виверровых, то цитогенетическое описание кариотипа имеется лишь для 32 видов из 71, из них всего 15 были исследованы с помощью G-бэндинга (Fredga, Mandahl 1973; Pathak, Stock 1976; Sen, Sharma 1979; Couturier et al. 1986; Wurster-Hill 1973; Wurster-Hill, Gray 1975; Wurster-Hill, Centerwall 1982). Отсутствие даже описания кариотипов объясняется экзотическим местообитанием и недоступностью большинства видов виверровых.
Кариотипические и филогенетические отношения Canidae Многие авторы филогении делят собачьих на две крупные группы Canini -«волкоподобных» собачьих ("wolf-like canids") и Vulpini «лисицеподобных» собачьих ("fox-like canids") (Bininda-Emonds et al. 1999). Вейн с соавторами предлагают выделить еще и группу южно-американских собачьих (Wayne, Ostrander 1999; Wayne 1993; Wayne et al. 1989). Остаются не определенными ни в какую группу несколько родов: енотовидных собак (Nyctereutes), серых лисиц (Urocyon), и болыпеухих лисиц (Otocyon), иногда к ним еще присоединяют кустарниковую собаку (Speotus venaticus) и гривистого волка (Chrysocyon brachiurus) (Bininda-Emonds et al. 1999; Wayne, Ostrander 1999). Ha молекулярных филогениях эти виды собачьих занимают базальное положение и часто могут быть отнесены к любой из групп (рис. 4).
Сравнительный анализ кариотипов Feloidea
Предковый кариотип мустелид АМК сохранили также виды рода Martes, за исключением харзы (Martes flavigula). Исследованный нами кариотип японского соболя. (Martes melampus) идентичен хромосомным наборам соболя (Martes zibellina), лесной куницы (Martes Martes) и каменной куницы Martes foina (Графодатский и др. 1982а, в, 1977а, 1989; Nie et al. 2002). Кариотип каменной куницы отличается от двух других наличием добавочного плеча гетерохроматина на одной из хромосом (Графодатский и др. 1982в; Nie et al. 2002). В кариотипе харзы (Martes flavigula) пэйнтинг обнаружил разделение предковой хромосомы 5 (Nie et al. 2002). Интересно, что точно такое же разделение имеется и в кариотипе росомахи (Gulo gulo), наряду с разделением 13-й хромосомы (Графодатский и др. 1989). Возможно, разделение 5p-q, встречающееся в кариотипах харзы и росомахи, является конвергентным событием. Однако более вероятно, что это общая перестройка, так как при построении молекулярных филогенетических деревьев роды Gulo и Martes располагают как сестринские линии (Bininda-Emonds et al. 1999; Dragoo, Honneycutt 1997). Недавно появилось сообщение о том, что при филогенетических построениях на основе молекулярных данных род Martes является парафилетичным из-за Gulo gulo (Stone, Cook 2002). Если это так, то родовой статус росомахи требует пересмотра.
MUSTELA
В состав рода ласок и хорьков Mustela включают 13 видов, хромосомные числа которых варьируют от 2п=30 у американской норки до 2п=44 у солонгоя и горностая. К линии Mustela ведут два повторных разделения предковых хромосом мустелид 10-18 и 8-15, формируя 42-хромосомный предковый кариотип. Его можно считать предковым для всего рода, если не брать в расчет, что все виды, кроме американской норки, объединены еще одним разделением предковой хромосомы 2p-2q.
Именно такой кариотип, характеризующийся 2п=44, у горностая (M.erminea), и его было предложено считать предковым для всего рода (Графодатский и др. 1976, 1989). Сходным кариотипом обладает солонгой (M.altaica), отличие которого в наличии добавочных гетерохроматических блоков на 9 парах аутосом. Кариотип ласки (М.nivalis) характеризуют одно центрическое слияние предковых хромосом 11+18 и добавочные плечи гетерохроматина на 7 парах.
