Введение к работе
Актуальность работы. Для исследования молекул ДНК существует мощный арсенал методов, позволяющих характеризовать как их физико-химические, так и молекулярно-генетические свойства. Современные тенденции использования ДНК в нано- и биотехнологиях ставят задачу разработки новых методов анализа молекул ДНК на основе развивающейся приборной базы. К таким методам, позволившим получить новые знания о молекулах ДНК, относятся в частности атомно-силовая микроскопия и манипулирование единичными молекулами ДНК с помощью лазерного пинцета [Conwell С.С., et al., 2003, Terao К, et al., 2008, Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S., 2009]. Настоящая работа посвящена разработке метода десорбции молекул ДНК с твердых подложек и из жидкой фазы с помощью терагерцового излучения. Перевод ДНК в газовую фазу позволит расширить спектр методов анализа этого биополимера. С молекулами и молекулярными ионами в газовой фазе оперируют методы масс-спектрометрии, спектроскопии, физики аэрозоллей, нанотехнологии. Масс-спектрометрия для анализа ДНК используется значительно меньше, чем для анализа белков, как раз в силу сложности получения молекулярных ионов ДНК в газовой фазе. Использование терагерцового излучения для десорбции ДНК позволит переводить в газовую фазу достаточно большие фрагменты, что расширит возможности масс-спектрометрии ДНК.
Одним из самых мощных источников терагерцового излучения является Новосибирский лазер на свободных электронах (ЛСЭ) [Gavrilov N.G. et al., 2007, Shon W.-Y. et al., 2008]. Характеристики Новосибирского ЛСЭ позволяют проводить уникальные эксперименты по применению терагерцового излучения в научных исследованиях, в том числе и для перевода в газовую фазу и получения молекулярных ионов ДНК.
Цель и задачи работы. Цель данной работы заключалась в разработке метода перевода в газовую фазу двухцепочечных молекул ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более) и одноцепочечных молекул ДНК, гибридизованных с олигопуклеотидамії на поверхности модельного биочипа, без иарушения их первичной структуры под действием терагерцового излучения для молекулярио-генетического анализа и экспериментов с ДНК в газовой фазе.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- модернизировать рабочую станцию («Станция физико-химических и биологических исследований воздействия терагерцового излучения на вещества») на Новосибирском лазере на свободных электронах для работы с молекулярно-генетическими объектами,
1 f ^
подобрать параметры излучения и разработать методы пробоподготовки молекул ДНК для перевода в газовую фазу;
с помощью терагерцового излучения перевести в газовую фазу молекулы ДНК плазмиды pUC18, изучить их биологические свойства стандартными методами молекулярной биологии, проверить способность к передаче наследственной информации;
провести десорбцию ДНК с помощью терагерцового излучения, измерить с помощью диффузионного спектрометра аэрозолей размеры частиц, образуемых молекулами ДНК фагов Т7 и X, плазмиды pUC18, а также фрагментами ДНК фага X., полученными при гидролизе ферментами Hindlll и ДюТП, провести анализ состава десорбированного материала с помощью атомно-силовой микроскопии;
разработать модель ячейки биочипа на кремниевой основе, изучить возможность десорбции целевой ДНК с модельного биочипа с помощью терагерцового излучения.
Научная новизна работы. Впервые для исследования ДНК использовано терагерцовое излучение лазера на свободных электронах. Проведённое исследование доказывает сохранение способности к передаче наследственной информации, структуры и молекулярно-генетических свойств ДНК после перевода их в газовую фазу с помощью разработанного метода. Впервые показана возможность применения метода для десорбции одноцепочечной целевой ДНК, гибридизованной на модели биочипа. Под действием терагерцового излучения впервые осуществлен перевод различных макромолекул ДНК в газовую фазу, в том числе ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более). На примере плазмиды pUC18 показано сохранение структуры и молекулярно-генетических свойств ДНК, в том числе способности к трансформации клеток Е. coli и репликации своего генома. Таким образом, доказан неразрушающий характер процесса десорбции ДНК с твердых подложек под действием терагерцового излучения с длиной волны 130 мкм, показана применимость метода для десорбции одноцепочечной целевой ДНК, гибридизованной на модели биочипа.
Впервые проведены измерения размеров частиц, образуемых молекулами ДНК в газовой фазе. Установлена зависимость размеров частиц ДНК в газовой фазе от длины взятой ДНК. В диапазоне длин от 6 500 п.н. до 40 000 п.н. получено соответствие размеров частиц ДНК размерам, полученным с помощью теоретического моделирования процесса конденсации и формирования глобулы ДНК [Хохлов А.Р., Кучанов СИ., 2000, Флори П.Д„ 1971, Тейф В.Б., Ландо Д. Ю., 2001].