Следующая ветвь ведет к кариотипам норок, хорьков и колонков. Три центрических слияния формируют 38-хромосомный набор европейской норки
- 140 (M.lutreola). Идентичны ему по рисунку G-полос и количеству хромосом кариотипы колонка (M.sibirica) и итатси (M.itatsi) (Графодатский и др. 1979, 1989). Однако в кариотипе последнего имеются гетерохроматические плечи на 4 парах и крупный теломерный блок на р-плече одной метацентрической хромосомы (Графодатский и др. 1979). Гетерохроматических плечи на 4 парах аутосом отличают кариотипы двух видов хорьков - светлого M.eversmanni и черного M.putorius от такового европейской норки (Графодатский и др. 19856). Разделение 2q-12 у черного хорька (2п=40) является обратной перестройкой по отношению к 2q+12, имевшей место при формировании данной ветви.
Пожалуй, самым интересным событием в кариотипической эволюции рода Mustela является формирование кариотипа американской норки за счет 6 слияний предковых хромосом (15+16, 12+19, 8+13, 9+18, 10+14, 3+4), обособленного от остальных отсутствием разделения 2p-2q. Ее хромосомы характеризуются также наличием больших центромерных блоков гетерохроматина (Графодатский и др. 1977а).
Таким образом, пэйнтинг подтверждает выделение в роде Mustela трех групп по различиям в кариотипе: 1 - горностай, ласка, солонгой; 2 - европейская норка, колонки и хорьки; и 3 - американская норка (Графодатский и др. 1989). Графодатский с соавторами предложили присвоить этим группам родовой статус, или, по крайней мере, выделить из рода американскую норку из-за значительных различий в структуре кариотипов (Графодатский и др. 1989).
Помимо центрических и тандемных слияний/разделений хромосом в ходе эволюции кариотипов мустелид происходили также и перицентрические инверсии или, по крайней мере, изменения положения центромеры, которые невозможно идентифицировать с помощью крупных пэйнтинг-проб хромосом американской норки, но которые выявляются с помощью проб домашней собаки (см. главу 3.4.2.).
Две самые объемные по количеству исследованных видов молекулярные филогении по-разному описывают отделение таксонов от древа хищных в ходе эволюции (Dragoo, Honeycutt 1997; Bininda-Emonds et al. 1999). Наши данные дают основание полагать, что первой от ветви мустелид выделилась линия, ведущая к американской норке, что совпадает со вторым филогенетическим построением.
Вопрос о систематическом положении ластоногих долгое время оставался одним из спорных вопросов таксономии хищных. Сейчас уже не вызывает сомнений принадлежность Pinnipedia к отряду хищных. Однако до конца не ясно, к какому из семейств ближе ластоногие: к медвежьим (Wyss, Flynn 1993) или к куницеобразным (Arnason, Widegren 1986; Ledje, Arnason 1996b). Последние авторы считают, что ластоногие близки к группе Musteloidea (включает куньих, енотовых и малую панду) (Ledje, Arnason 1996b).
Фрёнике с соавторами локализовали пэйнтинг-пробы хромосом человека на метафазных хромосомах обыкновенного тюленя, Phoca vitulina (Fronicke et al. 1997). В их исследовании не были обнаружены такие характерные для хищных ассоциации сегментов хромосом человека, как 22/12 и 7/16 на хромосомах тюленя т7 и тЗ. Однако малый размер сегментов хромосом 12 и 7 позволяет допустить, что они были пропущены, и более тщательный анализ может их выявить. Сравнение результатов пэйнтинга показывает, что в кариотипе тюленя имеются два слияния хромосом АСК (8+15 и 10+18), характеризующие ветвь Musteloidea. Такие же слияния характерны для кариотипа малой панды (Nie et al. 2002). К сожалению, семейство енотовых пока не затронуто исследованиями сравнительного пэйнтинга. Однако, учитывая родство енотовых, куньих и малой панды, можно ожидать, что и в их кариотипах будут обнаружены эти два слияния. И тогда гипотеза Ледже и Арнасона о том, что ластоногие из всех Caniformia ближе всего к линии Musteloidea (Mustelidae, Procyonidae, Ailurus), будет подтверждена данными кариологии. Таким образом, на основании данных сравнительного хромосомного пэйнтинга получается, что ластоногие, малая панда, куньи и, возможно, енотовые являются сестринскими группами и объединены наличием двух общих маркерных слияний в их кариотипах (8+15 и 10+18).