Перевод ДНК с помощью терагерцового излучения в газовую фазу назван методом мягкой неразрушающей абляции. Метод разработан коллективом сотрудников институтов СО РАН, в числе которых состоял и автор диссертации [Петров А.К. и др., 2005]. Открытие явления мягкой неразрушающей абляции признано достижением РАН за 2006 г.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработан метод перевода молекул ДНК в газовую фазу с помощью терагерцового излучения с длиной волны 130 мкм без изменения их первичной структуры с сохранением способности передавать наследственную информацию. Метод применим для получения в газовой фазе ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более), в виде, пригодном для молекулярно-генетических исследований, в частности масс-спектрометрии ДНК и анализа целевой ДНК, гибридизованной на биочипах.
-
Линейные молекулы ДНК в газовой фазе образуют частицы глобулярной формы, причем размеры структур зависят от длины цепи ДНК.
Практическая и теоретическая значимость. Разработан метод, позволяющий переводить в газовую фазу рекордно большие молекулы ДНК, вплоть до генома фага X. (48 500 п.н.), что открывает широкие возможности для определения размеров и масс ДНК. Созданный в результате работы способ десорбции молекул ДНК может быть использован как для разработки методов масс-спектрометрического анализа генетических макромолекул, так и для применения стандартных методов анализа в газовой фазе к исследованию ДНК.
Разработанные в диссертации теоретические и методические положения, могут найти применение в исследовании фундаментальных свойств генетических макромолекул -энергетики взаимодействий ДНК-ДНК, ДНК-РНК, ДНК-белок и РНК-белок. Исследование конформационных состояний генетических макромолекул в газовой фазе позволит расширить знания о закономерностях компактизации ДНК в естественных и искусственных условиях.
На основании проведенных исследований, разработаны методические основы анализа целевых ДНК биочипов с помощью метода мягкой неразрушающей абляции. Такая задача представляет интерес с точки зрения совершенствования технологии производства биочипов. В последние годы лавинообразно возросло количество исследований с использованием методов ДНК-биочипов. Однако, сходимость профилей экспрессии, получаемых с использованием биочипов одной направленности различных ведущих мировых производителей, составляет менее 30%. Принципиальная возможность изучать непосредственно результаты гибридизации зондов и мишеней позволила бы получать
достоверную информацию о продуктах гибридизации независимым способом. На основе явления мягкой неразрушающей абляции был разработан метод разрушения под действием терагерцовым излучением ДНК-ДНК гибридов на модельной ячейке биочипа и сбора целевой ДНК для последующего анализа.
Апробация работы. Результаты работы использованы и опубликованы в отчете по государственному контракту «Диагностика ДНК-биочипов при помощи терагерцового излучения» от 27 февраля 2007 г. № 02.512.11.2068.
Материалы диссертации были представлены и обсуждались на российских и международных конференциях, в том числе: 2nd International THz-Bio Workshop 2011, Seoul, Korea, Topical problems of biophotonics, Нижний Новгород, 2009, «Химическая биология -Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» Новосибирск, 2009, XVII International Synchrotron Radiation Conference "SR-2008", Новосибирск, 2008, BGRS 2008, Novosibirsk, 2008, 29th International free electron laser conference: FEL-2007, Novosibirsk, 2007, IRMMW-THz 2005, Williamsburg, Virginia, USA, 2005.
Публикации. По теме диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах списка ВАК. Более десяти работ опубликовано в тезисах российских и международных конференций, получен патент РФ.
Вклад автора в исследование проблемы. Автор принимал участие, как в планировании экспериментов, так и в их проведении. Большая часть экспериментальной работы въшолнена лично автором. Исследования проводились на базе лазера на свободных электронах (ЛСЭ) терагерцового диапазона, разработанного и созданного в ИЯФ СО РАН [Gavrilov N.G. et al., 2007]. Для проведения экспериментов была оборудована «Станции исследований химико-физических и биологических свойств продуктов воздействия терагерцового излучения на вещества» в Сибирском центре синхротронного и терагерцового излучения СО РАН. Автор принимал непосредственное участие в планировании станции и её оснащении.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (первая глава), описания приборной базы, материалов и методов (вторая глава), двух глав, содержащих результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 6 таблиц, 46 рисунков и 200 литературных источников.
Благодарности. Автор выражает благодарность сотрудникам ИЯФ СО РАН и ИХКиГ СО РАН: коллективу операторов ЛСЭ и лично В.М.Попику и М.А.Щеглову за организацию
пользовательских станций, настройку параметров и поддержание режимов работы ЛСЭ. В.В.Кубареву, А.С.Козлову и Е.Н.Чеснокову за проведение измерений на фурье-спектрометре. СБ. Малышкину и А. Уницыну за помощь в измерении размеров аэрозольных частиц. Сотрудникам ИЦиГ СО РАН: СИ. Байбородипу за помощь в проведении электронной микроскопии, Т.Н. Кузнецовой за изготовление модельного биочипа, коллективу лаборатории молекулярных биотехнологий за помощь и поддержку.