Сейчас широко обсуждается вопрос о положении скунсов в составе семейства Mustelidae (см. главу 1.5.З.). На основании молекулярных данных предложено выделить их в отдельное семейство. Кариотипы скунсов практически не изучены, но их анализ также дает основание предполагать обособленное положение по отношению к Musteloidea (Wurster, Benirschke 1968; Lee, Modi 1983; Графодатский и др. 1989). Так как сравнительный анализ кариотипов скунсов и других куницеобразных не дал положительного результата, то предполагают, что основными событиями в эволюции их кариотипов были многочисленные слияния-разделения предковых элементов хромосом, перицентрические инверсии и вариации количества гетерохроматина (Графодатский и др. 1989; Wurster, Benirschke 1968). Возможно, что скунсы, наряду с 3.2.5. Заключение
Итак, после проведения сравнительного хромосомного пэйнтинга и сравнительного анализа дифференциально-исчерченных хромосом с привлечением литературных данных, можно кратко охарактеризовать основные события кариотипической эволюции семейства Mustelidae.
1. Хромосомные наборы мустелид отличаются высоким консерватизмом. Основными механизмами кариотипической эволюции были немногочисленные центрические слияния-разделения элементов предкового кариотипа и приобретение крупных блоков гетерохроматина (в виде целых плеч, центромерных и теломерных блоков).
2. Предковый кариотип мустелид состоял из 38 хромосом. Такой кариотип обнаружен в разных линиях мустелид: у выдр (L.lutra), барсуков (M.moschata), соболей {M.martes, M.zibellina, M.melampus, M.foind), перевязки (V.peregusna) и зориллы (Ictonyx striatus).
3. К формированию кариотипов остальных мустелид привели два повторных разделения предковых хромосом 10-18 и 8-15.
4. Отряд ластоногих Pinnipedia и малая панда Ailurus fulgens имеют в составе кариотипов маркерные слияния предковых хромосом хищных 10+18 и 8+15. позволяющие рассматривать их как ближайших родственников Mustelidae.
5. Кариотипы скунсов не удалось сравнить по рисунку окраски, и их хромосомные числа сильно отличаются от остальных мустелид. Филогенетическое положение Mephitinae вызывает сильные споры. Исследование как можно большего числа видов скунсов с помощью пэйнтинга представляется самой актуальной задачей.
6. Исследование кариотипов представителей семейства енотовых и монотипического подсемейства медоедов является одной из первостепенных задач для сравнительного хромосомного пэйнтинга Musteloidea.
В соответствии с филогенетическими построениями, основанными на морфологических, молекулярных и других критериях, в отряде хищных выделяют две монофилетические ветви: Feliformia и Caniformia (Flynn, Nedbal 1998; Bininda-Emonds et al. 1999). Данным группам соответствуют три надсемейства: Feloidea (кошки, мангусты, виверры, гиены), Canoidea (собаки) и Arctoidea (медведи, еноты, куницы, ластоногие), выделенные Симпсоном (Sympson 1945) (см. рис. 3). Ветвь Feliformia включает три семейства: кошачьих Felidae, гиеновых Hayenidae и виверровых Viverridae.
В то время как, кариотипические отношения в ветви Caniformia все более проясняются благодаря многочисленным филогенетическим исследованиям, в том числе методом хромосомного пэйнтинга, ни один представитель семейств виверровых и гиеновых еще не был включен в исследование по сравнительному пэйнтингу. Молекулярные филогении же пока затрудняются разрешить вопрос о взаимоотношениях семейств Feloidea.
Цель этой части работы заключалась в исследовании кариотипических взаимоотношений между представителями основных семейств Feloidea с помощью метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. Конкретная задача состояла в локализации пэйнтинг-проб хромосом человека, американской норки и домашней собаки на хромосомах представителей семейств виверровых и гиеновых. Вторая задача состояла в интеграции результатов с опубликованными данными по сравнительному хромосомному пэйнтингу кошки, как представителя семейства кошачьих.
